. 5cm的打孔器截取0. 2cm2的菌種塊3塊接入250mL三角 瓶中，液體種子培養(yǎng)基裝液量為lOOmL，于25°C恒溫培養(yǎng)2天，然后放入恒溫?fù)u床中，25°C、 100r/min振蕩培養(yǎng)3天得液體種子；
[0023] 3)將液體種子以10%的接種量接種于50〇1^搖瓶中，搖瓶培養(yǎng)基裝液量25〇11^，于 25°C、150r/min振蕩恒溫培養(yǎng)4天得搖瓶種子；
[0024] 4)將搖瓶種子以10 %的接種量接種于5L種子罐中，種子罐培養(yǎng)基裝液量3L，于 25°C、通氣量4L/min條件下恒溫培養(yǎng)4天得種子罐種子；
[0025] 5)首先將種子罐種子以8%接種量接種于30L發(fā)酵罐，發(fā)酵罐培養(yǎng)基裝液量15L， 于30-32°C、通氣量3-5L/min恒溫發(fā)酵12-24h，然后以0. 3-0. 5°C /min的速率降溫至 18-22°C，向發(fā)酵罐中加入10_12g包被殼聚糖和900mL種子罐種子，在通氣量6-8L/min條 件下恒溫發(fā)酵l〇_16h，最后以0. 2-0. 4°C /min的速率升溫至24-26°C，在通氣量5-7L/min 條件下恒溫發(fā)酵45-52h即得高密度液體菌種；
[0026] 所述杏鮑菇斜面菌種為市購杏鮑菇純化菌株；
[0027] 所述平板培養(yǎng)基組成為：馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，磷酸二氫鉀 3g/L，硫酸鎂 I. 5g/L，瓊脂 20g/L，VB10.0 2g/L，余量為水，pH 值 6. 0 ;
[0028] 優(yōu)選地，所述包被殼聚糖的制備方法，包括如下步驟：取殼聚糖加入其質(zhì)量 30-50%的質(zhì)量百分比濃度為13-15%的α -環(huán)狀糊精水溶液中，制成軟材，用10-20目篩制 粒，得濕顆粒，置微波干燥機(jī)中于功率2000W、60-80°C干燥4-6min，用10-20目篩快速整粒 即得包被殼聚糖。
[0029] 本發(fā)明液體菌種主要質(zhì)量指標(biāo)的檢測(cè)方法：
[0030] 菌絲球干重的測(cè)定
[0031] 取50ml發(fā)酵液用80目的篩網(wǎng)進(jìn)行過濾，收集菌球，用清水進(jìn)行反復(fù)沖洗，而后置 于恒溫烘干箱中80°C烘干4小時(shí)后稱重，并每隔半小時(shí)稱量一次，直至兩次稱量差不超過 2mg，即為恒重。最后計(jì)算菌絲干重的平均值。
[0032] 菌絲球密度的測(cè)定
[0033] 用移液管取發(fā)酵液Iml于培養(yǎng)皿中，對(duì)菌球數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)，重復(fù)記數(shù)三次，最后計(jì) 算菌球密度的平均值。
[0034] 菌絲球直徑的測(cè)定
[0035] 用移液管取發(fā)酵液1ml，用鑷子取10個(gè)菌球排成一長列，測(cè)量總長度，然后求平均 值，重復(fù)測(cè)量三次，計(jì)算菌球直徑的平均值。
[0036] 菌絲球回接平板萌發(fā)時(shí)間的測(cè)定
[0037] 從發(fā)酵罐培養(yǎng)基的培養(yǎng)液中取一個(gè)菌球置于PDA培養(yǎng)基平板中央，每一種發(fā)酵罐 培養(yǎng)基做三個(gè)重復(fù)，將放有菌球的PDA平板置于培養(yǎng)箱中25°C進(jìn)行培養(yǎng)，每隔1小時(shí)觀察 一次，等到觀察到有一組菌球萌發(fā)后，改為每0. 5小時(shí)觀測(cè)一次，并記錄各實(shí)驗(yàn)組的萌發(fā)時(shí) 間，最后計(jì)算每一種發(fā)酵罐培養(yǎng)基中菌球回接平板后萌發(fā)時(shí)間的平均值。
[0038] 胞外多糖含量的測(cè)定
[0039] 取發(fā)酵液50ml，抽濾，取上清液，加入兩倍體積的工業(yè)酒精，沉淀多糖過夜，然后 3600r/min離心10分鐘，收集多糖，置于40°C下烘干，2小時(shí)后稱重之后每隔半小時(shí)稱量一 次，直至兩次稱量差不超過2mg，即為恒重。
[0040] 有益效果：
[0041] 本發(fā)明根據(jù)杏鮑菇原菌株的特性，在液體種子、搖瓶種子、種子罐種子及發(fā)酵罐液 體菌種各階段培養(yǎng)基中自少至多科學(xué)復(fù)配可提高菌種抗冷、熱應(yīng)激性、免疫性和抗菌性的 中草藥提取物，同時(shí)科學(xué)復(fù)配了既具有原料適應(yīng)性，又具有消泡劑功能的木肩粉，通過逐級(jí) 馴化、復(fù)壯擴(kuò)大培養(yǎng)，增強(qiáng)了杏鮑菇菌種抗高溫及低溫應(yīng)激能力，提高了產(chǎn)多種降解酶的能 力，激發(fā)了其增殖能力和增殖密度，縮短了萌發(fā)時(shí)間，提高了菌絲及胞外多糖的產(chǎn)量，提高 了菌株對(duì)發(fā)酵環(huán)境及后續(xù)栽培環(huán)境的適應(yīng)性，同時(shí)采用追加接種和分段變溫發(fā)酵的方式， 縮短了菌種菌齡及增殖代數(shù)差距，適時(shí)流加包被后的具有增稠性、相溶性、穩(wěn)定性、吸附性 和抑菌性等特殊功能的殼聚糖調(diào)整發(fā)酵罐培養(yǎng)基的粘度及穩(wěn)定性，提高了菌絲球在發(fā)酵液 中分布的均一性和溶氧程度，并且打破了傳統(tǒng)發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法，對(duì)其中的黃豆餅粉 進(jìn)一步生物酶解，縮短了發(fā)酵周期，培養(yǎng)出一種發(fā)酵菌絲粗壯、活性高、菌絲球直徑小、密 度大、分布均勻的杏鮑菇液體菌種，其菌絲球密度為4. 5-5. 5 X IO5個(gè)/L，菌絲球直徑為 0. 5-0. 7mm，菌絲球干重為90-100g/L，萌發(fā)時(shí)間為4-5h，胞外多糖為3. 0-3. 5g/L。全面提 高了杏鮑菇液體菌種的質(zhì)量和產(chǎn)量，降低了生產(chǎn)成本，為杏鮑菇的高質(zhì)量、高產(chǎn)量和規(guī)?；?栽培奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，經(jīng)栽培試驗(yàn)表明：本發(fā)明制備的杏鮑菇液體菌種健壯、活力高，生 長速度快，菌絲產(chǎn)量和質(zhì)量高，抗雜菌能力強(qiáng)，保質(zhì)期長，與市售液體菌種相比發(fā)菌時(shí)間縮 短22. 22%，雜菌感染率降低96. 67%，一級(jí)菇率提高5%，生產(chǎn)能力為市售杏鮑菇液體菌種 2倍以上，體現(xiàn)了較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，更加適合工廠化、規(guī)?；耘?。
[0042] 具體技術(shù)原理為：
[0043] 1.本發(fā)明的中草藥提取物科學(xué)復(fù)配顯著提高菌種抗冷、熱應(yīng)激性、免疫性和抗病 性的中草藥為原料，經(jīng)超聲清洗、低溫酶解、水提醇提和超聲波輔助微波提取而制備的，提 取物有效成分含量高，成本低，可有效通過逐級(jí)馴化、復(fù)壯擴(kuò)大培養(yǎng)，增強(qiáng)了杏鮑菇菌種抗 高溫及低溫應(yīng)激能力，提高了產(chǎn)纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶等降解酶的能力，激發(fā)了其增殖 能力和增殖密度，縮短了萌發(fā)時(shí)間，有效提高了杏鮑菇液體菌種的密度、菌絲干重和胞外多 糖的產(chǎn)量，縮小了菌絲球直徑，增強(qiáng)了菌株對(duì)發(fā)酵環(huán)境及后續(xù)栽培環(huán)境的適應(yīng)性，全面增強(qiáng) 了高密度液體菌種的抗應(yīng)激性、抗病性和免疫能力，同時(shí)采用超聲清洗可有效殺滅原料中 的蟲卵及雜菌，降低重金屬離子含量和農(nóng)藥殘留量，降低了杏鮑菇富集重金屬離子的原料 可能，提高了食用菌的食品安全性和液體菌種的保質(zhì)期。
[0044] 2.本發(fā)明木肩粉以高纖維素含量和高木質(zhì)素含量的木肩與植物油為原料，采用超 聲清洗、高壓蒸煮和微波干燥工藝制備，其質(zhì)地細(xì)柔軟，營養(yǎng)纖維素含量高，非常有利于杏 鮑菇菌種發(fā)酵，同時(shí)網(wǎng)格結(jié)構(gòu)豐富、均勻，吸附力強(qiáng)，植物油附著量大，既可為杏鮑菇提供豐 富的營養(yǎng)，還可解決高通風(fēng)量下鼓氣發(fā)酵易起泡沫的問題，也為后期的栽培過程提供了環(huán) 境適應(yīng)性能力，并且采用超聲清洗可有效殺滅原料中的蟲卵及雜菌，降低重金屬離子含量 和農(nóng)藥殘留量，降低了杏鮑菇富集重金屬離子的原料可能，提高了食用菌的食品安全性。
[0045] 3.本發(fā)明克服了傳統(tǒng)制備發(fā)酵培養(yǎng)基的方法，對(duì)其中的黃豆餅粉進(jìn)一步液化和酶 解，將其中的淀粉和蛋白質(zhì)大分子營養(yǎng)物質(zhì)降解為小分子，便于杏鮑菇起酵和發(fā)酵，縮短了 杏鮑菇發(fā)酵周期。
[0046] 4.本發(fā)明的包被殼聚糖，同時(shí)具有殼聚糖和α-環(huán)狀糊精的多重功能，適度調(diào)整 了杏鮑菇發(fā)酵液的粘度、相溶性、穩(wěn)定性、吸附性和抑菌性，提高了菌絲球在發(fā)酵液中分布 的均一^性和溶氧程度。
[0047] 5.本發(fā)明高密度液體菌種的發(fā)酵方法采用鼓氣發(fā)酵工藝，工藝簡(jiǎn)單、操作方便、發(fā) 酵周期短（發(fā)酵罐67-92h)，可規(guī)?；蜋C(jī)械化生產(chǎn)，通過優(yōu)化菌種擴(kuò)培和發(fā)酵過程培養(yǎng)基 及發(fā)酵工藝，采用分段追加接種和變溫發(fā)酵的方式，縮短了菌齡及增殖代數(shù)差距，有效提高 了杏鮑菇液體菌種的生物活性和發(fā)酵力，顯著提高了菌絲球的密度、菌絲干重和胞外多糖 的產(chǎn)量，縮小了菌絲球直徑，全面提高了杏鮑菇液體菌種的質(zhì)量和產(chǎn)量，降低了生產(chǎn)成本。
【具體實(shí)施方式】
[0048] 下面通過具體的實(shí)施方案敘述本發(fā)明。除非特別說明，本發(fā)明中所用的技術(shù)手段 均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另外，實(shí)施方案應(yīng)理解為說明性的，而非限制本發(fā)明的 范圍，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書所限定。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本 發(fā)明實(shí)質(zhì)和范圍的前提下，對(duì)這些實(shí)施方案中的物料成分和用量進(jìn)行的各種改變或改動(dòng)也 屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0049] 實(shí)施例1原料制備
[0050] 1.中草藥提取物的制備：
[0051] 所述中草藥提取物的制備方法，包括如下步驟：按重量份數(shù)計(jì)，稱取黃芪30份，干 姜30份，陳皮30份，牛黃25份，丹皮25份，甘草20份，知母18份，金銀花18份，魚腥草17 份，赤芍15份，黃芩15份，川芎10份，當(dāng)歸8份；置盛有0. 2%碳酸氫鈉溶液的超聲波清洗 機(jī)中于200W、30KHz清洗12min，瀝干，將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，置容器中均 勻混合并添加5倍重量的水，得混合物料，控制溫度80°C保持3h，接著降溫至45°C，用乳酸 調(diào)節(jié)pH值為4,在功率200W條件下進(jìn)行微波提取12min，同時(shí)在功率250W，頻率35KHz條 件下進(jìn)行超聲波輔助提?。蝗缓蠹尤牖旌衔锪峡傊亓?. 〇 %的混合酶進(jìn)行酶解，用乳酸調(diào) 節(jié)pH值為6. 2,酶解3h，最后添加混合物料2倍重量乙醇和丙醇的混合物，乙醇和丙醇混合 的質(zhì)量比為1:2,控制溫度至70°C保持3. 5h，過濾，得第一濾液；添加濾渣2倍重量的水，控 制溫度90°C保持2h，然后降溫至30°C，過濾，得第二濾液；將第一濾液和第二濾液按照質(zhì)量 比3:2合并，濾液真空濃縮后冷凍干燥、粉碎即得中草藥提取物；
[0052] 所述混合酶為葡聚糖酶、木聚糖酶、戊聚糖酶、果膠酶按質(zhì)量比4:3:3:2均勻混 合。