高純度聚乙二醇醛類衍生物的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一種高純度聚乙二醇醛類衍生物的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 聚乙二醇（PEG)是一種用途極其廣泛的人工合成高分子化合物，主要應(yīng)用于生物 醫(yī)藥、化工、食品、材料科學(xué)等眾多領(lǐng)域。PEG易溶于水和有機溶劑，具有很好的理化特性和 生物相容性。在生物醫(yī)藥中，PEG因具有兩親性和良好的安全性、生物相容性，且無活性、也 無毒副作用，故作為輔料被廣泛應(yīng)用于藥物制劑以及藥物的緩釋、靶向研宄，還可以通過共 價連接于蛋白質(zhì)或多肽以改善蛋白、多肽類藥物的生物化學(xué)特性和藥動學(xué)性質(zhì)，甚至用于 小分子藥物的修飾。大量研宄表明，經(jīng)過PEG修飾的多肽與蛋白類藥物抗原性明顯降低或 消除，穩(wěn)定性增加，藥物半衰期大為延長，療效更好。
[0003] 為了將聚乙二醇與藥物相連接，需要在PEG鏈的末端連接各種具有活性的官能基 團。其中，聚乙二醇醛類衍生物（PEG醛）對蛋白質(zhì)N端氨基的定點修飾由于條件溫和、修 飾位點均一等優(yōu)勢而獲得了廣泛的應(yīng)用，且可用于大多數(shù)N端為非活性位點的蛋白多肽類 藥物的修飾，是目前最常用的PEG修飾劑之一。
[0004] 已有報道的制備PEG醛的方法主要有氧化法和縮醛法。氧化法是通過直接氧化 PEG鏈的末端羥基而獲得，例如將氧氣加入至PEG和催化劑的混合物中氧化PEG鏈末端的羥 基為醛基，或者以MnO2等作為氧化劑直接氧化末端羥基，但是在大多數(shù)情況下，這些氧化條 件容易導(dǎo)致PEG鏈的分解，而且PEG鏈的端基轉(zhuǎn)化率并不高，多數(shù)在80%以下?？s醛法是通 過在PEG鏈末端引入縮醛基團隨后水解而獲得，但是這種方法所用的反應(yīng)物原料較為昂貴 而不適于商業(yè)化，且由于PEG鏈的末端官能團未經(jīng)中間純化步驟而轉(zhuǎn)化，因此，所得產(chǎn)物純 度仍然有限。由于制備的PEG醛不純，會含有很多副產(chǎn)物，給藥物的修飾帶來風(fēng)險，并且影 響到PEG對蛋白多肽類藥物的修飾效率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供一種能提高聚乙二醇醛類 衍生物純度的制備方法。
[0006] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所設(shè)計的高純度聚乙二醇醛類衍生物的制備方法，包 括如下步驟：
[0007] (1)將PEG的端羥基轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚愿叩幕鶊F得到PEG活性中間體，然后用PEG活性 中間體與具有α-羥基酸、β-氨基醇或α-氨基酮結(jié)構(gòu)的小分子化合物反應(yīng)獲得聚乙二 醇中間體，所述聚乙二醇中間體的結(jié)構(gòu)式①或②如下：
[0008]
[0009] 其中，η為10~3000的整數(shù)，m為0~5的整數(shù)；k為2~8的整數(shù)，表示聚乙二 醇鏈的數(shù)目；
[0010] R為羥基、烷氧基、芳烷氧基，或者是氨基、羧基、氰基、鹵素、環(huán)氧化物、馬來酰亞 胺、吡啶基二硫化物、對甲苯磺酸酯、甲基磺酸酯、對硝基苯碳酸酯、異氰酸酯、異硫氰酸酯、 N-琥珀酰亞胺基氧、磺基-N-琥珀酰亞胺基氧、馬來酰亞胺基、1-苯并三唑基氧、1-咪唑基 氧或?qū)ο趸交醯囊环N或多種；
[0011] X為醚鍵、硫醚鍵、氨基鍵、酰胺鍵、酯鍵、硫代酯鍵、碳酸酯鍵、氨基甲酸酯鍵、硫脲 鍵的一種或多種組成的連接基團，或者是具有雙功能官能團的連接基團；
[0012] Y為聚乙二醇中間體的末端基團，具有α-羥基酸、β-氨基醇或α-氨基酮的結(jié) 構(gòu)；
[0013] Z為連接多個聚乙二醇鏈的小分子連接基團，具有多個活性基團，包括蘋果酸、檸 檬酸、谷氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、寡聚氨基酸的一種或多種；
[0014] (2)使用離子交換樹脂分離純化聚乙二醇中間體，聚乙二醇中間體的結(jié)構(gòu)中因引 入了氨基或者羧基，因此可以分別用陽離子或者陰離子交換樹脂分離純化獲得較純的中間 體以除去原料中的雜質(zhì)或反應(yīng)過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物；
[0015] (3)將聚乙二醇中間體用氧化劑將其氧化獲得聚乙二醇醛類衍生物，其結(jié)構(gòu)式③ 或④如下：
[0016]
[0017] 其中，n、m、k、R、X、Z與上述聚乙二醇中間體所述一致。
[0018] 所述的氧化劑為四乙酸鉛、高碘酸或其鹽中的一種。若選用高碘酸或其鹽為氧化 劑，氧化反應(yīng)中所用溶劑為水；若選用四乙酸鉛為氧化劑，氧化反應(yīng)中所用溶劑為有機溶 劑。所述氧化劑優(yōu)選高碘酸或其鹽，最優(yōu)選高碘酸鈉（NaIO4)。高碘酸或其鹽可以氧化PEG 末端引入的α-羥基酸、β-氨基醇或α-氨基酮等結(jié)構(gòu)而獲得相應(yīng)結(jié)構(gòu)的聚乙二醇醛類 衍生物，該氧化條件溫和，不會導(dǎo)致PEG鏈的分解，且該反應(yīng)可以定量完成。所得聚乙二醇 醛類衍生物的純度可以通過最后一步反應(yīng)所消耗的氧化劑進行滴定分析，也可以利用核磁 共振圖譜進行分析。
[0019] 在合成聚乙二醇中間體時，所述PEG活性中間體與小分子之間的連接鍵是醚鍵、 硫醚鍵、氨基鍵、酰胺鍵、酯鍵、硫代酯鍵、碳酸酯鍵、氨基甲酸酯鍵或硫脲鍵的一種或多種。
[0020] 所述PEG活性中間體上的活性基團包括氨基、羧基、對硝基苯碳酸醋、磺酸酯（優(yōu) 選甲基磺酸酯和對甲基苯磺酸酯）、膦酸酯（三苯基膦酸酯）、氰基、異氰酸酯、異硫氰酸酯、 硝酸酯、亞硝酸酯、鹵素（優(yōu)選氯和溴）、硫酸酯、鹵代硫酸酯、硝酸酯、鹵代亞硫酸酯、N-琥 珀酰亞胺基、馬來酰亞胺基的一種或多種。所述PEG活性中間體是兩端具有相同或不同功 能基團的PEG活性中間體，或是單端封閉的PEG活性中間體。這里優(yōu)選為單甲氧基聚乙二 醇（mPEG)。
[0021] 所述小分子化合物包括絲氨酸、蘇氨酸、異絲氨酸、3-氨基-2-羥基己酸、2-氨 基-3-羥基-3-甲基丁酸、4-氨基-3-羥基丁酸、1，4-二胺-2- 丁醇、4-氨基-2-羥基丁 酸、3-氨基-4-羥基丁酸、酒石酸的一種或多種。
[0022] 上述聚乙二醇中間體可以是直鏈、雙鏈、多鏈或者星形、樹形、分叉形結(jié)構(gòu)的聚乙 二醇衍生物，因此，氧化所得的聚乙二醇醛類衍生物也可以是直鏈、雙鏈、多鏈或者星形、樹 形、分叉形結(jié)構(gòu)。
[0023] 本發(fā)明得到的一種高純度聚乙二醇醛類衍生物的制備方法，利用離子交換樹脂分 離純化獲得較純的聚乙二醇中間體，再經(jīng)由氧化劑定量氧化即可獲得高純度的聚乙二醇醛 類衍生物，這里的高純度指的是聚乙二醇醛類衍生物的含量為98. 0%以上。本發(fā)明的制備 方法是一種適合于商業(yè)化生產(chǎn)的經(jīng)濟型方法，因為反應(yīng)物均是可以購買得到的化合物，并 且所涉及的大多數(shù)反應(yīng)無需高溫、高壓等特殊的制備裝置。
【具體實施方式】
[0024] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進一步說明。
[0025] 實施例1 :單甲氧基聚乙二醇20000-醛（mPEG20000-醛）的制備
[0026] 高純度聚乙二醇醛類衍生物的制備方法，包括如下步驟：
[0027] (1)將PEG的端羥基轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚愿叩幕鶊F得到PEG活性中間體，然后用PEG 活性中間體與具有α-羥基酸、β-氨基醇或α-氨基酮結(jié)構(gòu)的小分子化合物反應(yīng)獲 得聚乙二醇中間體；具體本實施例中采用的PEG活性中間體由單端封閉的PEG的端羥 基轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚愿叩幕鶊F而制得。本實施例中選為單甲氧基聚乙二醇（mPEG)。將單 甲氧基聚乙二醇20000 (mPEG20000，平均相對分子質(zhì)量為20000)的端羥基轉(zhuǎn)變?yōu)榘被?獲得PEG活性中間體，然后與小分子化合物N-叔丁氧羰基-L-絲氨酸（Boc-Ser-OH) 進行反應(yīng)隨后脫去Boc基團，得到聚乙二醇中間體mPEG20000-Ser，其結(jié)構(gòu)式為
,其中η平均為454, m為0, R為甲氧 基，X為酰胺鍵，Y為β -氨基醇結(jié)構(gòu)。
[0028] (2)使用陽離子交換樹脂分離純化聚乙二醇中間體；
[0029] (3)將聚乙二醇中間體用高碘酸鈉（NaIO4)將其氧化獲得聚乙二醇醛類衍生物。
[0030] 整個制備過程中的反應(yīng)式如下：
[0031]
[0032] I. 1單甲氧基聚乙二醇20000-叔丁氧羰基-L-絲氨酸（mPEG20000-Ser-Boc)的 合成
[0033] 取51mg N-叔丁氧羰基-L-絲氨酸（Boc-Ser-OH)、49mg 1-乙基-(3-二甲基氨基 丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDOHCl)和30mg N-羥基琥珀酰亞胺（NHS)于IOOmL燒瓶中，加 入20mL無水二氯甲烷（CH2Cl2)，冰浴攪拌15min后加入0. 5g單甲氧基聚乙二醇20000-氨 基鹽酸鹽（mPEG20000-NH2 · HC1)和42 μ L三乙胺，冰浴繼續(xù)攪拌30min后升至室溫繼續(xù)反 應(yīng)12h。所得反應(yīng)液用飽和氯化鈉溶液洗滌多次，收集有機相，無水硫酸鈉干燥，然后過濾并 將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至小體積，用冷卻無水乙醚沉淀，沉淀收集后真空干燥，無水乙醇重結(jié) 晶，得白色固體粉末0. 416g，收率83. 2%。
[0034] 1. 2單甲氧基聚乙二醇20000-L-絲氨酸（mPEG20000-Ser)的合成與純化
[0035] 取0· 4g單甲氧基聚乙二醇20000-叔丁氧羰基-L-絲氨酸（mPEG20000-Ser-Boc) 溶于2. 5mL無水二氯甲烷中，加入2. 5mL三氟乙酸（TFA)，混勻后室溫攪拌2h。將20mL飽 和碳酸氫鈉溶液加入至反應(yīng)液中，然后用二氯甲燒萃?。↖OmLX 3)，再用IOmL飽和碳酸 氫鈉溶液和飽和IOmL氯化鈉溶液各洗滌一次，收集有機相，無水硫酸鈉干燥，然后過濾并 將濾液濃縮，用冷卻無水乙醚沉淀，抽濾收集沉淀后真空干燥，白色固體粉末0. 35g，收率 87. 5%。再用陽離子交換樹脂柱層析純化，得到白色粉末0. 32g。
[0036] 1.3單甲氧基聚乙二醇20000-醛（mPEG20000-醛）的合成
[0037] 取0. 3g上述純化過的產(chǎn)物溶于IOml水中，加入16mg高碘酸鈉（NaIO4)，室溫攪拌 4h。然后向反應(yīng)液中加入100 μ 1乙二醇，攪拌片刻后，用二氯甲烷萃?。?0mlX3)，有機相 合并后用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾濃縮后用冷卻無水乙醚沉淀，抽濾后真空 干燥，得白色粉末0. 27g，收率90. 0 %，純度99. 3 %。
[0038] 實施例2 :單甲氧基聚乙二醇5000-丙醛（mPEG5000-丙醛）的制備
[0039] 高純度聚乙二醇醛類衍生物的制備方法，包括如下步驟：
[0040] (1)將單甲氧基聚乙二醇5000(mPEG5000,平均相對分子質(zhì)量為5000)的端羥 基轉(zhuǎn)變?yōu)閷妆交撬狨サ玫絾渭籽趸垡叶?000-對甲苯磺酸酯（mPEG5000-0Ts)，然 后與α -羥基-γ-氨基丁酸反應(yīng)獲得聚乙二醇中間體單甲氧基聚乙二醇5000-羥基酸 (mPEG5000-羥基酸），其結(jié)構(gòu)式為
其 中η平均為113, m為2, R為甲氧基，X為氨基鍵，Y為α -羥基酸結(jié)構(gòu)。
[0041] (2)使用陰離子交換樹脂分離純化聚乙二醇中間體；
[0042] (3)將聚乙二醇中間體用高碘酸鈉（NaIO4)將其氧化獲得聚乙二醇醛類衍生物，即 單甲氧基聚乙二醇5000-丙醛。
[0043] 整個制備過程中的反應(yīng)式如下：
[0044]
[0045] 2· 1單甲氧基聚乙二醇5000-