展庫(kù)酸a的制備方法及其在抗白血病藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明公開了一種植物提取物的制備方法及應(yīng)用，特別涉及展庫(kù)酸A的制備方法 及其在抗白血病藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 展庫(kù)酸A (Zhankuic acid A)，分子式為C29H4tlO5，分子量為468. 63,是從多孔菌科 (Polyporaceae)玉桂薄孔菌 JfliratZia ci/zaa避通9a Chang & Chou, sp.nov.子實(shí)體中分離 得到的一種活性成分。研宄發(fā)現(xiàn)，展庫(kù)酸A對(duì)淋巴白血病細(xì)胞P388呈細(xì)胞毒活性，IC50為 1. 8 μ g/ml 〇
[0003] 白血病是一類造血干細(xì)胞惡性克隆性疾病?？寺⌒园籽〖?xì)胞因?yàn)樵鲋呈Э?、?化障礙、凋亡受阻等機(jī)制在骨髓和其他造血組織中大量增殖累積，并浸潤(rùn)其他組織和器官， 同時(shí)正常造血受抑制。臨床可見不同程度的貧血、出血、感染發(fā)熱以及肝、脾、淋巴結(jié)腫大和 骨骼疼痛。據(jù)報(bào)道，我國(guó)各地區(qū)白血病的發(fā)病率在各種腫瘤中占第六位。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為滿足臨床需要，擴(kuò)大用藥品種，更好地治療癌癥，提供一種展庫(kù)酸A的制備方法 及其在抗白血病藥物中的應(yīng)用。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案： 展庫(kù)酸A的制備方法，其特征在于包括以下步驟： 1) 取玉桂薄孔菌子實(shí)體粉碎，采用4~10倍量20~40%乙醇回流提取1~4次，每次 0. 5~1. 5h，過(guò)濾，合并提取液，濃縮至無(wú)醇，得濃縮液； 2) 將上述濃縮液加入至聚酰胺樹脂柱中吸附，用4~8BV的酸醇洗脫，收集洗脫液，回收 溶劑至干，得展庫(kù)酸A粗提物； 3) 將上述展庫(kù)酸A粗提物采用高速逆流色譜儀分離，收集洗脫液，濃縮，低溫干燥得展 庫(kù)酸A。
[0006] 其特征在于所述步驟2)中的聚酰胺樹脂粒度為80~120目，用量與藥材量的體積 重量比為1 :1_3。
[0007] 其特征在于所述步驟2)中的酸醇是含1%乙酸的30~50%乙醇溶液。
[0008] 其特征在于所述步驟3)中的高速逆流色譜儀的參數(shù)設(shè)定為：轉(zhuǎn)速750~1050r/ min，流動(dòng)相的流速2~10ml/min。
[0009] 所述制備的展庫(kù)酸A，在制備抗白血病藥物中的應(yīng)用，尤其在制備防治淋巴性白血 病和髓細(xì)胞白血病的應(yīng)用。
[0010] 所述制備的展庫(kù)酸A，在其口服配方中添加腸吸收促進(jìn)劑，包含中鏈脂肪酸鹽、膽 酸鹽、鵝去氧膽酸鹽、殼聚糖及其衍生物中的一種或幾種。
[0011] 采用本法制備展庫(kù)酸A，工藝簡(jiǎn)便易操作，制備量大，產(chǎn)品得率高，而且低污染；添 加腸吸收促進(jìn)劑，有利于提高生物利用度。
[0012] 下面將結(jié)合【具體實(shí)施方式】進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明要求保護(hù)的范圍并不局限 于下列實(shí)施方式。
【具體實(shí)施方式】
[0013] 實(shí)施例1 : 展庫(kù)酸A的制備 取玉桂薄孔菌子實(shí)體lkg，粉碎，加入4L40%乙醇回流提取4次，每次I. 5h，固液分離 得提取液，濃縮至無(wú)醇味，取350g80目的聚酰胺樹脂，裝柱，濃縮液上柱，用8BV的含1% 乙酸的30%乙醇洗脫，洗脫液回收溶劑，得展庫(kù)酸A粗提物；取正丁醇、乙酸、水按3:1:4體 積比置于分液漏斗中混勻，靜置分層，分離上下相，取上相為固定相，下相為流動(dòng)相，將展庫(kù) 酸A粗提物用下相溶解，開啟制備型高速逆流色譜儀，以2ml/min流速泵入流動(dòng)相，并通過(guò) 進(jìn)樣閥連續(xù)進(jìn)樣，控制轉(zhuǎn)速為750r/min，收集流出液，濃縮，低溫干燥得展庫(kù)酸A，檢測(cè)含量 99. 3%〇
[0014] 實(shí)施例2 : 展庫(kù)酸A的制備 取玉桂薄孔菌子實(shí)體5kg，粉碎，加入10L20%乙醇回流提取0. 5h，固液分離得提取液， 濃縮至無(wú)醇味，取5kgl20目的聚酰胺樹脂，裝柱，濃縮液上柱，用4BV的含1%乙酸的50%乙 醇洗脫，洗脫液回收溶劑，得展庫(kù)酸A粗提物；取正丁醇、乙酸、水按7:3:10體積比置于分液 漏斗中混勻，靜置分層，分離上下相，取上相為固定相，下相為流動(dòng)相，將展庫(kù)酸A粗提物用 下相溶解，開啟制備型高速逆流色譜儀，以3. 5ml/min流速泵入流動(dòng)相，并通過(guò)進(jìn)樣閥連續(xù) 進(jìn)樣，控制轉(zhuǎn)速為l〇50r/min，收集流出液，濃縮，低溫干燥得展庫(kù)酸A，檢測(cè)含量99. 1%。
[0015] 實(shí)施例3: 展庫(kù)酸A的制備 取玉桂薄孔菌子實(shí)體l〇kg，粉碎，加入80L30%乙醇回流提取2次，每次lh，固液分離 得提取液，濃縮至無(wú)醇味，取6kg80目的聚酰胺樹脂，裝柱，濃縮液上柱，用6BV的含1%乙 酸的45%乙醇洗脫，洗脫液回收溶劑，得展庫(kù)酸A粗提物；取正丁醇、乙酸、水按6:2:7體積 比置于分液漏斗中混勻，靜置分層，分離上下相，取上相為固定相，下相為流動(dòng)相，將展庫(kù)酸 A粗提物用下相溶解，開啟制備型高速逆流色譜儀，以lOml/min流速泵入流動(dòng)相，并通過(guò) 進(jìn)樣閥連續(xù)進(jìn)樣，控制轉(zhuǎn)速為900r/min，收集流出液，濃縮，低溫干燥得展庫(kù)酸A，檢測(cè)含量 98. 5%〇
[0016] 實(shí)施例4: 展庫(kù)酸A的其在抗白血病藥物中的應(yīng)用 1、材料 動(dòng)物：昆明種小鼠，雌雄各半性，體重20±2g，由南京中醫(yī)藥大學(xué)提供。
[0017] 細(xì)胞株：P388 (白血?。┘?xì)胞株，由中國(guó)科學(xué)院上海藥物研宄所提供。
[0018] 2、方法 在含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，將被試細(xì)胞調(diào)成密度為2 X IO4細(xì)胞/ml。 將上述細(xì)胞株懸液接種于96孔培養(yǎng)板，每孔5〇μ1，置于飽和濕度、37 °C和5%C02培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)24小時(shí)。分別加入溶劑對(duì)照0. 1%二甲基亞砜、陽(yáng)性對(duì)照順鉑（DDP)以及不同濃度單體 化合物的二甲亞砜溶液各5〇μ1，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)72小時(shí)，于培養(yǎng)結(jié)束前4小時(shí)，各培 養(yǎng)孔加入5mg/ml四唑翁鹽（MTT) 1〇μ1，置于飽和濕度、37°C和5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時(shí)， 每孔中加入15〇μ1二甲亞砜，振蕩溶解生成MTT晶體甲臜，用酶標(biāo)儀測(cè)570nm0. D值，細(xì)胞存 活率由樣品0. D值對(duì)于對(duì)照品0. D值的比值計(jì)算。其中，展庫(kù)酸A對(duì)P388細(xì)胞的半數(shù)抑制 濃度（IC5tl)有劑量效應(yīng)曲線得到。
[0019] 3、結(jié)果 實(shí)現(xiàn)結(jié)果(見表1)本發(fā)明展庫(kù)酸A對(duì)P388細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，其對(duì)P388 細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制活性強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照順鉑（DDP)，說(shuō)明展庫(kù)酸A具有極佳的抗白血病的活性， 在制備抗白血病藥物中有良好的應(yīng)用前景。
[0020] 表1本發(fā)明展庫(kù)酸A對(duì)P388細(xì)胞的抑制作用（n=10，i ±S)
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 展庫(kù)酸A的制備方法，其特征在于包括以下步驟： 1) 取玉桂薄孔菌子實(shí)體粉碎，采用4~10倍量20~40%乙醇回流提取1~4次，每次 0. 5~1. 5h，過(guò)濾，合并提取液，濃縮至無(wú)醇，得濃縮液； 2) 將上述濃縮液加入至聚酰胺樹脂柱中吸附，用4~8BV的酸醇洗脫，收集洗脫液，回收 溶劑至干，得展庫(kù)酸A粗提物； 3) 將上述展庫(kù)酸A粗提物采用高速逆流色譜儀分離，收集洗脫液，濃縮，低溫干燥得展 庫(kù)酸A。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的展庫(kù)酸A的制備方法，其特征在于所述步驟2)中的聚酰胺樹 脂粒度為80~120目，用量與藥材量的體積重量比為1 :1-3。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的展庫(kù)酸A的制備方法，其特征在于所述步驟2)中的酸醇是含 1%乙酸的30~50%乙醇溶液。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的展庫(kù)酸A的制備方法，其特征在于所述步驟3)中的高速逆流 色譜儀的參數(shù)設(shè)定為：轉(zhuǎn)速750~1050r/min，流動(dòng)相的流速2~10ml/min。5. 根據(jù)權(quán)利要求1~4所述方法制備的展庫(kù)酸A，在制備抗白血病藥物中的應(yīng)用。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述在制備抗白血病藥物中的應(yīng)用，其特征在于在制備防治淋巴性 白血病和髓細(xì)胞白血病的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種植物提取物的制備方法及應(yīng)用，尤其涉及展庫(kù)酸A的制備方法及其在抗白血病藥物中的應(yīng)用。制備方法包括以下步驟：取玉桂薄孔菌子實(shí)體粉碎，采用低濃度醇回流提取，提取液濃縮至無(wú)醇，上聚酰胺樹脂柱吸附，酸醇洗脫，洗脫液回收溶劑，再采用高速逆流色譜法純化，收集流出液，濃縮，低溫干燥得高純度的展庫(kù)酸A。采用本發(fā)明制備方法，工藝操作簡(jiǎn)便、得率高，污染小，適合高純度展庫(kù)酸A的生產(chǎn)。展庫(kù)酸A具有抗腫瘤作用，藥理實(shí)驗(yàn)表明展庫(kù)酸A在抗腫瘤方面有很好的效果，尤其是對(duì)人淋巴細(xì)胞白血病(P388)效果更佳，可用于制備抗白血病藥物。
【IPC分類】A61P35/02, A61K31/575, C07J9/00
【公開號(hào)】CN104910232
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510265019
【發(fā)明人】劉東鋒, 楊成東
【申請(qǐng)人】南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司
【公開日】2015年9月16日
【申請(qǐng)日】2015年5月22日