專(zhuān)利名稱(chēng)：抗急性髓性白血病的gm－csf靶向藥物脂質(zhì)體及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種治療急性髓性白血病的藥物，具體的說(shuō)是在包封有抗急性髓性白血病的藥物的脂質(zhì)體表面聯(lián)接具有主動(dòng)靶向性的導(dǎo)向物GM-CSF而形成的靶向藥物脂質(zhì)體及其制備方法。
背景技術(shù)：
急性白血病是造血系統(tǒng)的惡性腫瘤，發(fā)病率約3/10萬(wàn)居住人群，占青少年惡性腫瘤第一位。致病原因目前還不是十分清楚，可能與病毒、物理及化學(xué)致癌因素有關(guān)。急性白血病往往導(dǎo)致正常造血功能障礙和白血病細(xì)胞浸潤(rùn)癥狀，臨床常有嚴(yán)重感染、出血、貧血等表現(xiàn)，不經(jīng)治療中位生存期不足三個(gè)月，對(duì)生命財(cái)產(chǎn)構(gòu)成很大威脅。急性白血病分為急性髓性白血病和急性淋巴細(xì)胞白血病兩種主要類(lèi)型，其中在我國(guó)急性髓性白血病占2/3以上。
急性髓性白血病通常采用化學(xué)治療，標(biāo)準(zhǔn)的DA化療方案能夠使60％-80％的初發(fā)患者獲得緩解，但單純用化療治愈率不足15％。近年來(lái)急性髓性白血病(AML)的治療有了很大進(jìn)展，骨髓干細(xì)胞移植等方法可以使近50％~60％的患者獲得治愈，但仍然有相當(dāng)部分患者療效較差或復(fù)發(fā)而成為難治病例。另一方面，某些患者的身體狀況如年齡較大或有臟器功能損傷不能承受較強(qiáng)烈的化療或骨髓移植治療，因此，對(duì)于一般情況不佳耐受性差的患者，開(kāi)發(fā)增強(qiáng)藥物的特異靶向性、增加療效、減少不良反應(yīng)的治療方法顯得十分重要。國(guó)外多采用單克隆抗體作為靶向制導(dǎo)劑，單用或攜帶同位素、毒素、化療藥物制備成靶向治療劑。但單克隆抗體十分昂貴，如果用鼠抗還易導(dǎo)致抗體產(chǎn)生而不能重復(fù)使用。
脂質(zhì)體是一種定向藥物載體，屬于靶向給藥系統(tǒng)的一種新型制劑。它具有類(lèi)細(xì)胞結(jié)構(gòu)，進(jìn)入人體內(nèi)主要被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬而激活機(jī)體自身的免疫功能，并改變被包封藥物的體內(nèi)分布、使藥物主要在肝、脾、肺和骨髓等組織器官中蓄積，從而提高藥物的治療指數(shù)、減少藥物的治療劑量和降低藥物的毒性。因此，脂質(zhì)體在許多疾病尤其是癌癥的治療中顯示了明顯的優(yōu)越性。脂質(zhì)體作為抗癌藥物的載體具有能增加藥物與癌細(xì)胞的親和力，克服耐藥性，增加藥物被癌細(xì)胞的攝取量、降低用藥劑量、提高療效、降低毒副作用的特點(diǎn)。大量的研究結(jié)果表明抗癌藥物脂質(zhì)體可以提高藥物療效、降低毒性作用(參見(jiàn)文獻(xiàn)BayesM.Gateways to clinical trials[J].Methods Find Exp Clin Pharmacol，2003，25(1)53-76；和Gokhale PC.Improved safety pharmacokinetics and therapeuticefficacy profiles of a novel liposomal formalation of mitoxantrone[J].Anticancer Res，2001，21(5)3313-3321；和Adlakha-Hutchem G.Controlled destabilization of aliposomal drug delivery system enhances mitoxantrone antitumor activity[J].NatBiotechnol，1999，17(8)775-779)。但是脂質(zhì)體本身的靶向性是一種非特異性作用，要使脂質(zhì)體特異性地分布到特定的組織器官需要在脂質(zhì)體表面聯(lián)接上導(dǎo)向物質(zhì)制成靶向脂質(zhì)體。
靶向脂質(zhì)體對(duì)靶細(xì)胞具有特異親和力、療效顯著、不良反應(yīng)小，同時(shí)包封多種化療藥物制成聯(lián)合化療靶向脂質(zhì)體，可方便高效地實(shí)現(xiàn)聯(lián)合化療。靶向脂質(zhì)體的優(yōu)點(diǎn)是載藥量大，體內(nèi)滯留時(shí)間長(zhǎng)，有專(zhuān)一靶向性，是當(dāng)前較受重視的一種釋藥系統(tǒng)(參見(jiàn)文獻(xiàn)Bendas G.Immunoliposomesa promising approach totargeting cancer therapy[J].BioDrugs，2001，15(4)215-224，和Hou XP.Study onthird-type immunoliposomes loaded drugs and the targeting in vitro and in vivo[J].Yao Xue Xue Bao，2001，36(7)539-542，和Maruyama.K.In vivo targeting byliposomes[J].Biol Pharm Bull，2000，23(7)791-799)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的，是提供一種抗急性髓性白血病的GM-CSF靶向藥物脂質(zhì)體。它利用對(duì)急性髓性白血病細(xì)胞(表達(dá)GM-CSF受體)具有特異靶向性的GM-CSF作為導(dǎo)向物質(zhì)，聯(lián)接已包封抗急性髓性白血病的藥物的脂質(zhì)體，制備成靶向脂質(zhì)體。抗急性髓性白血病的藥物可以采用抗腫瘤抗生素或烷化劑類(lèi)抗腫瘤藥或影響核酸生物合成的抗腫瘤藥或影響蛋白質(zhì)合成的抗腫瘤藥或拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑或生物毒素，以組成不同的與GM-CSF組成的藥物脂質(zhì)體?？辜毙运栊园籽〉乃幬飪?yōu)選米托蒽醌、柔紅霉素、阿霉素、阿克拉霉素、刺孢酶素、吡南阿霉素、阿糖胞苷、氟達(dá)拉賓、吉西他賓、氟尿嘧啶、氨甲蝶呤、硫唑嘌呤、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春花堿、拓?fù)涮婵?、足葉一甙、VM26、環(huán)磷酰氨、異環(huán)磷酰氨、順鉑、卡鉑、卡氮芥、馬法蘭、馬利蘭、羥基脲、紫山醇。
本發(fā)明采用粒單細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)作為導(dǎo)向藥物與藥物脂質(zhì)體聯(lián)接形成新的具有靶向治療特征的治療制劑，用于治療急性髓性白血病，一方面使治療成本較單克隆抗體顯著降低，另一方面由于脂質(zhì)體可以攜帶一種或多種較大劑量的治療因子，從而顯著提高療效并有利于克服耐藥。
本發(fā)明采用體外模型MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其對(duì)急性髓性白血病細(xì)胞株HL60的細(xì)胞毒作用和對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，為用靶向脂質(zhì)體包封藥物治療惡性腫瘤，提供了研究基礎(chǔ)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的，是提供制備DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質(zhì)體的方法。
它包括以下步驟1).制備DHAQ脂質(zhì)體；2).測(cè)定DHAQ脂質(zhì)體包封率；3).制備DHAQ靶向脂質(zhì)體；4).DHAQ-GM-CSF靶向脂質(zhì)體的純化。
本發(fā)明的實(shí)施例采用治療急性白血病有良好療效的米托蒽醌(DHAQ)作為被包封藥物，導(dǎo)向物質(zhì)采用粒-巨嗜細(xì)胞集落刺激因子GM-CSF。在脂質(zhì)體表面聯(lián)接導(dǎo)向物質(zhì)制成靶向藥物脂質(zhì)體DHAQ-GM-CSF，通過(guò)導(dǎo)向物質(zhì)的特異性專(zhuān)一地與靶細(xì)胞表面的受體分子相互作用，而使脂質(zhì)體在靶區(qū)釋放藥物。
本發(fā)明的再一個(gè)目的，是提供DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質(zhì)體對(duì)急性髓性白血病具有特異殺傷性的試驗(yàn)結(jié)果。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是用DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質(zhì)體治療AML具有相對(duì)選擇作用，藥物的特異靶向性好，療效高，毒副作用小，提高患者對(duì)化療的耐受性，使DHAQ發(fā)揮更佳的抗白血病作用。由于重組人GM-CSF易得到，不會(huì)刺激體內(nèi)產(chǎn)生抗體而影響療效，可以多次重復(fù)使用，因此成本低，安全性高。
本發(fā)明采用急性髓性白血病細(xì)胞株HL60，其細(xì)胞膜上可以大量表達(dá)GM-CSF受體，結(jié)合位點(diǎn)為322個(gè)/細(xì)胞。
本發(fā)明采用戊二醛交聯(lián)法，以戊二醛作偶聯(lián)劑，使其兩端的醛基分別與磷脂的NH2和蛋白質(zhì)的NH2縮合，將已制好的脂質(zhì)體和導(dǎo)向物質(zhì)相聯(lián)。此方法方便高效，其反應(yīng)條件溫和，免疫物質(zhì)活性高。
本發(fā)明采用DHAQ脂質(zhì)體表面聯(lián)接導(dǎo)向物質(zhì)制成的DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質(zhì)體，其脂質(zhì)體粒徑為160-220，此粒徑的脂質(zhì)體細(xì)胞毒作用強(qiáng)。其原因是在導(dǎo)向物質(zhì)和被包封藥物相同的條件下，靶向脂質(zhì)體對(duì)細(xì)胞的殺傷作用主要受脂質(zhì)體的粒徑和被包封的藥物量決定，前者主要是影響脂質(zhì)體顆粒與細(xì)胞碰撞結(jié)合的機(jī)率，小顆粒脂質(zhì)體具有較高的運(yùn)動(dòng)速度和碰撞機(jī)率游離于受體-配體結(jié)合，后者主要是決定單位導(dǎo)向物質(zhì)的效應(yīng)。在脂質(zhì)體粒徑無(wú)顯著差異的條件下，較大顆粒的脂質(zhì)體包封的藥物更多與小顆粒相比具有更高的單位效應(yīng)，故能發(fā)揮更強(qiáng)的殺傷作用。因此，我們選擇超聲30min制備粒徑為約為200nm脂質(zhì)體以達(dá)到更好的細(xì)胞殺傷作用。
當(dāng)然選擇不同的抗急性髓性白血病的藥物與GM-CSF組成的藥物脂質(zhì)體，達(dá)到相同或近似的細(xì)胞毒作用，有不同的粒徑。
脂質(zhì)體作為抗癌藥物載體，具有能增加與癌細(xì)胞的親和力、克服耐藥性、增加藥物被癌細(xì)胞的攝取、降低用藥劑量、提高療效、降低毒副作用的特點(diǎn)。
GM-CSF是粒單核細(xì)胞系祖細(xì)胞增殖分化的正向調(diào)節(jié)因子，它能刺激髓系造血細(xì)胞生長(zhǎng)和分化，增強(qiáng)成熟粒細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞的功能。GM-CSF通過(guò)結(jié)合細(xì)胞表面的同源受體發(fā)揮作用。
本發(fā)明在進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)的同時(shí)，還進(jìn)行了GM-CSF的導(dǎo)向性的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。由于DHAQ-GM-CSF靶向脂質(zhì)體上的GM-CSF能夠發(fā)揮導(dǎo)向作用，而該導(dǎo)向效應(yīng)是通過(guò)配體-受體結(jié)合而起效的，如果預(yù)先加入飽和量的GM-CSF占領(lǐng)HL60細(xì)胞表面的受體，則后續(xù)加入的DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質(zhì)體的特異性殺傷作用將被阻斷，僅余留脂質(zhì)體的非特異性殺傷作用。


圖1-1為電鏡下本發(fā)明的脂質(zhì)體；圖1-2為電鏡下本發(fā)明的脂質(zhì)體；圖1-3為電鏡下本發(fā)明的脂質(zhì)體；圖2-1電鏡下調(diào)亡的HL60細(xì)胞；圖2-2電鏡下調(diào)亡的HL60細(xì)胞；圖3-1流式細(xì)胞術(shù)測(cè)GM-CSF活性保留率；圖3-2流式細(xì)胞術(shù)測(cè)GM-CSF活性保留率；圖3-3流式細(xì)胞術(shù)測(cè)GM-CSF活性保留率；圖4-1Annexin V/PI雙染法測(cè)HL60細(xì)胞的凋亡率；圖4-2Annexin V/PI雙染法測(cè)HL60細(xì)胞的凋亡率；圖4-3Annexin V/PI雙染法測(cè)HL60細(xì)胞的凋亡率；圖4-4Annexin V/PI雙染法測(cè)HL60細(xì)胞的凋亡率；圖5不同濃度的DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質(zhì)體、DHAQ脂質(zhì)體、DHAQ對(duì)HL60細(xì)胞的殺傷作用趨勢(shì)圖(24h)；圖6不同濃度的DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質(zhì)體、DHAQ脂質(zhì)體、DHAQ對(duì)HL60細(xì)胞的殺傷作用趨勢(shì)圖(48h)。
具體實(shí)施例方式
為了進(jìn)一步說(shuō)明DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質(zhì)體及制備方法，參照下列實(shí)施例說(shuō)明，這些實(shí)施例是為了進(jìn)一步進(jìn)行解釋?zhuān)灰匀魏畏绞较拗票景l(fā)明。
1.材料HL60細(xì)胞，由上海生物研究所提供。
2.試劑DHAQ原料藥購(gòu)自重慶凱林制藥有限公司；GM-CSF原料藥由北京北醫(yī)聯(lián)合醫(yī)藥有限公司提供，其結(jié)合位點(diǎn)平均為322個(gè)/HL60細(xì)胞[16]；膽固醇、卵磷脂、MTT、DMSO購(gòu)自Sigma公司；PE-抗人GM-CSF抗體及對(duì)照購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司；FTIC-Annexin-V購(gòu)自北京晶美生物技術(shù)有限公司；乙醚、無(wú)水乙醇、戊二醛購(gòu)自重慶醫(yī)藥化玻分公司，均為分析純；胎牛血清購(gòu)自杭州四季青工程有限公司。
細(xì)胞培養(yǎng)HL60細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)為10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，置于37℃，體積分?jǐn)?shù)為5％的CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
實(shí)施例1 DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質(zhì)體的制備、純化和鑒定1.DHAQ脂質(zhì)體的制備采用逆向蒸發(fā)法制備DHAQ脂質(zhì)體(參見(jiàn)文獻(xiàn)Szoke F.Procedure forpreparation of liposomes with large internal aqueous space and highcapture by reverse-phase evaporation[J].Proc Natl Acad Sci USA，1978，75(9)4194)。
取10mgDHAQ原料藥，溶于20ml蒸餾水中備用，另取卵磷脂(Pc)2g、膽固醇(Cho)0.4g(Pc∶Cho＝1∶0.2，W/W)，加入60ml乙醚，攪拌至完全溶解，將DHAQ溶液緩慢加入Pc和Cho的乙醚溶液中(WPc∶WDHAQ＝200∶1，有機(jī)相∶水相＝3∶1)，邊加邊攪拌，再置于超聲振蕩儀中振蕩約30min，至水相和有機(jī)相混合均勻，呈藍(lán)色乳狀懸液。乳狀液以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸發(fā)40min，30℃，中間加入PBS緩沖液15ml。上述操作均在20℃室溫下進(jìn)行。
2.DHAQ脂質(zhì)體的純化采用離心法分離脂質(zhì)體和游離DHAQ水溶液。
將上述步驟1中制得的乳狀液以10000rpm的轉(zhuǎn)速離心20min，取脂質(zhì)體層用于靶向脂質(zhì)體的制備，水溶液層用于包封率的測(cè)定。
3.DHAQ脂質(zhì)體包封率的測(cè)定用下列公式(1)計(jì)算包封率Qw％＝[(W總-W游)/W總]×100％(1)式中Qw％為包封率；W總為DHAQ的總投樣量；W游為未包封的游離DHAQ含量W游的測(cè)定參照中國(guó)藥典第二部中DHAQ和注射用DHAQ的含量測(cè)定項(xiàng)下的規(guī)定，采用比色法進(jìn)行測(cè)定(參見(jiàn)中國(guó)藥典第二部附錄IIB[S]，附錄27.)，具體操作如下取DHAQ原料藥10mg，精密稱(chēng)定，置于100ml量瓶中，加水1ml溶解，用無(wú)水乙醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取5ml，置50ml量瓶中，加0.1mol/l的鹽酸溶液5ml，加無(wú)水乙醇稀釋至刻度，搖勻，照比色法，在663nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，DHAQ的吸收系數(shù)為570，代入公式(2)計(jì)算A＝ECL (2)式中A為吸光度、E為吸收系數(shù)、C為100ml溶液中所含的被測(cè)物質(zhì)的克數(shù)，L為液層厚度(單位cm).
連續(xù)測(cè)定三個(gè)樣品的C值，計(jì)算平均數(shù)即為對(duì)照品溶液的濃度，換算成對(duì)照品的含量。
精密量取實(shí)施例2中2步驟得到的水溶液1ml，置于50ml量瓶中，用無(wú)水乙醇分次洗滌量器，洗滌并入量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，照上述方法，自“精密量取5ml”起，依法測(cè)定，照公式(3)計(jì)算含量CX＝(AX/AR)/CR(3)式中CX為待測(cè)樣品溶液的濃度、AX為待測(cè)樣品溶液的吸光度、CR為對(duì)照品溶液的濃度、AR為對(duì)照品溶液的吸光度。
連續(xù)測(cè)定三瓶，計(jì)算平均數(shù)，即得1ml水溶液中游離DHAQ的含量，換算成實(shí)施例2中2步驟水溶液中游離DHAQ的含量W游。上式中CX為已知，AX為與待測(cè)樣品同時(shí)測(cè)得的對(duì)照品的吸光度。
4.DHAQ靶向藥物脂質(zhì)體的制備采用戊二醛交聯(lián)法制備靶向脂質(zhì)體(參見(jiàn)文獻(xiàn)汪冰，楊翰儀.單克隆抗體偶聯(lián)脂質(zhì)體的制備及其與胃癌細(xì)胞特異結(jié)合研[J].沈陽(yáng)藥學(xué)院學(xué)報(bào)，1993，11(1)17)。
取10％的DHAQ脂質(zhì)體溶液13ml，加入25％的戊二醛13ml，室溫20℃，放置10min，過(guò)量的戊二醛用生理鹽水透析4h除去，換液2次，加入1mgGM-CSF原料藥，4℃過(guò)夜。得到DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質(zhì)體。
5.DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質(zhì)體的純化采用蔗糖密度梯度離心法分離游離GM-CSF和靶向脂質(zhì)體(參見(jiàn)文獻(xiàn)汪冰，楊翰儀.用密度梯度離心法分離脂質(zhì)體-IG復(fù)合物與游離IG[J].中華物理醫(yī)學(xué)雜志，1993，1(15)39)。
取上述制得的DHAQ-GM-CSF靶向脂質(zhì)體0.4ml，加入0.8ml蔗糖溶液(30％，W/W)混勻，放入離心管中，加入2.4ml蔗糖溶液(15％，W/W)作為第二層，最上層加0.4ml緩沖液作為封閉層，4℃，30000rpm，離心30min，從上到下吸出，封閉層和脂質(zhì)體層各0.4ml，脂質(zhì)體層再按上述方法梯度離心一次。
6.偶聯(lián)率的測(cè)定采用紫外分光光度法測(cè)定偶聯(lián)率(參見(jiàn)文獻(xiàn)牛榮麗，薛弘燮，李志良.阿苯達(dá)唑靶向脂質(zhì)體的制備[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，24(1)60-62)。
分離后的靶向脂質(zhì)體為脂質(zhì)體-蛋白質(zhì)復(fù)合物，用紫外分光光度法測(cè)定其中蛋白質(zhì)的含量即為偶聯(lián)上的GM-CSF量，具體操作如下取純化后的DHAQ-GM-CSF靶向脂質(zhì)體加入比色杯中，在280nm波長(zhǎng)處測(cè)定其A值，連續(xù)測(cè)定三個(gè)樣本，計(jì)算平均值，再代入公式(4)計(jì)算偶聯(lián)率＝(純化后DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質(zhì)體的A值/純化前DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質(zhì)體的A值)×100％ (4)7.DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質(zhì)體中GM-CSF活性保留率的測(cè)定采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定靶向脂質(zhì)體中GM-CSF活性的保留率。
取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HL60細(xì)胞，調(diào)成密度為5×108個(gè)/l的細(xì)胞懸液，接種于6孔板上，每孔加入細(xì)胞懸液3ml，實(shí)驗(yàn)分為3組DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質(zhì)體組、GM-CSF組和空白對(duì)照組。
DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質(zhì)體組加入濃度為2.5μg/ml的靶向脂質(zhì)體溶液300μl；GM-CSF組加入濃度為0.9μg/ml的GM-CSF溶液300μl(等于DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質(zhì)體中GM-CSF的濃度)；空白對(duì)照組加入等體積生理鹽水。
3組于CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)2h后，2000rpm離心10min，棄培養(yǎng)液，用PBS洗滌2次，2000rpm離心20min，棄上清液，收集細(xì)胞，加入PE-抗人GM-CSF抗體，0.5h后用PBS洗滌2次，流式細(xì)胞儀分析。
結(jié)果DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質(zhì)體的包封率81％；多為單層脂質(zhì)體，粒徑170-220nm，參見(jiàn)圖1-1-圖1-3；偶聯(lián)率41.7％；活性保留率75.1％，參見(jiàn)圖3-1-圖3-3。
采用濃度為10％戊二醛既可達(dá)到較理想的偶聯(lián)率(41.7％)，又可盡量避免戊二醛對(duì)導(dǎo)向物質(zhì)的影響以及戊二醛對(duì)后續(xù)透析實(shí)驗(yàn)帶來(lái)的不便。
實(shí)施例2.細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)采用MTT法。取無(wú)藥培養(yǎng)1周的HL60細(xì)胞，配成5×104/ml的細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，在配制細(xì)胞懸液時(shí)盡量使細(xì)胞成單個(gè)細(xì)胞，在接種時(shí)不斷輕輕振搖細(xì)胞懸液，以使每孔加入的細(xì)胞數(shù)一致，每孔加入細(xì)胞懸液200μl(1×104個(gè)細(xì)胞/孔)。
實(shí)驗(yàn)分為四組①DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質(zhì)體組依次加入濃度(按DHAQ的含量計(jì))為0.0025μg/ml、0.025μg/ml、0.25μg/ml、2.5μg/ml、25μg/ml的靶向脂質(zhì)體溶液，20μl/孔。
②DHAQ脂質(zhì)體組依次加入濃度(按DHAQ的濃度計(jì))為0.0025μg/ml、0.025μg/ml、0.25μg/ml、2.5μg/ml、25μg/ml的脂質(zhì)體溶液，20μl/孔。
③DHAQ組依次加入濃度為0.0025μg/ml、0.025μg/ml、0.25μg/ml、2.5μg/ml、25μg/ml的DHAQ溶液，20μl/孔。
④空白對(duì)照組加入等體積的生理鹽水。每個(gè)濃度組設(shè)3個(gè)平行孔。
將96孔板置于振蕩器上振蕩20min后置于CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)24h、48h后，吸去培養(yǎng)液，加入無(wú)血清的培養(yǎng)液200μl/孔和濃度為50mg/ml的MTT溶液20μl/孔，輕輕振蕩培養(yǎng)板，放回CO2孵箱中孵育4h，吸盡每孔中的液體，加入DMSO150μl/孔，于振蕩器上振蕩20min，使形成的紫色結(jié)晶充分溶解，用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔的A值(波長(zhǎng)為490nm)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取每組每一濃度的均值按下式求細(xì)胞存活率細(xì)胞存活率＝(處理組A490nm值/對(duì)照組A490nm值)×100％細(xì)胞抑制率＝1-細(xì)胞存活率根據(jù)線(xiàn)性方程求得IC50。
結(jié)果經(jīng)DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質(zhì)體、DHAQ脂質(zhì)體、DHAQ處理24h、48h后，HL60細(xì)胞存活率參見(jiàn)表1和表2。
表1不同濃度的DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質(zhì)體、DHAQ脂質(zhì)體、DHAQ對(duì)HL60細(xì)胞的殺傷作用(24h)(x±s)

注以SAS軟件包進(jìn)行兩樣本均數(shù)間的q檢驗(yàn)，a＝0.05*與相應(yīng)濃度的DHAQ組比較，p＜0.05；#與相應(yīng)濃度的DHAQ-GM-CSF靶向脂質(zhì)體組比較，p＜0.05。
表2不同濃度的DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質(zhì)體、DHAQ脂質(zhì)體、DHAQ對(duì)HL60細(xì)胞的殺傷作用(48h)(x±s)

注以SAS軟件包進(jìn)行兩樣本均數(shù)間的q檢驗(yàn)，a＝0.05*與相應(yīng)濃度的DHAQ組比較，p＜0.05；#與相應(yīng)濃度的DHAQ-GM-CSF靶向脂質(zhì)體組比較，p＜0.05。
3種藥物作用24h后，在濃度＜0.0025μg/ml時(shí)，其細(xì)胞毒作用無(wú)顯著性差異；在濃度為0.025μg/ml時(shí)，DHAQ-GM-CSF靶向脂質(zhì)體組的細(xì)胞毒作用顯著強(qiáng)于DHAQ脂質(zhì)體組和DHAQ組(p＞0.05)。而后兩者的作用之間無(wú)顯著性差異(p＞0.05)，當(dāng)濃度≥0.25μg/ml時(shí)，DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質(zhì)體組和DHAQ脂質(zhì)體組的細(xì)胞毒作用均顯著強(qiáng)于DHAQ組(p＞0.05)，其中DHAQ-GM-CSF靶向脂質(zhì)體組的細(xì)胞毒作用比DHAQ脂質(zhì)體更強(qiáng)，且二者的差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。
3種藥物作用48h后，當(dāng)濃度≥0.0025μg/ml時(shí)，DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質(zhì)體組和DHAQ脂質(zhì)體組的細(xì)胞毒作用均顯著強(qiáng)于DHAQ組(p＜0.05)，其中DHAQ-GM-CSF靶向脂質(zhì)體組的細(xì)胞毒作用比DHAQ脂質(zhì)體更強(qiáng)，且二者的差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05＝。
參見(jiàn)圖5和圖6。DHAQ-GM-CSF靶向脂質(zhì)體、DHAQ脂質(zhì)體和DHAQ對(duì)HL60細(xì)胞作用24h的IC50分別是3.04μg/ml、9.33μg/ml、18.15μg/ml；作用48h的IC50分別是0.87μg/ml、3.02μg/ml、6.69μg/ml本實(shí)驗(yàn)采用HL60細(xì)胞株，是一種急性髓性白血病細(xì)胞株，其細(xì)胞膜上大量表達(dá)GM-CSF受體，結(jié)合位點(diǎn)為322個(gè)/細(xì)胞。
實(shí)施例3 DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質(zhì)體中GM-CSF導(dǎo)向作用驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)在本發(fā)明中，我們?cè)谶M(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)的同時(shí)進(jìn)行了GM-CSF的導(dǎo)向性的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。該實(shí)驗(yàn)說(shuō)明DHAQ-GM-CSF靶向脂質(zhì)體上的GM-CSF能夠發(fā)揮導(dǎo)向作用，其導(dǎo)向效應(yīng)是通過(guò)配體-受體結(jié)合而起效的，如果預(yù)先加入飽和量的GM-CSF占領(lǐng)HL60細(xì)胞表面的受體，則后續(xù)加入的DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質(zhì)體的特異性殺傷作用將被阻斷，僅余留脂質(zhì)體的非特異性殺傷作用。采用MTT法與實(shí)施例2同時(shí)進(jìn)行。
方法同實(shí)施例2。
實(shí)驗(yàn)分為5個(gè)劑量組每組首先加入7.5ng飽和量的GM-CSF(含3×1011個(gè)GM-CSF分子，是每孔細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)的104倍)，置于CO2孵箱中孵育1h，然后加入濃度依次為0.0025μg/ml、0.025μg/ml、0.25μg/ml、2.5μg/ml、25μg/ml的DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質(zhì)體溶液20μl/孔，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行孔，按照實(shí)施例3中的方法測(cè)定每孔的A490nm值，求細(xì)胞存活率，再與實(shí)施例3中DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質(zhì)體組的結(jié)果作對(duì)比。
結(jié)果，預(yù)先加入飽和量的GM-CSF可阻斷DHAQ-GM-CSF靶向脂質(zhì)體對(duì)HL60細(xì)胞的毒性作用，24h和48h時(shí)各濃度組的阻斷實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞存活率均顯著高于相應(yīng)濃度的DHAQ-GM-CSF組(p＜0.05)。
實(shí)施例5 透射電鏡觀(guān)察1.DHAQ脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)和粒徑分布將DHAQ脂質(zhì)體原液稀釋80倍，滴在有膜銅網(wǎng)上，陰干，滴加1％醋酸雙氧鈾溶液，靜置5min，濾紙吸干，H600透射電鏡下放大6萬(wàn)倍觀(guān)察其形態(tài)并攝影。
2.細(xì)胞形態(tài)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HL60細(xì)胞，調(diào)成密度為5×108個(gè)/l，接種于6孔板上，每孔加入細(xì)胞懸液3ml。
實(shí)驗(yàn)分為2組DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質(zhì)體組和空白對(duì)照組。
DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質(zhì)體組加入濃度為2.5μg/ml的靶向脂質(zhì)體溶液300μl；空白對(duì)照組加入等體積生理鹽水。
兩組于CO2孵箱中培養(yǎng)24h，2000rpm離心10min，棄培養(yǎng)液，用PBS洗滌2次，2000rpm離心20min，棄上清液，4℃預(yù)冷的3.5％戊二醛沿管壁緩慢加入，覆蓋沉淀的細(xì)胞，固定1h，用探針撥離細(xì)胞團(tuán)塊，凝膠包埋，鋨酸染色，超薄切片，H600透射電鏡下觀(guān)察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變及凋亡細(xì)胞形態(tài)特征。
結(jié)果DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質(zhì)體作用24h后的HL60細(xì)胞，經(jīng)瑞特染色，在光鏡下可見(jiàn)細(xì)胞胞漿濃縮，染色質(zhì)變粗、核濃縮、核碎裂等細(xì)胞凋亡的形態(tài)。透射電鏡下可見(jiàn)大量壞死細(xì)胞和凋亡細(xì)胞，凋亡細(xì)胞膜和線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)完整，染色質(zhì)濃縮，沿核膜聚集成塊狀和新月?tīng)睿纬纱罅康蛲鲂◇w。參見(jiàn)圖2-1-圖2-2。
3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)早期凋亡情況采用AnnexinV/PI雙染法。
實(shí)驗(yàn)分為4個(gè)組DHAQ脂質(zhì)體組、DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質(zhì)體組、DHAQ組、空白對(duì)照組。
DHAQ脂質(zhì)體組加入濃度為2.5μg/ml的DHAQ脂質(zhì)體液300μl；DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質(zhì)體組加入濃度為2.5μg/ml的靶向脂質(zhì)體溶液300μl；DHAQ組加入濃度為2.5μg/ml的DHAQ液300μl；空白對(duì)照組加入等體積生理鹽水。
細(xì)胞處理方法同實(shí)施例2中的步驟7，培養(yǎng)6小時(shí)后棄培養(yǎng)液，收集細(xì)胞，孵育緩沖液洗1次，用100μl的AnnexinV標(biāo)記液重懸細(xì)胞，室溫下孵育10-15min，沉淀細(xì)胞，孵育緩沖液洗1次，加入熒光(SA-Flous)溶液，4℃下孵育20min，離心去上清，孵育緩沖液洗滌1次，加入400μl孵育緩沖液洗，流式細(xì)胞儀分析。
經(jīng)DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質(zhì)體、DHAQ脂質(zhì)體、DHAQ作用24h后的HL60細(xì)胞中出現(xiàn)凋亡細(xì)胞，DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質(zhì)體組的凋亡率(25.05％)較DHAQ脂質(zhì)體組(15.33％)和DHAQ組(6.64％)明顯提高。參見(jiàn)圖4-1-圖4-4。
結(jié)論DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質(zhì)體對(duì)HL60細(xì)胞的細(xì)胞毒作用具有劑量依賴(lài)性。一定濃度的DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質(zhì)體可以誘導(dǎo)HL60細(xì)胞發(fā)生凋亡。DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質(zhì)體對(duì)HL60細(xì)胞明顯的細(xì)胞毒作用顯著強(qiáng)于DHAQ脂質(zhì)體和DHAQ，將DHAQ制備成靶向脂質(zhì)體具有提高被包封藥物的療效和降低毒性的作用，有助于提高患者的耐受性，使DHAQ更好地發(fā)揮抗白血病作用，DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質(zhì)體作為免疫導(dǎo)向化療藥物治療白血病具有可行性，對(duì)AML具有治療作用。
DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質(zhì)體在制備、純化和鑒定方法方面具有可行性。本發(fā)明具有較高的包封率、偶聯(lián)率和活性保留率，是一種理想的免疫導(dǎo)向治療制劑，具有廣泛的臨床應(yīng)用和推廣前景。
采用本發(fā)明方法用脂質(zhì)體包封不同的抗急性髓性白血病的藥物表面聯(lián)接GM-CSF得到包封多種化療藥物的靶向藥物脂質(zhì)體，可以達(dá)到上述同樣的效果，因而具有廣泛的參考應(yīng)用價(jià)值。
權(quán)利要求
1.一種抗急性髓性白血病的GM-CSF靶向藥物脂質(zhì)體，由在脂質(zhì)體表面聯(lián)接具有主動(dòng)靶向性的細(xì)胞因子導(dǎo)向物和脂質(zhì)體內(nèi)一種或幾種抗急性髓性白血病的藥物組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗急性髓性白血病的GM-CSF靶向藥物脂質(zhì)體，其特征在于抗急性髓性白血病的藥物包括抗腫瘤抗生素或烷化劑類(lèi)抗腫瘤藥或影響核酸生物合成的抗腫瘤藥或影響蛋白質(zhì)合成的抗腫瘤藥或拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑或生物毒素中的一種或/和幾種。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗急性髓性白血病的GM-CSF靶向藥物脂質(zhì)體，其特征在于抗急性髓性白血病的藥物包括米托蒽醌、柔紅霉素、阿霉素、阿克拉霉素、刺孢酶素、吡南阿霉素、阿糖胞苷、氟達(dá)拉賓、吉西他賓、氟尿嘧啶、氨甲蝶呤、硫唑嘌呤、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春花堿、拓?fù)涮婵?、足葉一甙、VM26、環(huán)磷酰氨、異環(huán)磷酰氨、順鉑、卡鉑、卡氮芥、馬法蘭、馬利蘭、羥基脲、紫山醇。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗急性髓性白血病的GM-CSF靶向藥物脂質(zhì)體，其特征在于所述的細(xì)胞因子導(dǎo)向物為粒單細(xì)胞集落刺激因子。
5.制備權(quán)利要求1所述的抗急性髓性白血病的GM-CSF靶向藥物脂質(zhì)體的方法，包括以下步驟1).制備抗腫瘤藥物脂質(zhì)體；2).測(cè)定脂質(zhì)體包封率；3).制備相應(yīng)的GM-CSF靶向脂質(zhì)體；4).GM-CSF靶向脂質(zhì)體的純化；5).GM-CSF靶向脂質(zhì)體中GM-CSF活性的測(cè)定。
6.權(quán)利要求1所述的抗急性髓性白血病的GM-CSF靶向藥物脂質(zhì)體，用于治療急性髓性白血病的制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗急性髓性白血病的GM－CSF靶向藥物脂質(zhì)體及制備方法，它由在脂質(zhì)體表面聯(lián)接具有主動(dòng)靶向性的細(xì)胞因子導(dǎo)向物和脂質(zhì)體內(nèi)抗急性髓性白血病的藥物組成。本發(fā)明的體外模型MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其對(duì)急性髓性白血病細(xì)胞株HL60的細(xì)胞毒作用和對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明藥物的特異靶向性好，療效高，毒副作用小，提高了患者對(duì)化療的耐受性，可以多次重復(fù)使用，并且成本低，安全性高，為用靶向脂質(zhì)體包封藥物治療惡性腫瘤，提供了研究基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)A61K45/00GK1806794SQ20051005726
公開(kāi)日2006年7月26日 申請(qǐng)日期2005年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月12日
發(fā)明者婁世峰, 張穎, 陳林, 陳姝, 翁春嵐, 彭薇, 周慷, 鄧建川, 羅云 申請(qǐng)人:重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院