專利名稱：以c的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種以C60為載體的骨靶向治療藥物C60-AEDP(1-氨基-1-甲基-1，1-二膦酸)及其在制備治療骨疾病的藥物中的應(yīng)用。
骨組織是一個(gè)代謝旺盛的器官。骨代謝的基本現(xiàn)象是重建，骨重建是一個(gè)復(fù)雜的過程，主要包括骨細(xì)胞的形成和破骨細(xì)胞的骨吸收。破骨細(xì)胞清除舊礦物質(zhì)，成骨細(xì)胞形成類骨質(zhì)并進(jìn)行礦化，以維持骨的形態(tài)、骨量和骨的整體強(qiáng)度。在人的一生，老的骨組織不停地被清除，新的骨組織不停地建成并替代被清除的老的骨組織。
由于年齡和疾病問題，骨的生命過程會(huì)受到影響，相應(yīng)的一系列骨類疾病發(fā)生，除炎癥及腫瘤外，發(fā)育異常、物質(zhì)代謝障礙及外傷都很常見。
對(duì)健康的年輕人來說，新骨產(chǎn)生的速度和舊骨破損的速度大致平衡，在老年人身上，這個(gè)平衡移向了舊骨被破損的一邊。因此，老年人容易患骨質(zhì)疏松癥之類的骨質(zhì)虛弱疾病。一些癌癥往往會(huì)發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，最后產(chǎn)生難忍的劇痛，這主要由兩方面引起，腫瘤壓迫骨神經(jīng)，另一方面腫瘤細(xì)胞會(huì)分泌一種叫PTHrP的蛋白，這種蛋白促使破骨細(xì)胞的形成，在骨骼局部破骨細(xì)胞非?；钴S，產(chǎn)生病灶，嚴(yán)重的會(huì)引起全身性高血鈣癥。
Paget’s病則是表現(xiàn)為骨的吸收過程和骨的形成過程都特別加強(qiáng)，某一時(shí)期以骨吸收占優(yōu)勢(shì)，另一時(shí)期又以骨質(zhì)生成占優(yōu)勢(shì)，兩者交替進(jìn)行，導(dǎo)致同一骨骼內(nèi)有不同的病變，最嚴(yán)重的結(jié)果是轉(zhuǎn)變?yōu)楣侨饬觥?br> 另外還有一系列疾病會(huì)引起骨吸收和骨形成之間失去平衡，例如甲狀腺功能亢進(jìn)和骨巨細(xì)胞瘤等，患有這類疾病的人往往有共同的癥狀—骨痛。因此保持骨骼的正?；顒?dòng)很重要。
上述的條件和因素會(huì)引起負(fù)面的骨丟失和必須通過加速骨生長(zhǎng)來替代丟失的骨。因此減少骨丟失或促進(jìn)骨形成的化合物對(duì)治療骨疾病是有用的。目前對(duì)于骨質(zhì)疏松癥、轉(zhuǎn)移性骨痛、Patet’s病及其他與骨代謝有關(guān)的疾病有許多治療方法，例如，不同種化學(xué)或激素治療已經(jīng)用于骨疾病的治療。激素如雌激素能夠促進(jìn)骨形成，但是不幸的是，因?yàn)榇萍に貢?huì)引起癌癥和其他副作用，沒有廣泛地被指定用于骨病治療。因此使用科技發(fā)展地最新成果研制用于治療與骨代謝有關(guān)地骨疾病的新藥物引起世界各國(guó)科技工作者的高度興趣。
一項(xiàng)最近被批準(zhǔn)用于骨疾病治療的是一類二磷酸鹽類化合物。二磷酸鹽與骨結(jié)合，降低破骨細(xì)胞的活性并且促使新骨形成，其用于臨床有以下特點(diǎn)1)不僅能抑制骨吸收，還能增加骨量，使損失的骨組織恢復(fù)；2)能促使骨小梁的重建，也能減少陷窩深度。現(xiàn)在人工合成的二磷酸鹽類藥物已有300多種，其中有十種已進(jìn)入或正在進(jìn)入臨床，用于治療骨溶解性病變。
HEDP屬于二膦酸鹽，二膦酸鹽是近二十年來發(fā)展起來的用于治療骨和鈣代謝疾病的新藥物，不僅能抑制內(nèi)源性骨吸收，還能抑制由甲狀旁腺素、前列腺素、1，25-(OH)2D3等誘導(dǎo)的骨吸收(參見陳一心，韓祖斌，丁文玉，等。中華骨科雜志，1995，15298-301)。在此類藥物中，HEDP為第一代，長(zhǎng)期應(yīng)用會(huì)阻滯正常骨組織礦化，快速靜脈注射可能會(huì)引起腎功能下降。為了提高療效，減少毒副作用，藥學(xué)家合成了一系列二膦酸鹽，AEDP(1-氨基-亞乙基-1，1-二膦酸)為第二代二膦酸鹽，由于1位C上帶有一個(gè)氨基，發(fā)現(xiàn)對(duì)骨病的治療效果要比只帶羥基的HEDP好，而且長(zhǎng)期應(yīng)用不會(huì)阻滯正常骨組織礦化(參見Herbert Fleisch.Drugs，1991，42(6)919-944)。其中HEDP和AEDP的結(jié)構(gòu)式如下 二膦酸鹽類藥物由于具有不同程度的刺激性，靜脈注射也會(huì)產(chǎn)生注射部位不同程度的損傷，臨床通常口服用藥。但是它們的口服利用度很低，例如口服阿倫膦酸鈉(alendronate)后，生物利用度只有0.7％。二磷酸鹽類藥物口服生物利用度低主要是由于它們的極性大，脂溶性差，不能通過上皮細(xì)胞屏障進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，只能經(jīng)過上皮細(xì)胞間的緊密連接，經(jīng)細(xì)胞旁轉(zhuǎn)運(yùn)途徑吸收，當(dāng)它們的分子量相對(duì)較大障礙了這種轉(zhuǎn)運(yùn)。所以增加二磷酸鹽類藥物的脂溶性及其降低二磷酸鹽在靜脈注射時(shí)對(duì)肌體的刺激和損傷有望提高利用度，從而減少用藥量，降低因高劑量造成的生物毒性，同時(shí)也能減輕病人的減輕病人的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，成為研制新一代二磷酸鹽藥物的關(guān)鍵。
富勒烯中典型成員C60具有特殊的中空特殊結(jié)構(gòu)，其直徑為0.71nm。富勒烯的特殊結(jié)構(gòu)賦予了它們?cè)S多奇異性質(zhì)，由于富勒烯的化學(xué)性質(zhì)和生物活性，預(yù)期在醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用潛力。C60有30個(gè)雙鍵，通過多種反應(yīng)可與二磷酸鹽類藥物連接。C60是個(gè)非極性分子，利用C60基團(tuán)的疏水性，可望提高二磷酸鹽類藥物的脂溶性，從而提高生物利用度；其次C60衍生物對(duì)皮膚無刺激無毒性，在體內(nèi)無積累，C60載帶二磷酸鹽的復(fù)合物可能降低刺激和損傷；最后，二磷酸鹽類藥物是通過抑制破骨細(xì)胞的形成和活性，達(dá)到抑制骨吸收的。從目前揭示的證據(jù)表明，氧自由基幾乎和人類大部分疾病有關(guān)系。例如神經(jīng)系統(tǒng)中各種疾病都有氧自由基參與；致癌、促癌和癌的形成每一步都有自由基的參與，那么破骨細(xì)胞性骨吸收時(shí)有可能有自由基的產(chǎn)生。C60有很強(qiáng)的吸自由基的能力，C60可能對(duì)破骨細(xì)胞的形成和活性產(chǎn)生影響。
b.C60-AEDP的合成在石英反應(yīng)瓶中，加入1.4ml 4M NaOH，1ml 10％丁基氫氧化銨，再加50ml 1ml/mg的C60(購(gòu)自武漢大學(xué))-甲苯溶液，在加熱及500W高壓汞燈(亞明照明有限公司)的照射下，滴加5ml 10mg/ml的AEDP。繼續(xù)反應(yīng)8小時(shí)，甲苯層呈無色，水相為黑棕色不透明溶液。取水相透析48小時(shí)后除去不溶物，濃縮并置于105℃下烘干。在光照反應(yīng)合成C60-AEDP過程中，有不少黑色有光澤的不溶物產(chǎn)生。有研究表明認(rèn)為富勒烯固體在激光照射下隨時(shí)間發(fā)生裂解形成石墨和無定型碳，同時(shí)發(fā)生C60的光致聚合效應(yīng)。本合成反應(yīng)是在溶液中，而且是在紫外光照射進(jìn)行的，條件是與前者有所不同，但是還是有可能發(fā)生相同的反應(yīng)，不溶物是否是石墨或無定型碳需要確定，由于合成中不溶物量很少，很難收集，目前還沒作出定論。
干燥后的樣品用ICAP-900型等離子體測(cè)產(chǎn)物中P的含量，測(cè)試條件功率1.1KW，反射功率＜5W；頻率27.120MHZ；炬焰高度16mm；霧化器直角霧化器，壓力20PSi，蠕動(dòng)泵輸入，提升量1.35ml/min，冷卻氣20L/min。最后測(cè)得產(chǎn)物中的P的含量為4.846％。按每個(gè)C60接上一個(gè)AEDP來算，P的含量應(yīng)為6.904％。在激光照射下，固態(tài)C60會(huì)發(fā)生光致聚合作用，在光子激發(fā)下，C60壽命很短的單重激發(fā)態(tài)向長(zhǎng)壽命的三重態(tài)躍遷，C60高速旋轉(zhuǎn)，當(dāng)兩個(gè)C60的雙鍵平行時(shí)，在光子作用下，能量高的C60雙鍵形成懸掛鍵，兩個(gè)C60聚合形成兩個(gè)單鍵，從而形成二聚物，隨著光照的進(jìn)行，可以形成四聚物、八聚物等等。
實(shí)施例2 C60-AEDP的合成a.AEDP的合成參照實(shí)施例1。
b.C60-AEDP的合成在石英反應(yīng)瓶中，加入1.4ml 4M NaOH，1ml 10％四甲基氫氧化銨，再加50ml 1ml/mg的C60-苯溶液，在加熱及500W高壓汞燈的照射下，滴加5ml 10mg/ml的AEDP。繼續(xù)反應(yīng)8小時(shí)，甲苯層呈無色，水相為黑棕色不透明溶液。取水相透析48小時(shí)后除去不溶物，濃縮并置于105℃下烘干，得到產(chǎn)物。
實(shí)施例399mTc-C60-AEDP的合成在反應(yīng)器中加入3ml 25mg/ml的C60-AEDP，再加入1.5ml10mg/ml的Vc和0.75ml5mg/ml的氯化亞錫，調(diào)pH至6，加入約20mCi的99mTcO4-，在沸水浴中反應(yīng)20分鐘后，調(diào)pH至7，加入3ml生理鹽水，紙層析分析結(jié)果顯示標(biāo)記體系中基本無游離的99mTcO4-存在，放射性主要其中在前沿(0.9％生理鹽水)，標(biāo)記率達(dá)90％。
實(shí)施例4取昆明種小白鼠30只，隨機(jī)分成6組，每組5只，取已標(biāo)記好的99mTc-C60-AEDP按約200μl/只，分別注入小鼠尾靜脈中。在給藥后不同的時(shí)間階段，處死并剖重要器官和組織，分別稱重并測(cè)放射性計(jì)數(shù)，計(jì)算每克臟器攝取的放射性活度占注射量的百分比(％ID/g)。
化合物在小鼠體內(nèi)的分布見表1，從表1可以看出標(biāo)記化合物很快隨血液傳輸?shù)叫∈笕?，主要分布在肺和骨，肺較骨的排泄要快的多，在0.5h肺的攝取達(dá)最高為21.901％，隨后隨著時(shí)間的推移，肺的中放射性含量降低較快，而在實(shí)驗(yàn)段內(nèi)，骨的攝取始終保持很高；腎中放射性攝取高，腸內(nèi)基本無放射性，說明化合物是通過腎排泄的；富含內(nèi)皮網(wǎng)狀組織的肝和脾對(duì)放射性的攝取很少，因此骨對(duì)化合物的攝取并不是因?yàn)轭悆?nèi)皮網(wǎng)狀組織吞噬，而是化合物本身具有親骨性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，標(biāo)記物中較大的顆粒(＞10μm)存在，滯留于肺部，肝脾的低攝取說明化合物中基本上沒有能被內(nèi)皮網(wǎng)狀組織識(shí)別并吞噬的小顆粒存在。靜脈注射后，標(biāo)記化合物隨血流迅速進(jìn)入肺血管，由于比血管腔大的顆粒的物理俘獲(定位)機(jī)理，顆粒大的物質(zhì)立即暫時(shí)栓塞在肺小動(dòng)脈(內(nèi)徑平均30μm)和毛細(xì)血管(平均8μm)內(nèi)。
表1 C60-AEDP在小鼠體內(nèi)的分布(靜脈注射)(％ID/g，x±SD)

實(shí)施例5取昆明種小白鼠30只，隨機(jī)分成6組，每組5只，取已標(biāo)記好并且經(jīng)過過濾的99mTc-C60-AEDP，用0.22μm的Millipore過濾后清液中所剩放射性為原來的83％。按約200μl/只，分別注入小鼠尾靜脈中。在給藥后不同的時(shí)間階段，處死并剖重要器官和組織，分別稱重并測(cè)放射性計(jì)數(shù)，計(jì)算每克臟器攝取的放射性活度占注射量的百分比(％ID/g)。
化合物在小鼠體內(nèi)的分布見表2，從表2可以看出，大顆粒的化合物已被過濾掉，肺中無放射性積累，而骨的攝取則有所提高，其他組織普遍減少。
表2 C60-AEDP在小鼠體內(nèi)的分布(過濾后靜脈注射)(％ID/g，x±SD)

實(shí)施例6取昆明種小白鼠12只，隨機(jī)分成3組，每組4只，取已標(biāo)記好的99mTc-C60-AEDP按約200μl/只，分別皮下注入。在給藥后1、24、48小時(shí)，處死并剖重要器官和組織，分別稱重并測(cè)放射性計(jì)數(shù)，計(jì)算每克臟器攝取的放射性活度占注射量的百分比(％ID/g)化合物的小鼠分布見表3，分析皮下注射數(shù)據(jù)，可知肝脾無放射性滯留，骨中的高攝取是由于化合物本身的親骨性引起的。
表3 C60-AEDP在小鼠體內(nèi)的分布(皮下注射)(％ID/g，x±SD)

動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果顯示提示1)合成C60-AEDP時(shí)，主要有兩類產(chǎn)物，單合成產(chǎn)物和大顆粒聚合物。大顆粒聚合物幾乎全部被肺滯留，其它部分化合物能很快被生物體吸收，主要分布在骨，肌肉和皮毛中較少，且不能通過血腦屏障，最后主要通過腎臟排泄。2)連接基團(tuán)在C60衍生物生物體內(nèi)分布上起主要的作用，C60只是起類似“協(xié)同”的作用。這也說明以C60作為藥物載體是可行的，C60-二膦酸復(fù)合物也是可以成為新的骨質(zhì)疏松治療藥物的。
權(quán)利要求
1.一種以C60為載體的骨靶向治療藥物，其是由AEDP在紫外光照射下與C60反應(yīng)生成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以C60為載體的骨靶向治療藥物，其特征在于，該反應(yīng)是在非均相體系中進(jìn)行的，其中相轉(zhuǎn)移劑為四丁基氫氧化銨或四甲基氫氧化銨。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以C60為載體的骨靶向治療藥物在制備治療骨疾病的藥物中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的以C60為載體的骨靶向治療藥物的應(yīng)用，其特征在于，該骨疾病為骨質(zhì)疏松癥、癌轉(zhuǎn)移性骨痛和Paget’s。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種以C
文檔編號(hào)A61P19/00GK1390605SQ02136178
公開日2003年1月15日 申請(qǐng)日期2002年7月24日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月24日
發(fā)明者李晴暖, 李文新 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海原子核研究所