的GHRgRNA表達(dá)框GHR-gRNA-T載體的酶切鑒定 圖；
[0020] 圖4是根據(jù)本發(fā)明的一個實施例的GHRgRNA附著子終載體結(jié)構(gòu)示意圖；
[0021] 圖5是根據(jù)本發(fā)明的一個實施例的多個基因位點CIRSPR/附著子系統(tǒng)剪切活性鑒 定結(jié)果，其中
[0022] 圖5 (a)是在豬成纖維細(xì)胞中剪切活性鑒定結(jié)果，
[0023] 圖5 (b)、（c)是在豬PK15細(xì)胞中剪切活性鑒定結(jié)果，
[0024] 圖5 (d)是在牛成纖維細(xì)胞中剪切活性鑒定結(jié)果，
[00巧]圖5 (e)是在小鼠h巧al-6細(xì)胞中剪切活性鑒定結(jié)果；
[0026] 圖6是根據(jù)本發(fā)明的一個實施例的GHR基因修飾PCR產(chǎn)物連接T載體測序結(jié)果； W及
[0027] 圖7是根據(jù)本發(fā)明的一個實施例的標(biāo)記檢測電泳圖。
【具體實施方式】
[0028] 下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出。下面通過參考 附圖描述的實施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。
[002引需要說明的是，術(shù)語"第一"、"第二"僅用于描述目的，而不能理解為指示或暗示相 對重要性或者隱含指明所指示的技術(shù)特征的數(shù)量。由此，限定有"第一"、"第二"的特征可 W明示或者隱含地包括一個或者更多個該特征。進(jìn)一步地，在本發(fā)明的描述中，除非另有說 明，"多個"的含義是兩個或兩個W上。
[0030] 需要說明的是，本發(fā)明針對現(xiàn)有的CRISPR-化s9系統(tǒng)面臨的一些問題，通過人工 合成化s9入核蛋白和濁NA骨架，構(gòu)建化s9表達(dá)載體（即"第一構(gòu)建體"）和濁NA附著子表 達(dá)載體（即"第二構(gòu)建體")，利用附著子表達(dá)載體的特點，構(gòu)建一套新型的化s9-gRNA共篩 選系統(tǒng)（即本發(fā)明的適于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的系統(tǒng))，從而能夠有效實現(xiàn)無標(biāo)記基因組修飾細(xì)胞克隆 的快速篩選和陽性克隆快速獲得；同時，該一新型的化s9-gRNA共表達(dá)共篩選系統(tǒng)（即本發(fā) 明的適于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的系統(tǒng)）的切割效率顯著提高。
[0031] 下面結(jié)合附圖，詳細(xì)描述本發(fā)明的第一構(gòu)建體、第二構(gòu)建體、適于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的系統(tǒng) 及其應(yīng)用。
[0032] 適于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的構(gòu)建體
[0033] 根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了一種適于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的構(gòu)建體。根據(jù)本發(fā)明 的實施例，該適于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的構(gòu)建體即"第一構(gòu)建體"，其包含編碼化S9的核酸序列，且不 包含篩選標(biāo)記基因。發(fā)明人梅奇地發(fā)現(xiàn)，將該適于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的構(gòu)建體與本發(fā)明下述的另 一種適于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的構(gòu)建體，即包含附著子序列、tracrRNA序列和crRNA序列，其中所述 tracrRNA序列與所述crRNA序列可操作地連接構(gòu)成gRNAs表達(dá)框的適于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的構(gòu)建體 配合使用，即利用該兩種構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，能夠有效實現(xiàn)對哺乳動物細(xì)胞的多種基因修 飾，并獲得無標(biāo)記細(xì)胞株。
[0034] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述編碼化S9的核酸序列來源于化賊性鏈球菌。根據(jù)本 發(fā)明的一些具體示例，為了提高化s9蛋白的表達(dá)效率，W及化S9載體與濁NA載體的配合 性，并使其更適合在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)，發(fā)明人對野生型化賊性鏈球菌的編碼化s9蛋白 的核酸序列進(jìn)行了優(yōu)化，并在優(yōu)化后的編碼化S9的3'端引入2個重復(fù)核定位序列，并進(jìn)一 步在Csa9核酸序列的3'端引入2個重復(fù)核定位序列，具體地，第一構(gòu)建體中所包含的編碼 化S9的核酸序列具有SEQIDNO: 1所示的序列：
【主權(quán)項】
1. 一種適于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的構(gòu)建體，其特征在于，包含編碼CaS9的核酸序列，且不包含篩 選標(biāo)記基因。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種適于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的構(gòu)建體，其特征在于，所述編碼CaS9的 核酸序列來源于化膿性鏈球菌， 任選地，所述編碼CaS9的核酸序列具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種適于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的構(gòu)建體，其特征在于，進(jìn)一步包括第一 啟動子，所述第一啟動子與所述編碼CaS9的核酸序列可操作地連接， 任選地，所述第一啟動子為CMV啟動子。
4. 一種適于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的構(gòu)建體，其特征在于，包含：附著子序列、tracrRNA序列和 crRNA序列，其中所述tracrRNA序列與所述crRNA序列可操作地連接構(gòu)成gRNAs表達(dá)框。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種適于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的構(gòu)建體，其特征在于，所述附著子序列 為編碼EBNAl的核酸序列， 任選地，所述tracrRNA序列具有SEQIDNO:2所示的核苷酸序列， 任選地,所述crRNA序列為選自GHR、CRY2、IL2RG、RAG、MSTN和BRCAl基因的至少之一 的特異位點序列， 任選地，所述crRNA序列為選自SEQIDNO:3-38和SEQIDNO:46-47所示的核苷酸序 列的至少一組。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種適于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的構(gòu)建體，其特征在于，進(jìn)一步包括第二 啟動子，所述第二啟動子與所述gRNAs表達(dá)框可操作地連接， 任選地，所述第二啟動子為適于表達(dá)小片段RNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)的啟動子， 任選地，所述第二啟動子為選自U6和Hl啟動子的至少一種，優(yōu)選U6啟動子， 任選地，進(jìn)一步包括篩選標(biāo)記基因， 任選地，所述篩選標(biāo)記基因為藥物抗性基因，優(yōu)選新霉素抗性基因和氨芐青霉素的至 少一種， 任選地，進(jìn)一步包括MCS序列， 任選地，所述MCS序列由SEQIDNO:44-45所示的核苷酸序列退火形成， 任選地，進(jìn)一步包括復(fù)制起點。
7. -種適于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的系統(tǒng)，其特征在于，包括： 第一構(gòu)建體，所述第一構(gòu)建體為權(quán)利要求1-3任一項所述的適于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的構(gòu)建體； 以及 第二構(gòu)建體，所述第二構(gòu)建體為權(quán)利要求4-6任一項所述的適于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的構(gòu)建體， 任選地，所述細(xì)胞來源于哺乳動物，優(yōu)選豬、牛、羊或小鼠。
8. -種轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法，其特征在于，包括： 利用權(quán)利要求7所述的適于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的系統(tǒng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，利用所述第一構(gòu)建體和所述第二構(gòu)建體 共轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞， 任選地，進(jìn)行所述共轉(zhuǎn)染時，所述第一構(gòu)建體和所述第二構(gòu)建體的比例為I:10-10 :1， 任選地，所述細(xì)胞來源于哺乳動物，優(yōu)選所述細(xì)胞來源于豬、牛、羊或小鼠。
10. -種重組細(xì)胞，其是通過權(quán)利要求8或9所述的方法獲得的。
【專利摘要】提供了適于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的構(gòu)建體、系統(tǒng)及其應(yīng)用，其中一種適于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的構(gòu)建體包含編碼CaS9的核酸序列，且不包含篩選標(biāo)記基因。將該適于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的構(gòu)建體與本發(fā)明的包含附著子序列、tracrRNA序列和crRNA序列，其中tracrRNA序列與crRNA序列可操作地連接構(gòu)成gRNAs表達(dá)框的另一種適于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的構(gòu)建體配合使用，即利用這兩種構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，能夠有效實現(xiàn)對哺乳動物細(xì)胞的多種基因的剪切修飾，并獲得無標(biāo)記細(xì)胞株，且切割效率高、安全高效、重復(fù)性好。
【IPC分類】C12N15-85, C12N5-10, C12N15-63
【公開號】CN104774860
【申請?zhí)枴緾N201410017168
【發(fā)明人】李勇, 田凱, 張歡歡, 劉楚新, 李飛達(dá), 苗澤圃, 劉歡, 張耕耘
【申請人】深圳華大基因研究院, 深圳華大農(nóng)業(yè)與循環(huán)經(jīng)濟(jì)科技有限公司
【公開日】2015年7月15日
【申請日】2014年1月14日