適于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的構(gòu)建體、系統(tǒng)及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及適于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的構(gòu)建體、系統(tǒng)及其應(yīng)用，更 具體地，涉及兩種配合使用的適于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的構(gòu)建體、適于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的系統(tǒng)、轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方 法W及重組細(xì)胞。
【背景技術(shù)】
[0002] 規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)（ClusteredRegularlyInterspaced化ort Palin化omicRepeats,CRISPR)系統(tǒng)是一類廣泛分布于細(xì)菌和古菌基因組中的重復(fù)結(jié)構(gòu)， CRISPR含有一個與病毒或質(zhì)粒同源的短重復(fù)序列，通過對外來同源的DNA作用影響病毒或 質(zhì)粒的復(fù)制，是原核生物的免疫系統(tǒng)一部分。CRISH?重復(fù)間隔陣列可W被轉(zhuǎn)錄成一個長的 初級轉(zhuǎn)錄本，由于該序列包含多個重復(fù)片段，可形成多個發(fā)夾結(jié)構(gòu)的二級結(jié)構(gòu)，隨后被加工 成一個個短的CRISPRRNAs，該些RNA序列包含一段保守的重復(fù)片段和一段與外源DNA互 補(bǔ)的可變間隔序列，也叫引導(dǎo)序列（guidesequence)。在CRISPR位點(diǎn)附近，存在一系列 CRISPR相關(guān)基因（CRISPR-associated,Cas)，crRNAs可W和Cas蛋白結(jié)合，將Cas蛋白引導(dǎo) 到祀序列周圍，誘導(dǎo)雙鏈切割功能，形成DNA雙鏈斷裂。依據(jù)核也元件組成和序列的差異， 可W將CRISPR/Cas系統(tǒng)分成3類。第I型和第III型CRISPR系統(tǒng)，涉及到多個亞基復(fù)合 體參與crRNA識別和雙鏈切割。相比而言，第II型CRISPR系統(tǒng)僅包含單一的化s9蛋白， 參與crRNA介導(dǎo)的外源雙鏈切割。
[000引在II型CRISPR系統(tǒng)中，crRNA可W通過堿基對來連接反式活性的RNA(tracr-RNA)來形成復(fù)合RNA結(jié)構(gòu)。該種復(fù)合RNA結(jié)構(gòu)分子可W指導(dǎo)化s9蛋白質(zhì)來在特 定位點(diǎn)引入雙鏈DNA的斷裂。而化s9可W結(jié)合tracrRNA;crRNA復(fù)合物反過來通過指導(dǎo)其 來結(jié)合至DNA序列上發(fā)揮作用。在該個化s9 -crRNA復(fù)合物行使功能的過程中，短間區(qū)序 列鄰近基序（protospacer-adjacentmotif，PAM)起著識別敵我的作用，在祀序列的周圍具 有一些短特征序列，如NGG結(jié)構(gòu)，是CAS9行使功能的重要前提。此外，tracrRNA;crRNA復(fù) 合體可W通過序列融合，形成融合轉(zhuǎn)錄本，且可W被化s9高效識別，該類融合RNA也叫引導(dǎo) RNA(guideRNA，gRNAs)。因此，Cas9-gRNA系統(tǒng)中，包含與祀序列完全互補(bǔ)的20個堿基的 gRNA介導(dǎo)特異性識別，而化s9的2個截然不同的活性位點(diǎn)（RuvCandHNH)行使位點(diǎn)特異 性切割功能。
[0004]目前，CRISPR-化s9系統(tǒng)已應(yīng)用于細(xì)菌、酵母、斑馬魚、小鼠W及人類細(xì)胞基因組修 飾等方面。但是，現(xiàn)有的CRISPR-化s9系統(tǒng)在細(xì)胞基因組修飾方面效率較低，不同實(shí)驗(yàn)室結(jié) 果差異較大；另外，細(xì)胞陽性克隆篩選常采用共轉(zhuǎn)抗性表達(dá)載體或流式細(xì)胞篩選或單細(xì)胞 稀釋接種，該些方法具有各自的缺陷，如共轉(zhuǎn)抗性表達(dá)載體篩選獲得單克隆細(xì)胞純度低、抗 性基因的插入導(dǎo)致生物安全性問題，流式細(xì)胞篩選后細(xì)胞傷害較大，尤其對于原代細(xì)胞，單 細(xì)胞稀釋接種流程繁瑣、細(xì)胞接種密度低導(dǎo)致細(xì)胞生長受抑。該些不同不足的存在影響了 CRISPR-化s9系統(tǒng)的廣泛、高效應(yīng)用。
[0005] 因而，現(xiàn)階段的CRISPR-化s9系統(tǒng)仍有待改進(jìn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個目的 在于提出一種切割效率高、安全高效、重復(fù)性好、無標(biāo)記基因修飾細(xì)胞的新型CRISPR-化s9 系統(tǒng)。
[0007] 根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了一種適于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的構(gòu)建體。根據(jù)本發(fā)明 的實(shí)施例，該適于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的構(gòu)建體包含編碼化S9的核酸序列，且不包含篩選標(biāo)記基因。 在本文中有時將該構(gòu)建體稱為"第一構(gòu)建體"或"化s9表達(dá)載體"。此外，需要說明的是，在 本文中"構(gòu)建體"和"載體"意義相同，可W互換使用。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，將該適于轉(zhuǎn)化細(xì) 胞的構(gòu)建體與本發(fā)明下述的另一種適于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的構(gòu)建體，即包含附著子序列、tracrRNA 序列和crRNA序列，其中所述tracrRNA序列與所述crRNA序列可操作地連接構(gòu)成gRNAs表 達(dá)框的適于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的構(gòu)建體配合使用，即利用該兩種構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，能夠有效實(shí)現(xiàn) 對哺乳動物細(xì)胞的多種基因的剪切修飾，并獲得無標(biāo)記細(xì)胞株，且切割效率高、安全高效、 重復(fù)性好。
[0008] 根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明還提供了另一種適于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的構(gòu)建體。根據(jù)本 發(fā)明的實(shí)施例，該適于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的構(gòu)建體包含；附著子序列、tracrRNA序列和crRNA序列， 其中所述tracrRNA序列與所述crRNA序列可操作地連接構(gòu)成gRNAs表達(dá)框。在本文中有 時將該構(gòu)建體稱為"第二構(gòu)建體"或"gRNA(附著子）表達(dá)載體"。將該適于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的構(gòu)建 體與前述的本發(fā)明的另一種適于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的構(gòu)建體，即包含編碼化S9的核酸序列，且不包 含篩選標(biāo)記基因的適于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的構(gòu)建體配合使用，即利用該兩種構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，能 夠有效實(shí)現(xiàn)對哺乳動物細(xì)胞的多種基因的剪切修飾，并獲得無標(biāo)記細(xì)胞株，且切割效率高、 安全高效、重復(fù)性好。
[0009] 根據(jù)本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明還提供了一種適于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的系統(tǒng)。根據(jù)本發(fā)明 的實(shí)施例，該適于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的系統(tǒng)包括：第一構(gòu)建體，所述第一構(gòu)建體為前面所述的包含編 碼化S9的核酸序列，且不包含篩選標(biāo)記基因的適于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的構(gòu)建體；W及第二構(gòu)建體， 所述第二構(gòu)建體為前面所述的包含附著子序列、tracrRNA序列和crRNA序列，其中所述 tracrRNA序列與所述crRNA序列可操作地連接構(gòu)成gRNAs表達(dá)框的適于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的構(gòu)建 體。利用該系統(tǒng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞，能夠有效實(shí)現(xiàn)對哺乳動物細(xì)胞的多種基因的剪切修飾，并獲得無 標(biāo)記細(xì)胞株。并且，切割效率高、安全高效、重復(fù)性好。
[0010] 根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明還提供了一種轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí) 施例，該方法包括：利用前面所述的適于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的系統(tǒng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，利 用該方法轉(zhuǎn)化細(xì)胞，能夠有效實(shí)現(xiàn)對哺乳動物細(xì)胞的多種基因的剪切修飾，并獲得無標(biāo)記 細(xì)胞株。并且，切割效率高、安全高效、重復(fù)性好。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還提供了一種重組細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該 重組細(xì)胞是通過前面所述的方法獲得的。該重組細(xì)胞的特異位點(diǎn)被剪切而發(fā)生突變，從而 能夠作為疾病模型對于人類基因治療領(lǐng)域意義重大，且能夠有效用于家畜動物遺傳改良。
[0012] 本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變 得明顯，或通過本發(fā)明的實(shí)踐了解到。
【附圖說明】
[0013] 本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點(diǎn)從結(jié)合下面附圖對實(shí)施例的描述中將變 得明顯和容易理解，其中：
[0014] 圖1是根據(jù)本發(fā)明一個實(shí)施例的化s9構(gòu)建載體電泳圖，其中
[0015] 圖1 (a)是化s9分別合成的3個片段載體酶切鑒定圖，
[0016] 圖1 (b)是完整化s9基因片段連接在T載體上的酶切鑒定圖，
[0017] 圖1(C)是化s9表達(dá)載體酶切鑒定圖；
[0018] 圖2是根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施例的化s9表達(dá)載體結(jié)構(gòu)示意圖；
[0019] 圖3是根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施例