；（i)識(shí)別人蛋白的信號(hào)序列并將它們轉(zhuǎn)位至ER內(nèi)的能 力，但（ii)不能將人分子伴侶保留在其預(yù)定的細(xì)胞區(qū)室。該些性質(zhì)并未被發(fā)現(xiàn)和/或利用 于在酵母中產(chǎn)生天然重組人蛋白。
[0047] 應(yīng)注意，人分子伴侶的內(nèi)源信號(hào)膚實(shí)際上不是分泌信號(hào)氨基酸序列，該是因?yàn)樗?們僅用于將天然人蛋白導(dǎo)引至ER。當(dāng)信號(hào)序列被切割時(shí)，人細(xì)胞中的分子伴侶蛋白保留在 ER中。即使在一些情況下顯示出天然人分子伴侶被導(dǎo)引至細(xì)胞表面，但它們并不會(huì)被分泌 到細(xì)胞外側(cè)。實(shí)際上，已知人邸分子伴侶蛋白是細(xì)胞內(nèi)蛋白。因此，本發(fā)明人在此首次顯 示出了酵母將細(xì)胞內(nèi)人蛋白利用其天然信號(hào)序列進(jìn)行分泌的能力，W進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)加工和細(xì) 胞內(nèi)成熟蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)。已知一些分泌的人蛋白可利用其天然分泌信號(hào)序列而在酵母細(xì)胞中 分泌化itzeman等，1983 ;Barr等，1992)。該方法利用人干擾素為例在1988年獲得專利權(quán) 化itzeman和Leung, 1988);該方法還在1994年使用，并獲得了對(duì)人血清白蛋白利用其天然 分泌信號(hào)序列在畢赤酵母中表達(dá)的專利（Prevatt和Sreekrishna，1994)。然而，在大多數(shù) 情況中釀酒酵母a-MF前信號(hào)序列原被用于在其他異源蛋白在酵母中的分泌，因?yàn)樘烊环?泌信號(hào)序列效果較差（Cere曲ino和化egg, 2000)。本發(fā)明人的發(fā)現(xiàn)不同于此前的觀察，天 然信號(hào)序列可驅(qū)動(dòng)分泌性人蛋白在酵母中的分泌。可W預(yù)見的是，分泌性人蛋白利用相同 的信號(hào)序列也可W在酵母細(xì)胞中分泌。相反，細(xì)胞內(nèi)人蛋白例如ER駐留的分子伴侶蛋白的 分泌對(duì)于在酵母中重組表達(dá)的類似物是不能預(yù)見的。此外，人m?分子伴侶蛋白在酵母中的 分泌水平出乎預(yù)料地高，并且可有效產(chǎn)生正確加工的重組產(chǎn)物?？傊?，本發(fā)明人大體上提出 了異源人蛋白在酵母細(xì)胞中分泌的新規(guī)程。
[0048] 所有=種分泌的人分子伴侶隨后進(jìn)行純化和分析。分泌的重組人分子伴侶從培 養(yǎng)基中的純化利用標(biāo)準(zhǔn)程序例如微孔過濾、超濾和一步層析和標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程進(jìn)行。該簡(jiǎn)單的 純化程序足W實(shí)現(xiàn)純度超過90%的天然重組人分子伴侶。該種簡(jiǎn)單有效的下游純化程序 是所公開的表達(dá)系統(tǒng)的另一優(yōu)點(diǎn)。進(jìn)行通過Edman降解的N端測(cè)序W鑒定和表征純化的 分泌蛋白。在所有=種情況下對(duì)來自釀酒酵母的分子伴侶蛋白產(chǎn)物的E血an測(cè)序（利用 AltaBioscience的服務(wù)進(jìn)行）鑒定出5個(gè)N端氨基酸，并顯示出它們對(duì)應(yīng)于來自人細(xì)胞 的成熟天然分子伴侶蛋白產(chǎn)物（見表1:對(duì)于GRP78/BiP是NH2-EEEDK;對(duì)于巧網(wǎng)蛋白是 NH2-EPAVY和對(duì)于E化57是NH2-SDVLE)。該些結(jié)果表明人分子伴侶蛋白的天然邸信號(hào)序列 在酵母細(xì)胞中被識(shí)別和正確加工，并且該可W使重組蛋白轉(zhuǎn)位到邸中，隨后出乎預(yù)料地分 泌到酵母細(xì)胞外。為了檢查所分泌蛋白產(chǎn)物的可能的修飾，本發(fā)明人進(jìn)行全蛋白分子的電 噴霧質(zhì)譜巧SI-M巧分析，W確定酵母分泌的人ER分子伴侶蛋白的確切分子量。表1和圖 2中給出了質(zhì)譜結(jié)果；表1指出了產(chǎn)物的精確測(cè)定分子量和預(yù)測(cè)分子量。
[0049] 表1.自釀酒酵母純化的分泌的重組人分子伴侶的N端序列、預(yù)測(cè)分子量和測(cè)定分 子量
[00 加]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種產(chǎn)生重組蛋白的方法，所述方法包括 (a) 以核苷酸序列轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，所述核苷酸序列包含針對(duì)天然人內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶蛋 白信號(hào)序列和人內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶蛋白的編碼序列； (b) 在人內(nèi)質(zhì)網(wǎng)重組分子伴侶蛋白以分泌的形式表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述酵母細(xì)胞；和 (c) 從培養(yǎng)基中提取所述人內(nèi)質(zhì)網(wǎng)重組分子伴侶蛋白。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述重組蛋白是人內(nèi)質(zhì)網(wǎng)重組分子伴侶蛋白。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述酵母是釀酒酵母。
4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述酵母是畢赤酵母。
5. 如權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述人內(nèi)質(zhì)網(wǎng)重組分子伴侶蛋白選自由BiP/ GRP78、鈣網(wǎng)蛋白和ERp57組成的組。
6. -種產(chǎn)生人內(nèi)質(zhì)網(wǎng)重組分子伴侶蛋白的方法，其中所述人內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶蛋白是人 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管腔蛋白，所述方法包括 (a) 在以分泌形式表達(dá)所述人內(nèi)質(zhì)網(wǎng)重組分子伴侶蛋白的條件下，培養(yǎng)酵母細(xì)胞，所述 酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化有核苷酸序列，所述核苷酸序列包含針對(duì)天然人內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶蛋白信號(hào)序 列和人內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶蛋白兩者的編碼序列；和 (b) 從培養(yǎng)基中提取所述人內(nèi)質(zhì)網(wǎng)重組分子伴侶蛋白。
7. -種產(chǎn)生選自由MP/GRP78、鈣網(wǎng)蛋白和ERp57組成的組的人內(nèi)質(zhì)網(wǎng)重組分子伴侶 蛋白的方法，所述方法包括 (a) 提供轉(zhuǎn)化有核苷酸序列的酵母細(xì)胞，所述核苷酸序列包含針對(duì)天然人內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子 伴侶蛋白信號(hào)序列和人內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶蛋白的編碼序列； (b) 在人內(nèi)質(zhì)網(wǎng)重組分子伴侶蛋白以分泌的形式表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述酵母細(xì)胞；和 (c) 從培養(yǎng)基中提取MP/GRP78、鈣網(wǎng)蛋白或ERp57中的至少一種。
8. -種產(chǎn)生天然重組人MP/GRP78蛋白的方法，所述方法包括 (a) 提供至少一種轉(zhuǎn)化有核苷酸序列的釀酒酵母細(xì)胞，所述核苷酸序列包含針對(duì)BiP/ GRP78分子伴侶蛋白信號(hào)序列和MP/GRP78分子伴侶蛋白兩者的編碼序列； (b) 在使MP/GRP78分子伴侶蛋白以分泌形式表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述至少一種轉(zhuǎn)化的 釀酒酵母細(xì)胞；和 (c) 從培養(yǎng)基中提取完全無損且具有活性的人MP/GRP78。
9. 如權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述酵母是畢赤酵母。
10. -種產(chǎn)生天然重組人鈣網(wǎng)蛋白的方法，所述方法包括 (a) 提供至少一種轉(zhuǎn)化有核苷酸序列的釀酒酵母細(xì)胞，所述核苷酸序列包含針對(duì)鈣網(wǎng) 蛋白分子伴侶蛋白信號(hào)序列和鈣網(wǎng)蛋白分子伴侶蛋白兩者的編碼序列； (b) 在使鈣網(wǎng)蛋白分子伴侶蛋白以分泌形式表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述至少一種轉(zhuǎn)化的釀 酒酵母細(xì)胞；和 (c) 從培養(yǎng)基中提取完全無損且具有活性的人鈣網(wǎng)蛋白。
11. 如權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述酵母是畢赤酵母。
12. -種產(chǎn)生天然重組人ERp57蛋白的方法，所述方法包括 (a)提供至少一種轉(zhuǎn)化有核苷酸序列的釀酒酵母細(xì)胞，所述核苷酸序列包含針對(duì)ERp57分子伴侶蛋白信號(hào)序列和ERp57分子伴侶蛋白兩者的編碼序列； (b) 在致使ERp57分子伴侶蛋白以分泌形式表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述至少一種轉(zhuǎn)化的釀 酒酵母細(xì)胞；和 (c) 從培養(yǎng)基中提取完全無損且具有活性的人ERp57。
13. 如權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述酵母是畢赤酵母。
14. 一種通過包括以下步驟的方法產(chǎn)生的人內(nèi)質(zhì)網(wǎng)重組分子伴侶蛋白： (a) 提供轉(zhuǎn)化有核苷酸序列的酵母細(xì)胞，所述核苷酸序列包含針對(duì)天然人內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子 伴侶蛋白信號(hào)序列和人內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶蛋白兩者的編碼序列； (b) 在使所述人內(nèi)質(zhì)網(wǎng)重組分子伴侶蛋白以分泌的形式表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述酵母細(xì) 胞；和 (c) 從培養(yǎng)基中提取所述人內(nèi)質(zhì)網(wǎng)重組分子伴侶蛋白。
15. 如權(quán)利要求14所述的蛋白，所述蛋白還包含組氨酸標(biāo)簽。
16. 如權(quán)利要求14所述的蛋白，所述蛋白還包含天然氨基酸序列。
17. 如權(quán)利要求14所述的蛋白，所述蛋白具有生物活性。
18. -種產(chǎn)生蛋白的方法，所述方法包括 (a) 以包含天然信號(hào)序列的全長(zhǎng)人分子伴侶cDNA轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞； (b) 在人內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶蛋白得到表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述酵母細(xì)胞；和 (c) 從培養(yǎng)基中提取所述人內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶蛋白。
【專利摘要】一種利用酵母作為宿主產(chǎn)生人ER分子伴侶蛋白的方法，該方法利用了細(xì)胞內(nèi)人蛋白的內(nèi)源信號(hào)肽，該內(nèi)源信號(hào)肽在酵母細(xì)胞中被識(shí)別和正確加工并隨后致使人蛋白分泌。所得的蛋白具有天然氨基酸序列并具有生物學(xué)活性。此外，分泌使得可以以高產(chǎn)量簡(jiǎn)單地一步純化天然重組人蛋白。
【IPC分類】C12P21-00
【公開號(hào)】CN104704126
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201380036854
【發(fā)明人】E·斯普利斯, R·斯利賓斯卡斯, K·薩斯諾斯卡斯, M·邁克拉克, L·I·戈?duì)柕?
【申請(qǐng)人】Uab巴爾特瑪斯公司
【公開日】2015年6月10日
【申請(qǐng)日】2013年7月10日
【公告號(hào)】CA2878672A1, EP2872644A1, US20150191713, WO2014011723A1