在酵母表達(dá)系統(tǒng)中利用人內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶蛋白天然信號序列產(chǎn)生天然重組的分泌的人內(nèi) ...的制作方法
【專利說明】在酵母表達(dá)系統(tǒng)中利用人內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶蛋白天然信號序 列產(chǎn)生天然重組的分泌的人內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶蛋白
[0001] 相關(guān)申請
[0002] 本申請要求于2012年7月12日遞交的共同未決美國臨時(shí)申請61/670, 768號的 權(quán)益，特此通過引用將其整體并入本文。
【背景技術(shù)】
[0003] 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)巧時(shí)分子伴侶蛋白是多功能蛋白，參與多種生物學(xué)過程如蛋白折疊和 邸中的質(zhì)量控制化ebe;rt等，1995 ;化ang等，1997 ;E5raakman&vanAnken，2000 ;Hi曲等， 2000;Bedard等，2005;Benyair等，2011 ;化aakman&Bulleid，2011)、解折疊蛋白反應(yīng) (Spear&Ng，2001 ;Ma&胎ndershot，2004 ;Malhotra&Kaufman，2007;Groenendyk等，2010 ; Chakr油arti等，2011)，I類M肥抗原加工（Maffei等，1997 ;Nicchitta&Reed，2000 ; 化ang&Williams，2006 ;Wearsch&Cresswell，2009)W及該些蛋白在邸外側(cè)行使的其他重 要功能（Panayi&Corrigall，2006 ;Gonzalez-Gronow等 2009;Gold等，2010;Ni等，2011 ; 化ters紐a曲avan，2011 ;Turano等，2011)。邸分子伴侶蛋白在各種人疾病中的作用可能 尤為重要。表明特定邸分子伴侶蛋白參與多種病理過程的數(shù)據(jù)量日益增多。例如，邸分 子伴侶蛋白GRP78/BiP可能參與癌癥進(jìn)展（Li化ee，2006 ;Lee，2007 ;Luo化ee，2012)、自身 免疫炎癥和組織損傷（Panayi&Corrigall，2006 ;Morito&Nagata，2012)和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 (Corrigall等，2001;Yoo等，2012)。另一ER分子伴侶蛋白巧網(wǎng)蛋白（calreticulin)在 激活化療和各種其他癌癥治療策略所需的抗腫瘤響應(yīng)中具有重要作用（化aput等，2007 ; 化eid等，2007 ;Wemeau等，2010)并且還與皮膚創(chuàng)傷的愈合過程相關(guān)（Nann巧等，2008)。其 他邸分子伴侶蛋白也設(shè)及了疾病相關(guān)過程，例如，對于分子伴侶蛋白GRP58/E化57而言是 航病毒疾病Ofetz等，2005)。該些最近的發(fā)現(xiàn)表明可將邸分子伴侶蛋白應(yīng)用于治療試驗(yàn) 和新藥開發(fā)。因此，可預(yù)見不久的將來對人ER分子伴侶蛋白產(chǎn)品會有增長的需求。
[0004] 天然人邸分子伴侶蛋白可W從各種組織中純化，例如已經(jīng)從人胎盤中純化了巧 網(wǎng)蛋白化ouen&Koch，1994)，但人組織對于大規(guī)模臨床試驗(yàn)而言不是該些蛋白的充足來源。 為有效而安全地生產(chǎn)該些蛋白應(yīng)考慮重組蛋白表達(dá)技術(shù)。另外，理想的是該些重組蛋白對 于臨床試驗(yàn)應(yīng)盡可能對應(yīng)于天然類似物。
[0005] 當(dāng)前大多數(shù)重組人邸分子伴侶蛋白在細(xì)菌宿主大腸桿菌中產(chǎn)生（Rokeach等， 1991 ;Baksh等，1992 ;Antoniou等，2002)，并且該些產(chǎn)品可商購獲得（Abeam產(chǎn)品油78432， 油91577 和油92937, 2012 ;StressMarq產(chǎn)品SPR-119B，2012;USBiological產(chǎn)品B1770-01， C1036-02L1和E2291-75E，2012)。然而，大腸桿菌和其它原核生物不具有ER、Golgi器和 真核分泌途徑的其它細(xì)胞器，因此不確定在細(xì)菌中產(chǎn)生的人ER蛋白是否正確折疊并具有 所有與天然蛋白類似物相同的功能。酵母是產(chǎn)生ER分子伴侶蛋白和其它復(fù)雜的分泌人蛋 白的有吸引力的宿主，因?yàn)樵摲N單細(xì)胞真核微生物具有真核特征，包括導(dǎo)致正確蛋白加工 和翻譯后修飾的分泌途徑（Mattanovich等，2012)。已經(jīng)進(jìn)行多種嘗試來在酵母中產(chǎn)生重 組分泌的人蛋白值amasceno等，2012出OU等，2012)，因?yàn)樵摲N表達(dá)系統(tǒng)有利于蛋白產(chǎn)物的 純化和下游加工，并且分泌的蛋白通常具有生物學(xué)活性。對于在酵母中產(chǎn)生分泌的人m?分 子伴侶蛋白，可W采用數(shù)種技術(shù)。所有該些方法都包括利用與經(jīng)加工的成熟人m?蛋白的序 列融合的常規(guī)酵母蛋白分泌信號。W該種方式產(chǎn)生的蛋白產(chǎn)物在N末端具有數(shù)個(gè)非天然 氨基酸，該一操縱對所制備蛋白的生物學(xué)活性的影響是未知的。迄今為止文獻(xiàn)描述的酵母 表達(dá)的分泌的全長重組哺乳動物邸分子伴侶蛋白的唯一已知實(shí)例是在畢赤酵母（Pichia pastoris)中產(chǎn)生的重組兔巧網(wǎng)蛋白（An化in等，2000)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 已知尚未嘗試?yán)萌僳》肿影閭H蛋白的天然信號序列在微生物宿主中產(chǎn)生與人 細(xì)胞中天然類似物相同的方式正確加工的最終天然重組ER分子伴侶蛋白產(chǎn)物。本文描述 了在釀酒酵母僅cerevisiae)和畢赤酵母（P.pastoris)表達(dá)系統(tǒng)中利用數(shù)種細(xì)胞內(nèi)人邸 分子伴侶蛋白的天然信號序列從而將正確加工的終產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基。令人驚訝的是，該 方法能夠產(chǎn)生大量的按照與人細(xì)胞中相同的方式加工的天然重組人分子伴侶，不同之處在 于成熟的蛋白產(chǎn)物被分泌到酵母培養(yǎng)基中。本發(fā)明還顯示了證實(shí)人ER分子伴侶蛋白的信 號序列在酵母細(xì)胞中正確加工的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，并提供了如何有效W分泌形式產(chǎn)生該些蛋白。
[0007] 本發(fā)明提供了通過簡單的下游純化程序在酵母中產(chǎn)生天然重組人邸分子伴侶蛋 白的方法。該些蛋白不具有任何附加的人工氨基酸序列，并且被加工成最終產(chǎn)物，根據(jù)其預(yù) 測分子量恰好對應(yīng)于類似的人蛋白。該通過整合如下所述的數(shù)種關(guān)鍵因素而實(shí)現(xiàn)，并僅適 用于人內(nèi)質(zhì)網(wǎng)巧時(shí)管腔蛋白。通過種人ER蛋白為例描述程序，結(jié)果顯示所述方法如 何進(jìn)行。
[000引本發(fā)明涵蓋了產(chǎn)生重組蛋白的方法。該些方法包括W下步驟
[0009] (a)W核巧酸序列轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，所述核巧酸序列包含針對天然人ER分子伴侶蛋 白信號序列和人ER分子伴侶蛋白的編碼序列；
[0010] 化）在人m?重組分子伴侶蛋白W分泌的形式表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述酵母細(xì)胞；和 [ocm] (C)從培養(yǎng)基中提取所述人邸重組分子伴侶蛋白。
[0012] 本發(fā)明所述方法的一個(gè)實(shí)施方式產(chǎn)生人邸重組分子伴侶蛋白，其中所述人邸分 子伴侶蛋白是人邸管腔蛋白。該方法包括W下步驟：在W分泌形式表達(dá)人邸重組分子伴 侶蛋白的條件下培養(yǎng)酵母細(xì)胞，所述酵母細(xì)胞已轉(zhuǎn)化有核巧酸序列，所述核巧酸序列包含 針對天然人ER分子伴侶蛋白信號序列和人ER分子伴侶蛋白兩者的編碼序列；和從培養(yǎng)基 中提取所述人m?重組分子伴侶蛋白。
[0013] 本發(fā)明所述方法的另一實(shí)施方式產(chǎn)生選自由BiP/GRP78、巧網(wǎng)蛋白和E化57組成 的組的人m?重組分子伴侶蛋白。所述方法包括W下步驟
[0014] (a)提供轉(zhuǎn)化有核巧酸序列的酵母細(xì)胞，所述核巧酸序列包含針對天然人ER分子 伴侶蛋白信號序列和人ER分子伴侶蛋白兩者的編碼序列；
[0015] 化）在人m?重組分子伴侶蛋白W分泌的形式表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述酵母細(xì)胞；和
[0016] (C)從培養(yǎng)基中提取BiP/GRP78、巧網(wǎng)蛋白或E化57中的至少一種。
[0017] 本發(fā)明所述方法可產(chǎn)生高達(dá)約lOOmg/L的所需蛋白，并且通過本領(lǐng)域已知的常規(guī) 方法優(yōu)化酵母培養(yǎng)條件可W進(jìn)一步增加產(chǎn)量。
[0018] 本發(fā)明所述方法的另一實(shí)施方式通過W下步驟產(chǎn)生人m?重組分子伴侶蛋白，
[0019] (a)提供轉(zhuǎn)化有核巧酸序列的酵母細(xì)胞，所述核巧酸序列包含針對天然人ER分子 伴侶蛋白信號序列和人ER分子伴侶蛋白兩者的編碼序列；
[0020] 化）在人m?重組分子伴侶蛋白W分泌的形式表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述酵母細(xì)胞；和
[0021] (C)從培養(yǎng)基中提取所述人邸重組分子伴侶蛋白。
【附圖說明】
[0022] 圖1顯示了用空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化（泳道1)或產(chǎn)生人分子伴侶BiP、巧網(wǎng)蛋白和E化57 (分 別為泳道2、3和4)的釀酒酵母A肥2細(xì)胞的40X濃縮的培養(yǎng)基的SDS-PAGE(圖1A)和蛋 白質(zhì)印跡（圖1B)分析。
[0023] 圖2