顯示了從釀酒酵母純化的分泌的重組人分子伴侶巧網(wǎng)蛋白（圖2A)、 E化57(圖 2B)和GRP78/BiP(圖 2C)的ESI-MS。
[0024] 圖3顯示了來(lái)自所選擇的過(guò)表達(dá)了分泌的重組人BiP(圖3A)、巧網(wǎng)蛋白（圖 3B)和E化57(圖3C)的畢赤酵母GS115株多拷貝轉(zhuǎn)化體的未濃縮的培養(yǎng)基（各8y1)的 SDS-PAGE。C表示對(duì)照（轉(zhuǎn)化有不具有人基因的空載體PPIC3. 5K并與過(guò)表達(dá)人分子伴侶的 株平行培養(yǎng)的畢赤酵母GS115株的8y1未濃縮培養(yǎng)基），而M是具有條帶上方所指示的已 知分子量的蛋白標(biāo)記物。
[0025] 圖4顯示了從釀酒酵母培養(yǎng)基純化分泌的重組人GRP78/BiP蛋白。泳道代表蛋白 分子量標(biāo)記物（M)、人BiP在釀酒酵母中表達(dá)后的酵母培養(yǎng)基（A)、微孔過(guò)濾后相同酵母生 長(zhǎng)培養(yǎng)基炬）、切向超離屯、后的相同培養(yǎng)基（C)和通過(guò)ATP親和層析從相同培養(yǎng)基純化的分 泌的重組人BiP蛋白值）。
[0026] 圖5顯示了利用MLDI-TOF/TOF串聯(lián)MS/MS(質(zhì)譜）W及UPLC/MSE法對(duì)釀酒酵母 分泌的GRP78/BiP蛋白條帶的膜蛋白酶化膚質(zhì)量指紋（massfinge巧rinting)的定位。
[0027] 圖6分別顯示了通過(guò)E血an降解和ESI-MS對(duì)釀酒酵母和畢赤酵母分泌的重組人 GRP78/BiP的完整分子的N端測(cè)序結(jié)果。
[002引圖7顯示了從釀酒酵母（圖7A)和畢赤酵母（圖7B)純化的重組BiP蛋白的部分 蛋白水解。
[0029] 圖8顯示了利用細(xì)菌和酵母中表達(dá)的重組BiP蛋白進(jìn)行的ATP酶活性測(cè)試。
[0030] 圖9顯示了從釀酒酵母純化的重組人BiP蛋白的天然PAGE。
[0031] 圖10顯示了分別對(duì)酵母培養(yǎng)基W及來(lái)自畢赤酵母和釀酒酵母的純化的重組人巧 網(wǎng)蛋白樣品的SDS-PAGE分析。
[0032] 圖11顯示了釀酒酵母表達(dá)的蛋白的膜蛋白酶化膚質(zhì)量指紋，該確認(rèn)了純化的分 泌蛋白代表了具有正確加工的N端氨基酸序列的人巧網(wǎng)蛋白。
[003引圖12顯示了從畢赤酵母和釀酒酵母純化的分泌的重組人巧網(wǎng)蛋白的ESI-MS和N端Edman測(cè)序。
[0034] 圖13顯示了對(duì)從畢赤酵母培養(yǎng)基純化的重組人巧網(wǎng)蛋白的膜蛋白酶消化證實(shí)了 酵母分泌的人蛋白的正確折疊。
[0035] 圖14顯示了關(guān)于源自細(xì)菌和酵母的重組巧網(wǎng)蛋白誘導(dǎo)的人成纖維細(xì)胞增殖的數(shù) 據(jù)。
[0036] 圖15顯示了傷口愈合刮擦平板測(cè)試的數(shù)據(jù)。源自細(xì)菌或酵母的重組巧網(wǎng)蛋白誘 導(dǎo)了人成纖維細(xì)胞遷移。
[0037] 圖16顯示了來(lái)自酵母培養(yǎng)基的分泌的重組人E化57蛋白的純化。泳道代表蛋白 分子量標(biāo)記物（M)、人E化57在釀酒酵母中表達(dá)后的粗酵母生長(zhǎng)培養(yǎng)基（A)、微孔過(guò)濾后的 相同酵母生長(zhǎng)培養(yǎng)基炬）、切向超離屯、后的相同培養(yǎng)基（C)和利用肝素Se地arose通過(guò)一步 親和層析從相同培養(yǎng)基純化的分泌的重組人E化57蛋白值）。
[003引 圖17顯示了從釀酒酵母純化的分泌重組人邸p57的ESI-MS和N端Edman測(cè)序。
[0039] 圖18顯示了通過(guò)膜蛋白酶化膚質(zhì)量指紋對(duì)從釀酒酵母純化的分泌的重組人分子 伴侶E化57(PDIA3)進(jìn)行的蛋白N端鑒定。
[0040] 圖19顯示了通過(guò)膜島素沉降法測(cè)試的酵母來(lái)源的重組人E化57蛋白的硫醇基依 賴的催化活性。
[0041] 圖20顯示了從畢赤酵母純化的分泌的重組人E化57的SDS-PAGE。
【具體實(shí)施方式】
[0042] 本發(fā)明涵蓋了在酵母細(xì)胞中合成天然重組分泌的人邸分子伴侶蛋白的酵母表達(dá) 系統(tǒng)。酵母是能夠?qū)Ρ磉_(dá)的多膚進(jìn)行真核加工的單細(xì)胞真核微生物。由于酵母是真核生 物，因此其細(xì)胞內(nèi)環(huán)境更適合包括人細(xì)胞蛋白的真核蛋白的正確折疊。酵母來(lái)源的異源蛋 白不含毒性污染物，是開(kāi)發(fā)疫苗、診斷劑或生物醫(yī)藥的優(yōu)異工具。釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)被稱為GRAS(-般認(rèn)為是安全的）生物。酵母中產(chǎn)生的大多數(shù)天然重組人或 病毒蛋白具有與來(lái)自人細(xì)胞的天然蛋白相似的性質(zhì)，優(yōu)于其在細(xì)菌中表達(dá)的類似物。對(duì)各 種高質(zhì)量重組蛋白的增長(zhǎng)性需求需要更好和更有效的表達(dá)系統(tǒng)，甚至對(duì)于有充分建立的生 產(chǎn)規(guī)程的蛋白也是如此。用于各種目的的天然人蛋白通常從各種人細(xì)胞純化，因?yàn)橹亟M蛋 白利用各種標(biāo)簽從大腸桿菌中合成和純化。本發(fā)明證明酵母是迄今用于表達(dá)和純化天然重 組人蛋白的優(yōu)異宿主。
[0043] 邸分子伴侶蛋白是多功能蛋白，參與多種生物學(xué)過(guò)程如蛋白折疊和邸中的質(zhì)量 控制、解折疊蛋白響應(yīng)、I類M肥抗原加工、W及該些蛋白在邸外側(cè)行使的其他重要功能。 ER分子伴侶蛋白在各種人疾病中的作用可能尤為重要，有數(shù)據(jù)表明特定ER分子伴侶蛋白 參與多種病理過(guò)程。該些最近的發(fā)現(xiàn)表明可將ER分子伴侶蛋白應(yīng)用于治療試驗(yàn)和新藥開(kāi) 發(fā)，W及基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究。重組蛋白表達(dá)技術(shù)可W有效和安生地產(chǎn)生該些蛋白。此處 提供的實(shí)例包括包括但不限于在酵母細(xì)胞中產(chǎn)生的GRP78/BiP、巧網(wǎng)蛋白和GRP58/E化57。 通過(guò)本發(fā)明方法產(chǎn)生的所得蛋白不具有標(biāo)簽。沒(méi)有標(biāo)簽用于純化該些重組蛋白；然而，蛋白 也可W具有His標(biāo)簽。通過(guò)本發(fā)明方法產(chǎn)生的所得蛋白在酵母細(xì)胞中得到正確加工，最終 蛋白產(chǎn)物由與人細(xì)胞中相同的氨基酸序列組成。所得的重組產(chǎn)物中不存在非天然修飾。所 得的重組蛋白的寡聚狀態(tài)對(duì)應(yīng)于從人組織中分離的天然人分子伴侶蛋白的寡聚狀態(tài)。本發(fā) 明方法產(chǎn)生的所得的重組蛋白具有完全的活性并且具有穩(wěn)定性。
[0044] S種人ER蛋白用作所公開(kāi)程序中的實(shí)例。從商用人肝臟cDNA文庫(kù)（Clonetech， USA)中克隆了編碼人邸分子伴侶蛋白BiP/GRP78(SEQIDN0:1)、巧網(wǎng)蛋白（SEQIDN0:2) 和E化57(SEQIDN0:3)的人基因服PA5(SEQIDN0:4)、CALR(SEQIDN0:5)和PDIA3(SEQ IDN0:6)(GeneBank編號(hào)分別為AF216292、M84739 和U42068)。對(duì)人基因的cDNA進(jìn)行 無(wú)損克隆，不改變對(duì)信號(hào)序列、ER保留信號(hào)進(jìn)行編碼的序列。對(duì)蛋白的功能性部分沒(méi)有 去除、修飾或w來(lái)自酵母或任何其他物種的基因的任何同源序列取代。核巧酸序列分析 后，人基因服PA5、CALR和PDIA3克隆到（Ciplys等，2011)所述的酵母PGK1基因啟動(dòng)子 控制的酵母表達(dá)載體P抑C中，得到3種重組質(zhì)粒P抑C-BiP、P抑C-CALR和P抑C-E化57。 攜帶人基因的P抑C-BiP、P抑C-CALR和P抑C-E化57酵母表達(dá)載體用于轉(zhuǎn)化釀酒酵母株 A肥2M/VTa(leu化is4)。酵母轉(zhuǎn)化和后續(xù)對(duì)轉(zhuǎn)化體的篩選完全按照（Ciplys等，2011)所述進(jìn) 行。在YEPD培養(yǎng)基（酵母提取1%，蛋白腺2%，右旋葡萄糖2%)中培養(yǎng)攜帶重組質(zhì)粒的 酵母細(xì)胞后，分析酵母細(xì)胞和生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的蛋白。令人驚訝的是，如圖1所示，重組人分 子伴侶不僅如此前所述（Ciplys等，2011)存在于酵母細(xì)胞的膜蛋白部分中，還W相當(dāng)大量 存在于培養(yǎng)基中，其構(gòu)成培養(yǎng)基中所有蛋白的約50 %~60 %。
[0045] 約1L的培養(yǎng)基含有40mg~50mg的分泌的人巧網(wǎng)蛋白和lOmg~15mg的BiP/ GRP78和E化57蛋白。利用抗各人分子伴侶的特異抗體通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析確認(rèn)蛋白的身 份（圖1B);泳道2-抗人BiP/GRP78的兔多克隆抗體（Ab21685,Abeam,UK);泳道3-抗人 巧網(wǎng)蛋白的小鼠單克隆抗體（Ab22683,Abeam,UK);和泳道4-抗人邸p57的小鼠單克隆抗 體（Abl3506，Abcam，UK)。所觀察到的該一人邸分子伴侶蛋白在酵母中利用其不具有任何 改變的完整cDNA核巧酸序列的高水平分泌現(xiàn)象此前從未有過(guò)報(bào)道。
[0046]為進(jìn)一步分析該過(guò)程，將人服PA5、CALR和PDIA3基因克隆到與P抑C相似但 在其他酵母基因AD肥、TD肥、TPI1、TEF和EN02的不同啟動(dòng)子控制下的酵母表達(dá)載體 中。為了表達(dá)人BiP、巧網(wǎng)蛋白和E化57蛋白，使用了不同釀酒酵母株巧188c、AH-214u、 AH-214uApep4)。利用不同啟動(dòng)子和株獲得的結(jié)果與圖1所示結(jié)果非常相似。該表明天然 氨基酸序列人分子伴侶在酵母培養(yǎng)基中的分泌與使用特定啟動(dòng)子或株進(jìn)行其合成無(wú)關(guān)，而 是酵母細(xì)胞的W下不同性質(zhì)的綜合