的孢子化卵囊2X107個加入等體積玻璃珠，用渦旋振蕩器 lOOOrpm振蕩5min，大部分孢子囊釋出后加入含1. 5%的胰酶及10%膽汁的脫囊緩沖液在 42°C作用40分鐘以脫囊釋放出子孢子。子孢子經(jīng)DE-52纖維素柱過柱除去雜質(zhì)后，得到的 子孢子蟲體用于間接免疫熒光染色。將子孢子懸液滴到載玻片上，甲醇固定后用制備的抗 植酸酶小鼠多抗作為一抗孵育，孵育后洗滌3次，再加入Texas Red標記的羊抗鼠二抗進行 孵育。5次洗滌后在熒光顯微鏡下觀察染色結果。
[0033] 4、SPF雞接種表達植酸酶的轉基因球蟲的鈣磷利用試驗
[0034] 將30只28日齡SPF雞分為3組，分別為空白組、野生球蟲組和轉基因球蟲組。所 有雞只在實驗期間均飼喂不添加植酸酶的全價顆粒飼料。第1天即給野生球蟲組和轉基因 球蟲組分別口服接種野生球蟲和轉基因球蟲，接種劑量均為5X 103。接種后每3天監(jiān)測雞 只體重、檢測糞便中磷的含量。
[0035] 5、結果
[0036] 經(jīng)間接免疫熒光(針對植酸酶蛋白）的染色確認，表達黃色熒光報告蛋白的球蟲 (圖1A)同時表達植酸酶（圖1B)。
[0037] 表達植酸酶的球蟲經(jīng)口接種后第6天，球蟲組雞只糞便中的磷含量就低于空白對 照組和野生型球蟲接種組，而從接種后第12天開始，轉基因球蟲組雞只糞便中的磷含量顯 著低于另外兩組。到試驗結束，轉基因球蟲組雞只體重顯著高于另外兩個對照組，且飼料報 酬也顯著高于兩個對照組。雞只體重（28-45日齡）和糞便中鈣磷含量（45日齡）的數(shù)據(jù)見 圖2。
[0038] 實施例2
[0039] 實施例1的步驟2和3,我們對比了連續(xù)傳代代數(shù)與獲得穩(wěn)定表達植酸酶轉基 因球蟲的關系。每一代的后代球蟲卵囊收集后，經(jīng)過純化和孢子化，在熒光顯微鏡下檢測 其發(fā)光效率，其計算公式為：發(fā)光率=黃色熒光蛋白表達的孢子化卵囊/所有的孢子化卵 囊X 100%。我們發(fā)現(xiàn)，第4代及第5代的發(fā)光效率分別為54%和83%，而藥物壓力篩選到 第6代時能獲得100%表達黃色熒光報告蛋白轉基因球蟲，隨后的連續(xù)傳代（7-9代)仍然為 100%表達熒光蛋白（見圖3)。通過實施例1中步驟3的鑒定，證實連續(xù)藥物壓力傳代6代 是獲得表達植酸酶的轉基因球蟲的最優(yōu)化條件。
[0040] 實施例3
[0041] 在一個轉基因球蟲對比試驗中，我們比較了商品化的重組植酸酶添加與應用本發(fā) 明獲得的轉基因球蟲對飼料中鈣磷利用效果的對比。
[0042] 將1日齡AA肉雞隨機分為空白對照組、植酸酶添加組和轉基因球蟲使用組(每組 10只雞)。飼料為無植酸酶添加的全價顆粒飼料(委托北京華都飼料有限公司小規(guī)模生產(chǎn))。 植酸酶添加組則在飼料中全程添加植酸酶5000 (蘇柯漢生物工程有限公司生產(chǎn))，添加量為 600g/kg。轉基因球蟲組的雞只在1日齡經(jīng)口服接種所述的表達植酸酶的轉基因和緩艾美 耳球蟲，每只雞接種劑量為為5X10 3孢子化卵囊。測定1-42日齡期間的糞便中鈣磷含量 (每7天測定一次)。
[0043] 檢測結果見圖4。可見飼料中添加重組的植酸酶可以明顯降低飼料中鈣磷的含量； 而口服接種表達植酸酶的轉基因球蟲后，雞只糞便中的鈣磷含量也有顯著降低，盡管其低 于植酸酶添加組。
[0044] 這個測定結果表明，表達植酸酶的轉基因球蟲可以有效降解飼料中的植酸，達到 提高飼料中鈣磷利用的目的，可以部分替代重組植酸酶的添加?；谇蛳x活疫苗在畜禽中 的有效應用，這種表達植酸酶的轉基因球蟲既可以作為疫苗預防畜禽球蟲病，在提高鈣磷 的利用的同時降低對環(huán)境的污染，一舉多得。
[0045] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
【主權項】
1. 一種提高禽畜鈣磷利用率的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟： 1) 獲取植酸酶基因全長DNA ; 2) 含有植酸酶基因的球蟲轉染載體的制備： 將上述植酸酶全基因構建至球蟲表達載體pMDEAAssA中，獲得球蟲轉染載體 pMDEA-phytase ； 3) 球蟲載體的轉染和轉基因球蟲的篩選： 將載體pMDEA-phytase轉染球蟲子孢子，并接種至畜禽體內(nèi)，利用藥物抗性基因進行 壓力篩選，收集糞便中的后代卵囊，進行篩選鑒定后獲得表達所述植酸酶的轉基因球蟲； 4) 將表達植酸酶的轉基因球蟲通過口服方式接種至畜禽體內(nèi)，使球蟲在腸道內(nèi)進行內(nèi) 生性發(fā)育的同時表達并釋放出植酸酶，降解植酸。
2. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述畜禽為雞、鴨、豬或兔。
3. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟1)從芽孢桿菌、黑曲霉菌或大腸 桿菌中利用PCR方法獲取植酸酶基因全長DNA。
4. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟2)具體為將步驟1)擴增得到的 植酸酶基因和球蟲表達載體pMDEAAssA用限制性內(nèi)切酶Agel、SacII酶切，將酶切片段進行 DNA片段回收、連接與轉化，然后小提質(zhì)粒進行鑒定，將鑒定陽性的質(zhì)粒進行大提，即得構建 好的球蟲轉染載體pMDEA-phytase。
5. 根據(jù)權利要求4所述方法中步驟2)構建得到的球蟲轉染載體pMDEA-phytase。
6. 根據(jù)權利要求5所述的載體在提高禽畜鈣磷利用率中的應用。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種提高禽畜鈣磷利用率的方法，所述方法包括：1）獲取植酸酶基因全長DNA；2）球蟲轉染載體pMDEA-phytase的制備；3）載體的轉染和轉基因球蟲的篩選；4）將表達植酸酶的轉基因球蟲通過口服方式接種至畜禽體內(nèi)，使球蟲在腸道內(nèi)發(fā)育的同時表達并釋放出植酸酶，降解植酸。本發(fā)明首次將不同來源的植酸酶基因表達于球蟲中，從而獲得重組的微型生物反應器，可產(chǎn)生直接應用于畜禽的植酸酶，無需生產(chǎn)及純化的設備和相關操作。
【IPC分類】C12N15-55, A23K1-165, A01K67-033, C12N9-16, C12N15-85
【公開號】CN104673830
【申請?zhí)枴緾N201410042182
【發(fā)明人】劉賢勇, 索勛, 羅雪, 索靜霞, 田秀玲, 秦梅, 湯新明
【申請人】中國農(nóng)業(yè)大學
【公開日】2015年6月3日
【申請日】2014年1月28日