一種提高禽畜鈣磷利用率的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種在禽畜體內(nèi)表達植酸酶基因從而 提高禽畜鈣磷利用率的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 植酸在多種植物組織(特別是種子）中作為磷的主要儲存形式，其以鈣鎂鉀鹽的形 式存在。以玉米、小麥等谷物為主要組份的畜禽(雞、牛、羊、豬等）飼料中都含有大量的植 酸。植酸的存在大大降低了飼料中可利用的鈣磷的含量。然而家禽(雞、鴨等）和非反芻動 物(豬、兔等）自身腸道內(nèi)無表達植酸酶的正常菌群而不能消化植酸，因此要想提高飼料中 鈣磷的利用效率，就需要在畜禽體內(nèi)利用植酸酶來降解植酸。
[0003]目前畜禽生產(chǎn)上主要通過在飼料中添加體外表達純化的植酸酶來解決上述問題。 而生產(chǎn)植酸酶的成本較高、其在飼料制作中不耐高溫，使得其應(yīng)用推廣受到一定的限制。根 據(jù)預(yù)測，2014年我國添加飼用植酸酶的飼料的比例將由50%左右提高到80%，按0. 013%的 添加比例計算，2014年飼用植酸酶需求量可達到4. 59萬噸，比2010年產(chǎn)量增長92. 76%。
[0004]因而開發(fā)一種在禽畜體內(nèi)表達植酸酶基因從而提高禽畜飼料鈣磷利用率的新方 法，將在畜禽養(yǎng)殖業(yè)取代或者部分取代飼料中植酸酶的添加，產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟效益，為畜牧 業(yè)生產(chǎn)提供動力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種在禽畜體內(nèi)表達植酸 酶基因從而提高禽畜鈣磷利用率的方法。
[0006]為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供一種提高禽畜鈣磷利用率的方法，所述方 法包括如下步驟：
[0007] 1)獲取植酸酶基因全長DNA ;
[0008] 2)含有植酸酶基因的球蟲轉(zhuǎn)染載體的制備：
[0009]將上述植酸酶全基因構(gòu)建至球蟲表達載體pMDEAAssA中，獲得球蟲轉(zhuǎn)染載體 pMDEA-phytase；
[0010] 3)球蟲載體的轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)基因球蟲的篩選：
[0011]將載體pMDEA-phytase轉(zhuǎn)染球蟲子孢子，并接種至畜禽體內(nèi)，利用藥物抗性基因 進行壓力篩選，收集糞便中的后代卵囊，進行篩選鑒定后獲得表達所述植酸酶的轉(zhuǎn)基因球 蟲；
[0012] 4)將表達植酸酶的轉(zhuǎn)基因球蟲通過口服方式接種至畜禽體內(nèi)，使球蟲在腸道內(nèi)進 行內(nèi)生性發(fā)育的同時表達并釋放出植酸酶，降解植酸。
[0013]作為優(yōu)選，所述畜禽為雞、鴨、豬或兔。
[0014]其中，所述步驟1)從芽孢桿菌、黑曲霉菌或大腸桿菌中利用PCR方法獲取植酸酶 基因全長DNA。
[0015] 進一步地，所述步驟2)具體為將步驟1)擴增得到的植酸酶基因和球蟲表達載 體pMDEAAssA用限制性內(nèi)切酶Agel、SacII酶切，將酶切片段進行DNA片段回收、連接與 轉(zhuǎn)化，然后小提質(zhì)粒進行鑒定，將鑒定陽性的質(zhì)粒進行大提，即得構(gòu)建好的球蟲轉(zhuǎn)染載體 pMDEA-phytase〇
[0016] 本發(fā)明還提供了根據(jù)步驟2)構(gòu)建得到的球蟲轉(zhuǎn)染載體pMDEA-phytase以及所述 載體在提高禽畜鈣磷利用率中的應(yīng)用。
[0017] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0018] (一）本發(fā)明首次將不同來源的植酸酶基因表達于球蟲中，從而獲得重組的微型生 物反應(yīng)器，可產(chǎn)生直接應(yīng)用于畜禽的植酸酶，無需生產(chǎn)及純化的設(shè)備和相關(guān)操作。
[0019] (二）本發(fā)明提供了 一種利用植酸酶提高畜禽鈣磷利用率的新方法，可以在畜禽腸 道內(nèi)直接產(chǎn)生植酸酶，從而幫助消化飼料中的磷酸。
[0020](三）本發(fā)明所獲得的表達植酸酶的轉(zhuǎn)基因球蟲使用簡單，成本低廉，應(yīng)用前景廣 闊。
【附圖說明】
[0021] 圖1為本發(fā)明表達植酸酶的轉(zhuǎn)基因球蟲的鑒定。其中：A為報告基因的表達情況； B為利用抗植酸酶多抗對球蟲子孢子進行免疫熒光染色的結(jié)果。
[0022] 圖2為本發(fā)明接種表達植酸酶的轉(zhuǎn)基因球蟲對雞增重及鈣磷利用的作用。其中： A為口服接種球蟲后，雞只的體重增長情況；B為對雞只排出的糞便中的鈣磷含量的測定結(jié) 果。
[0023] 圖3為球蟲轉(zhuǎn)染pMDEA-phytase質(zhì)粒后連續(xù)傳代得到的球蟲卵囊的發(fā)光效率。
[0024] 圖4應(yīng)用表達植酸酶的轉(zhuǎn)基因球蟲對肉雞利用飼料中鈣磷的作用。A為糞便中鈣 含量測定，B為糞便中磷含量測定。
【具體實施方式】
[0025] 以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0026] 實施例1
[0027] 1、載體構(gòu)建
[0028] 使用常規(guī)PCR技術(shù)將大腸桿菌的植酸酶全長基因（其核苷酸序列如SEQ ID No. 1 所示)擴增并在兩端分別加上Agel和SacII酶切位點序列，對測序正確的PCR產(chǎn)物用限制性 內(nèi)切酶Agel和SacII酶切，連入Agel和SacII酶切載體pMDEAAssA(由發(fā)明人所在實驗室 基于PBR322載體構(gòu)建而成，含有柔嫩艾美耳球蟲的mic2啟動子、藥物篩選基因DHFR-TS3m、 報告基因黃色熒光蛋白EYFP、柔嫩艾美耳球蟲的actin啟動子及3'調(diào)控序列、剛地弓形蟲 致密顆粒蛋白8的信號肽序列，其核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示）后得到的骨架中，然后 對獲得的陽性克隆進行鑒定。將鑒定正確的重組質(zhì)粒進行大提，即得構(gòu)建好的球蟲轉(zhuǎn)染載 體pMDEA-phytase (其核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示)。
[0029] 2、核轉(zhuǎn)染與轉(zhuǎn)基因球蟲的篩選
[0030] 將球蟲表達載體pMDEA-phytase用SnaBI進行酶切，然后乙醇沉淀線性化的 DNA片斷。取1X10 7個柔嫩艾美耳球蟲的子孢子，5-10iig的線性化質(zhì)粒，5iiL Ndel限 制性內(nèi)切酶和100 y L的核轉(zhuǎn)染緩沖液，混勻后移至電擊杯中，將電擊杯插入核轉(zhuǎn)染儀 Nucleofector II的電擊槽中，選擇核轉(zhuǎn)染程序U-033進行核轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染后立即向電擊杯里 加入1000 yL DMEM培養(yǎng)液，將轉(zhuǎn)染后的球蟲子孢子接種至7日齡無球蟲。在接種后第2天 開始，在飼料中加入乙胺嘧啶藥物（150微克/公斤）進行藥物壓力篩選。收集6~8天糞 便中的卵囊，孢子化后用流式細胞儀篩選發(fā)光的蟲體，接種雞，再收取卵囊，再接種雞并重 復(fù)上述藥物篩選過程，反復(fù)6代，獲得穩(wěn)定表達報告基因黃色熒光蛋白的后代群體。
[0031] 3、間接免疫熒光（IFA)鑒定
[0032] 取表達黃色熒光蛋白