β-擴(kuò)張蛋白基因GmEXPB2的新應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因的新應(yīng)用，具體涉及0 -擴(kuò)張蛋白基因GmEXPB2在提高豆科植物 氮效率方面的新應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 大豆[Glycine max(L. )Merr]起源于中國(guó)，是世界范圍內(nèi)重要的糧食、油料、飼 料和能源作物，在人們生活食品結(jié)構(gòu)中占有重要地位（Palander et al.，2005)。近年 來，隨著大豆消費(fèi)的增長(zhǎng)以及養(yǎng)殖業(yè)的飛速發(fā)展，國(guó)內(nèi)大豆供求出現(xiàn)嚴(yán)重失衡，我國(guó)大豆 生產(chǎn)和需求間的矛盾日益突出。2000年起，我國(guó)就已從傳統(tǒng)的大豆出口國(guó)變成現(xiàn)今世界 上最大的進(jìn)口國(guó)（楊文鈺等2008)。最新數(shù)據(jù)顯示，2013年我國(guó)大豆進(jìn)口量達(dá)6338萬 噸，同比增加8. 6 %，創(chuàng)記錄高位（中國(guó)糧油信息網(wǎng)，http: //www. chinagrain. cn/dad ou/2014/1/13/201411313313124408. shtml)。因此，為滿足國(guó)內(nèi)對(duì)大豆消費(fèi)的需要，我國(guó)有 必要大力發(fā)展大豆產(chǎn)業(yè)，解決大豆供需矛盾，以減少對(duì)大豆進(jìn)口的依賴。
[0003]我國(guó)大豆生產(chǎn)水平較低，究其原因主要是土壤養(yǎng)分有效性較低，例如土壤缺氮，是 限制大豆生產(chǎn)的主要因素之一。在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中，植物形成了一系列適應(yīng)低氮脅迫的 作用機(jī)制。其中，結(jié)瘤固氮是提高豆科作物氮效率的重要途徑。根瘤菌侵染豆科植物根系所 建立的共生體系，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及生態(tài)環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。研究表明，接種根瘤 菌可提高豆科作物的固氮能力，改善氮營(yíng)養(yǎng)，促進(jìn)根系生長(zhǎng)和提高作物產(chǎn)量（Ferreira et al.，2009)。在美國(guó)、巴西等大豆主產(chǎn)國(guó)，接種根瘤菌已成為大豆增產(chǎn)的主要措施之一，已大 面積推廣和應(yīng)用。而我國(guó)將根瘤菌接種技術(shù)應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，也取得了良好的效益（湯復(fù) 躍等2011 ;Mendes et al.，2003 ;Sogut 2006 ;de Freitas et al.，2012)。
[0004]根瘤的形成及器官膨大與細(xì)胞壁的形態(tài)建成密切相關(guān)，擴(kuò)張蛋白（Expansin)是 一類細(xì)胞壁松弛蛋白，在誘導(dǎo)細(xì)胞壁增大和軟化、根瘤生長(zhǎng)發(fā)育等方面扮演重要角色。
[0005]然而，關(guān)于擴(kuò)張蛋白在調(diào)控豆科作物結(jié)瘤固氮方面的研究非常有限，并且在大豆 中，調(diào)控根瘤形成和發(fā)育的擴(kuò)張蛋白基因尚未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]基于上述研究背景，發(fā)明人通過定量PCR及化學(xué)組織定位方法，鑒定了一個(gè)在大 豆根瘤形成早期高度表達(dá)的擴(kuò)張蛋白基因GmEXPB2。該基因參與調(diào)控了根瘤原基、皮層 細(xì)胞、薄壁細(xì)胞及早期根瘤微管組織的發(fā)育。
[0007]利用大豆轉(zhuǎn)基因復(fù)合植株及整株轉(zhuǎn)化植株研究表明，過量表達(dá)GmEXPB2顯著增加 了大豆根瘤數(shù)量和重量、提高了植株氮含量，最終增加了轉(zhuǎn)基因植株的生物量。
[0008]發(fā)明人的研究將為包括大豆在內(nèi)的豆科作物氮高效和高產(chǎn)分子育種提供基因資 源。
[0009]本發(fā)明的有益之處在于：此項(xiàng)研究對(duì)增加包括大豆在內(nèi)的豆科作物根瘤數(shù)量和重 量、提高植株氮含量、增加轉(zhuǎn)基因植株的生物量具有重要意義，對(duì)發(fā)展環(huán)境友好型可持續(xù)農(nóng) 業(yè)也具有重要的實(shí)踐意義，同時(shí)也為高產(chǎn)分子育種提供了基因資源。
【附圖說明】
[0010] 圖1為GmEXPB2基因表達(dá)模式分析；
[0011] 圖2為大豆轉(zhuǎn)基因復(fù)合植株中GmEXPB2啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)⑶S表達(dá)部位的解剖分析；
[0012] 圖3為過量、干涉GmEXPB2對(duì)大豆轉(zhuǎn)基因復(fù)合植株結(jié)瘤的影響；
[0013] 圖4為過量、干涉GmEXPB2在高低磷處理下對(duì)大豆轉(zhuǎn)基因復(fù)合植株生長(zhǎng)和氮/磷 含量的影響；
[0014] 圖5為過量表達(dá)GmEXPB2對(duì)大豆轉(zhuǎn)基因植株根系形態(tài)的影響；
[0015] 圖6為過量表達(dá)GmEXPB2的轉(zhuǎn)基因大豆接種根瘤菌USDA110-GFP的侵染過程；
[0016] 圖7為高、低磷處理下過量表達(dá)GmEXPB2對(duì)大豆結(jié)瘤的影響；
[0017] 圖8為過量表達(dá)GmEXPB2對(duì)大豆生長(zhǎng)及氮/磷含量的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作具體的介紹。
[0019] 一、3 -擴(kuò)張蛋白基因GmEXPB2表達(dá)模式分析
[0020] 在已公布的大豆基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中，通過同源比對(duì)，預(yù)測(cè)出大豆擴(kuò)張蛋白家族 共有9個(gè)成員，通過定量PCR技術(shù)，確定GmEXPB2基因?yàn)楦鲈鰪?qiáng)表達(dá)的基因。GmEXPB2基 因的開放閱讀框長(zhǎng)度為834bp，編碼278個(gè)氨基酸的蛋白，屬于0類細(xì)胞壁擴(kuò)張蛋白?，F(xiàn)有 的研究表明，該基因與結(jié)瘤固氮密切相關(guān)，首先分析了其表達(dá)模式。
[0021] 大豆種子HN66用3% (v/v)H202表面消毒一分鐘，在1/2全營(yíng)養(yǎng)液潤(rùn)濕的石英砂中 催芽萌發(fā)5天，接種根瘤菌1小時(shí)后轉(zhuǎn)移到低氮（氮素：530iiM NH4N03+KN03+Ca(N03) 2 *4H20) 營(yíng)養(yǎng)液中處理。分別收獲處理第7天的根瘤，第18天的根、莖、葉、花及處理第29天的豆莢 和種子并抽提RNA。對(duì)于比較分析GmEXPB2在不同生長(zhǎng)時(shí)期根瘤中的表達(dá)量，收獲接種根瘤 菌后第4天的根系、第7、14、21、30、40天的根瘤及非接種根瘤菌的第7天根系，并抽取相應(yīng) 部位的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)一步用定量PCR檢測(cè)GmEXPB2的表達(dá)模式。大豆的看家基因 EF-la作為內(nèi)參。用于定量PCR檢測(cè)基因表達(dá)量的引物分別為：
[0022] 大豆EF-la基因的引物為：
[0023] EF-la F:5, -TGCAAAGGAGGCTGCTAACT-3'（SEQ ID N0:1)
[0024] EF-la R:5, -CAGCATCACCGTTCTTCAAA-3'（SEQ ID N0:2)
[0025] GmEXPB2基因的引物為：
[0026] GmEXPB2F:5,-TGGTGCTTGTGGTTATGGAAGT-3'（SEQ ID N0:3)
[0027] GmEXPB2R:5'-TGAACCACACCCAGGACAGCT-3'（SEQ ID N0:4)
[0028] 定量PCR反應(yīng)程序?yàn)椋簩NA樣品反轉(zhuǎn)錄所得cDNA稀釋50倍作為定量PCR反應(yīng) 模板。選取適量cDNA原液做梯度稀釋為標(biāo)準(zhǔn)曲線的模板。試驗(yàn)中采用20 yL反應(yīng)體系，包 括：10yL 的 2XSYBR Green PCR master mix，各 0.6iiL 的 10iiM 正反向引物，2iiL 稀釋 的cDNA，最后用Mili-Q水補(bǔ)至20ii L。
[0029] 定量PCR反應(yīng)條件為：95°C變性1分鐘，然后94°C裂解15秒，60°C結(jié)合15秒，72°C 延伸30秒并進(jìn)行40次循環(huán)。
[0030] 用 Rotor-Gene 的 Real-Time Analysis Software 6. 0 計(jì)算每個(gè)樣品的表達(dá)量。
[0031] 圖1為GmEXPB2基因表達(dá)模式分析。其中：
[0032] 圖1⑷為GmEXPB2在不同組織中的表達(dá)；
[0033] 圖1 (B)為GmEXPB2在不同發(fā)育時(shí)期根瘤中的表達(dá)。
[0034] 圖中數(shù)據(jù)是3個(gè)生物學(xué)重復(fù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。
[0035] 結(jié)果表明：
[0036] (l)GmEXPB2在根瘤中的表達(dá)量最高，根部次之，在豆莢中亦存在微量表達(dá)，但在 莖、葉、花和種子中檢測(cè)不到該基因mRNA的積累，參見圖1 (A)。
[0037] (2)對(duì)不同發(fā)育時(shí)期的根瘤進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)GmEXPB2在接種4天后 的根系中增強(qiáng)表達(dá)，當(dāng)根瘤生長(zhǎng)到第7天時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大值，但隨著根瘤的生長(zhǎng)時(shí)間的 延長(zhǎng)，其表達(dá)量逐漸降低，當(dāng)根瘤生長(zhǎng)到30和40天時(shí)，幾乎檢測(cè)不到該基因的