一種用于敲除l-乳酸脫氫酶1基因的載體及構建方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術領域，具體涉及利用重疊延伸PCR的技術連接植物乳桿 菌DMDL9010中L-乳酸脫氫酶1上下游序列，并通過構建亞克隆載體為拼接的上下游片段 提供酶切位點，同時篩選得到用于構建以紅霉素為篩選標記的質粒，成功的構建用于敲除 目標菌L-乳酸脫氫酶1基因的重組載體。
【背景技術】
[0002] 高光學純度97%以上的D-乳酸或L-乳酸，是重要的手性中間體和有機合成原 料，能廣泛應用于制藥、高效低毒農(nóng)藥及除草劑、化妝品等領域的手性合成。D-乳酸在提高 聚乳酸熱穩(wěn)定性等方面也具有重要作用。目前限制D-乳酸的廣泛應用的主要原因有：（1) D-乳酸的生產(chǎn)成本高，其發(fā)酵生產(chǎn)的原材料成本高，提純和精制成本高；（2)沒有篩選到合 適的能發(fā)酵產(chǎn)生高光學純度D-乳酸的菌株，因為一般的乳酸菌主要以發(fā)酵產(chǎn)生L-乳酸為 主；（3)現(xiàn)有已知的乳酸菌一般不能利用戊糖，例如木糖、核糖和阿拉伯糖作為碳源。微生 物發(fā)酵法是目前制備D-乳酸的最主要方法之一，由于D-乳酸的理化性質與L-乳酸極其相 似，利用化學方法很難將兩種同分異構體分離開來，因此生產(chǎn)D-乳酸的關鍵在于篩選出高 光學純度D-乳酸高產(chǎn)菌種。
[0003]目前已證實，將L-乳酸脫氫酶基因敲除，能夠直接生產(chǎn)高光學純度的D-乳酸。傳 統(tǒng)的構建敲除L-乳酸脫氫酶1基因的重組載體的方法，需要在連接片段之間引入酶切位 點，并且酶切連接比較耗時，效率低；PCR對短于100bp和長幾十片段的重組很難成功。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為獲得更高純度的D-乳酸，本發(fā)明提供了一種L-乳酸脫氫酶編碼基因敲除的方 法，并提供了一種更有效的基因序列拼接的方法，主要是利用重疊延伸PCR的方法大量獲 得了 L-乳酸脫氫酶編碼基因的上下游拼接片段，再將拼接片段克隆到pG+h〇st9質粒載體 中構建得到用于敲除植物乳桿菌DMDL9010的重組載體。
[0005] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術方案：
[0006] 一種用于敲除L-乳酸脫氫酶1基因的載體的構建方法，包括如下步驟：
[0007] (1)從NCBI中找到L-乳酸脫氫酶1編碼基因的位置及其上下游800~lOOObp的 DNA序列，然后確定保守序列設計引物并引入重疊片段，提取植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum) DMDL 9010的DNA，并以此為模板，擴增得到不含L-乳酸脫氫酶編碼基因的該基 因的上下游DNA片段（如SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3所示），利用高保真酶進行重疊延伸 PCR連接該基因的上下游DNA片段（如SEQ ID NO. 1所示）；所述植物乳桿菌DMDL的保藏 編號為 CGMCC NO. 5172 ;
[0008] (2)將上述連接片段的:V端進行加A反應后與pMD18-T載體進行連接反應并轉 化到大腸桿菌DH 5a感受態(tài)細胞中，最后得到亞克隆載體，然后大量制備亞克隆載體，進 行Xho I和Pst I雙酶切，在重疊片段上引入粘性末端；
[0009] (3)將經(jīng)過Xho I和Pst I雙酶切處理的pG+host9質粒與步驟⑵制得的重疊片 段進行連接反應，然后將此連接產(chǎn)物化轉到大腸桿菌DH5 a藍白斑篩選后，進行一系列的 陽性克隆鑒定實驗（PCR鑒定和雙酶切鑒定）；
[0010] (4)從四種大腸桿菌中篩選得到用于構建以紅霉素為標記的重組載體的宿主大腸 桿菌MC1061和TG1，同時得到最適合篩選的紅霉素濃度500 y g/ml。
[0011] (5)利用Pst I、Xhol工具酶將上述亞克隆載體酶切后得含有粘性末端的目的片 段同時與被雙酶切的pG+host9進行連接，再經(jīng)熱轉化轉入大腸桿菌MC1061或TG1中，利用 紅霉素進行篩選陽性工程菌；
[0012] (6)對上述工程菌進行菌落PCR鑒定，陽性菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)提取質粒，然后進行雙酶 切鑒定，得到重組載體。
[0013] 所述重疊延伸PCR的條件為：單步重疊延伸PCR，模板濃度為0. 4ng/y 1，引入引物 的重疊片段為15bp。
[0014] 步驟⑴中所述引物如表1所示。
[0015] 表1 L-乳酸脫氫酶1編碼基因的上下游DNA片段的引物
[0016]
【主權項】
1. 一種用于敲除L-乳酸脫氫酶1基因的載體的構建方法，其特征在于，包括如下步 驟： (1) 從NCBI中找到L-乳酸脫氫酶1編碼基因的位置及其上下游800~lOOObp的 DNA序列，然后確定保守序列設計引物并引入重疊片段，提取植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum) DMDL 9010的DNA，并以此為模板，擴增得到不含L-乳酸脫氫酶編碼基因的該基 因的上下游DNA片段，利用高保真酶進行重疊延伸PCR連接該基因的上下游DNA片段；所述 植物乳桿菌DMDL的保藏編號為CGMCC NO. 5172 ; (2) 將上述連接片段的3'端進行加A反應后與pMD18-T載體進行連接反應并轉化 到大腸桿菌DH 5a感受態(tài)細胞中，最后得到亞克隆載體，然后大量制備亞克隆載體，進行 Xho I和Pst I雙酶切，在重疊片段上引入粘性末端； (3) 將經(jīng)過Xho I和Pst I雙酶切處理的pG+h〇st9質粒與步驟⑵制得的重疊片段進 行連接反應，然后將此連接產(chǎn)物化轉到大腸桿菌MC1061或TG1中，于紅霉素抗性平板上進 篩選陽性轉化菌，得到重組載體。
2. 根據(jù)權利要求1所的構建方法，其特征在于，所述重疊延伸PCR的條件為：單步重疊 延伸PCR，模板濃度為0. 4ng/ y 1，引入引物的重疊片段為15bp。
3. 權利要求1或2所述方法構建的載體。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于敲除L-乳酸脫氫酶1基因的載體及構建方法，該方法為將不含L-乳酸脫氫酶編碼基因的該基因的上下游DNA片段利用重疊延伸法完成拼接并將此拼接片段克隆到亞載體pMD18-T上，并轉化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，通過藍白斑篩選構建好的亞克隆載體，雙酶切得到目的條帶后連接到pG+host9質粒上，經(jīng)過菌落PCR以及雙酶切鑒定成功得到重組載體。本發(fā)明通過重疊延伸PCR的方法來構建敲除L-乳酸脫氫酶編碼基因的重組質粒，避免了酶切連接引入多余的堿基序列。本發(fā)明重組載體可用于生產(chǎn)高光學純度的D-乳酸。
【IPC分類】C12R1-25, C12N15-53, C12N15-74
【公開號】CN104673819
【申請?zhí)枴緾N201510070716
【發(fā)明人】劉冬梅, 費永濤, 黃娟, 陳思敏, 黃智斌
【申請人】華南理工大學
【公開日】2015年6月3日
【申請日】2015年2月10日