一種維持和恢復(fù)人毛乳頭細(xì)胞原始性的方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種維持和恢復(fù)人毛乳頭細(xì)胞原始性的方法 及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 毛發(fā)有重要的生理和社會(huì)功能，但現(xiàn)在隨生活壓力增大節(jié)奏加快，脫發(fā)的問(wèn)題越 來(lái)越嚴(yán)重。在毛發(fā)的再生和周期性更替過(guò)程中，毛乳頭細(xì)胞（dermal papilla cell, DPC) 起到非常重要的作用（參見(jiàn)文獻(xiàn)：Enshell-Sei jffers D，Lindon C，Kashiwagi M, Morgan BA. beta-catenin activity in the dermal papilla regulates morphogenesis and regeneration of hair. Dev Cell. 2010Apr 20 ;18 (4) :633_42)。DPC 是一群比較特殊的中 胚層來(lái)源的間質(zhì)樣細(xì)胞，可發(fā)出信號(hào)啟動(dòng)毛囊發(fā)育和毛發(fā)的周期性更替。其中，毛發(fā)的周期 性更替即毛囊周期是毛囊在成體哺乳動(dòng)物中經(jīng)歷一系列的周期活動(dòng)，可分為生長(zhǎng)期、退行 期和停滯期。毛囊周期紊亂會(huì)引起脫發(fā)。男女脫發(fā)都表現(xiàn)為進(jìn)行性毛囊微型化，導(dǎo)致毛發(fā) 生長(zhǎng)周期縮短。由于生長(zhǎng)期縮短，毛發(fā)變稀疏、變短到根本不生長(zhǎng)的程度。由于大部分脫發(fā) 是逐漸發(fā)展的，所以治療開(kāi)始得越早療效越好。
[0003] 體外培養(yǎng)條件下，代數(shù)較低的比較原始的DPC呈聚集狀生長(zhǎng)，表達(dá)蛋白聚糖 Versican、喊性憐酸酶（Alkaline phosphatase，ALPL)和 a_ 平滑肌肌動(dòng)蛋白（a-Smooth muscle actin，a-SMA)等DPC特有的標(biāo)記分子。其中，Versican，也可以作為毛乳頭細(xì)胞 毛發(fā)誘導(dǎo)能力的評(píng)價(jià)指標(biāo)，有報(bào)道在雄激素源性脫發(fā)患者縮小的毛囊內(nèi)，毛乳頭表達(dá)的 versican 的水平下降（參見(jiàn)文獻(xiàn)：Iida M，Ihara S，Matsuzaki T. Hair cycle-dependent changes of alkalinephosphatase activity in the mesenchyme and epithelium in mouse vibrissal follicles. Dev Growth Differ. 2007Apr;49 (3): 185-95)。隨傳代次數(shù) 增加，versican，ALPL和a-SMA的表達(dá)降低，DPC的原始性和誘導(dǎo)毛發(fā)發(fā)育及再生的能力或 逐漸丟失。
[0004] DPC的原始性的維持需要多種因素的參與，這一過(guò)程受多種因素影響，有些因素可 以減緩甚至扭轉(zhuǎn)這一進(jìn)程，使細(xì)胞的多能性增強(qiáng)。
[0005] 鏈接粘附分子JAM-A(GENBANK No:NM_016946)是一個(gè)跨膜分子，屬于免疫球蛋 白超家族，也稱之為JAM-1。本申請(qǐng)人前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，JAM-A修飾后的干細(xì)胞可促進(jìn)裸鼠 毛發(fā)再生（參見(jiàn)文獻(xiàn)：Wu M, Guo X，Yang L, Wang Y, Tang Y, Yang Y, Liu H. Mesenchymal stem cells with modification of junctional adhesion molecule a induce hair formation. Stem Cells Transl Med. 2014Apr ;3 (4) :481_8.)。本申請(qǐng)人也就 JAM-A相關(guān)研 究成果申請(qǐng)了中國(guó)專(zhuān)利，專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枮镃N201210532533. 5,公開(kāi)號(hào)為CN103031278A，發(fā)明 名稱為"JAM1基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞的方法及其應(yīng)用"。
[0006] 隨著研究的深入，長(zhǎng)鏈非編碼基因（long noncoding RNA，IncRNA)在發(fā)育 及干細(xì)胞原始性和多能性維持中的作用越來(lái)越受到大家重視（參見(jiàn)文獻(xiàn)：Wang Y，Xu Z, Jiang J, Xu C, Kang J, Xiao L, ffu M, Liu H. Endogenous miRNA sponge lincRNA-RoR regulates 0ct4, Nanog，and Sox2in human embryonic stem cell self-renewal. Dev Cell. 2013Aprl5 ；25(1) :69-80.) 〇
[0007] 這里，本發(fā)明人前期工作，經(jīng)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)JAM-A的3' UTR和 versican的3' UTR均存在與在斑秀患者中高表達(dá)的microRNA結(jié)合的位點(diǎn)，versican 的表達(dá)可維持DPC的凝聚樣生長(zhǎng)以及多能性（參見(jiàn)文獻(xiàn)：Kishimoto J, Ehama R, Wu L, Jiang S, Jiang N, Burgeson RE. Selective activation of the versican promoter by epithelial-mesenchymal interactions during hair follicle development. Proc Natl Acad Sci USA. 1999Jun22 ；96(13):7336-41.)〇
[0008] 本發(fā)明人進(jìn)一步設(shè)想JAM-A的3' UTR能否維持和促進(jìn)DPC的原始性及多能性呢？
[0009]目前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道有關(guān)JAM-A的3' UTR修飾毛乳頭細(xì)胞，以維持和增強(qiáng)其原始性 的研究及應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的在于提供JAM-A3' UTR的新用途，本發(fā)明的另一目的在于提供一種 維持和恢復(fù)人毛乳頭細(xì)胞原始性的方法，本發(fā)明的第三目的在于提供JAM-A3' UTR或者利 用JAM-A3' UTR來(lái)維持和恢復(fù)人毛乳頭細(xì)胞原始性的方法在毛發(fā)再生及制備皮膚移植物 中的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明的第一方面，提供了鏈接粘附分子JAM-A基因的3'UTR端（JAM-A3'UTR)的 新用途。
[0012] 本發(fā)明提供了 JAM-A3' UTR在體外培養(yǎng)條件下維持和/或恢復(fù)人毛乳頭細(xì)胞原始 性中的應(yīng)用，也即JAM-A的3' UTR在制備人毛乳頭細(xì)胞體外培養(yǎng)試劑中的應(yīng)用。
[0013] 所述的JAM-A3' UTR，即鏈接粘附分子JAM-A基因的3' UTR端，其具體序列如SEQID NO:3所示。
[0014] 所述的試劑，用于維持和/或恢復(fù)人毛乳頭細(xì)胞的原始性。
[0015] 本發(fā)明所述的維持和/或恢復(fù)人毛乳頭細(xì)胞的原始性，是指人毛乳頭細(xì)胞在體外 培養(yǎng)條件下，隨著傳代次數(shù)增加，versican, ALPL和a-SMA的表達(dá)不會(huì)降低，即人毛乳頭細(xì) 胞誘導(dǎo)毛發(fā)發(fā)育及再生的能力不會(huì)逐漸丟失。
[0016] 本發(fā)明所述的人毛乳頭細(xì)胞，可以來(lái)源于妙通（上海）生物科技有限公司，也可以 通過(guò)機(jī)械法結(jié)合酶消化法的方式獲得原代細(xì)胞或傳代細(xì)胞。
[0017] 本發(fā)明的第二方面，提供了一種在體外培養(yǎng)條件下維持和/或恢復(fù)人毛乳頭細(xì)胞 原始性的方法，該方法包括以下步驟：
[0018] A、構(gòu)建JAM-A3' UTR的重組質(zhì)粒；
[0019] B、將步驟A獲得的重組質(zhì)粒去轉(zhuǎn)染人毛乳頭細(xì)胞，獲得JAM-A 3'UTR高表達(dá)的人 毛乳頭細(xì)胞。
[0020] 所述的重組質(zhì)粒，為 pcDNA3. 1-JAM-A3' UTR。
[0021] 所述的步驟A，具體為：首先是根據(jù)JAM-A 3'UTR的基因結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)引物，以人表皮 細(xì)胞總DNA為模板，通過(guò)RT-PCR調(diào)取目的片段，再構(gòu)建重組人pcDNA3. 1-JAM-A3' UTR真核 表達(dá)載體。
[0022] 本發(fā)明所述的重組人pcDNA3. 1-JAM-A3' UTR真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染人毛乳頭細(xì)胞， 用表達(dá)的外源性JAM-A的3' UTR啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，獲得JAM-A的3' UTR高表達(dá)的毛乳頭細(xì)胞， 稱之為 JAM-A3' UTIT-DPC。
[0023] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，一種在體外培養(yǎng)條件下維持和/或恢復(fù)人毛乳頭 細(xì)胞原始性的方法，該方法為：
[0024] A、構(gòu)建 pcDNA3. 1-JAM-A3' UTR 真核表達(dá)載體；
[0025] B、將步驟A獲得的真核表達(dá)載體去轉(zhuǎn)染人毛乳頭細(xì)胞，獲得JAM-A3' UTR高表達(dá)的 人毛乳頭細(xì)胞。
[0026] 所述的步驟A具體如下：
[0027] A、構(gòu)建 pcDNA3. 1-JAM-A3' UTR 真核表達(dá)載體
[0028] 設(shè)計(jì)并合成引物如下：
[0029] PI：CCGCTCGAG GCCTGGTCGGCTCACCGCCTATC(SEQ IDN0:1)
[0030] P2 ：ATAAGAATGCGGCCGCTAAAGAATTGGATATTTTTTAATGCAAATTG(SEQIDNO:2)；
[0031] 以人表皮細(xì)胞總DNA為模板，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增，制備JAM-A 3'UTR (SEQ ID NO: 3)。
[0032] 其中的真核表達(dá)載體的構(gòu)建方法為常規(guī)方法，可參見(jiàn)工具書(shū)（著[美]J.莎姆布 魯克，黃培堂譯，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，科學(xué)出版社）。
[0033] 較佳地，首先從人表皮細(xì)胞中提取總DNA，然后通過(guò)PCR反應(yīng)調(diào)取目的片段，再 通過(guò)其兩端所含酶切位點(diǎn)直接連入酶切后的pcDNA3. 1載體上；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入制備好 的細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)長(zhǎng)出的單克隆菌落先進(jìn)行PCR鑒定，PCR鑒定陽(yáng)性菌落進(jìn)行測(cè)序 鑒定，比對(duì)正確的克隆即為構(gòu)建成功的pcDNA3. 1-JAM-A3'UTR表達(dá)載體。將脂質(zhì)體和 pcDNA3. 1-JAM-A3' UTR表達(dá)載體按3:1的比例混合，轉(zhuǎn)染到60-70%融合的DPC中。24小時(shí) 后觀察細(xì)胞狀態(tài)，棄去細(xì)胞上清，更換為新鮮培養(yǎng)基并通過(guò)G418篩選陽(yáng)性克隆。
[0034] pcDNA-3. 1 轉(zhuǎn)染組為對(duì)照組（C0N-DPC)。
[0035] 所述的步驟B具體如下：
[0036] B、將pcDNA3. 1-JAM-A3'UTR真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人毛乳頭細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆，獲 得 JAM-A 3'UTRoe DPC。
[0037] 所述的轉(zhuǎn)染步驟如下：
[0038] 按脂質(zhì)體（微升）：質(zhì)粒（微克）=3:1的比例對(duì)生長(zhǎng)至60%融合的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn) 染，24小時(shí)后更換新的培養(yǎng)基并用G418篩選陽(yáng)性克隆。分別標(biāo)記為JAM-A 3' UTR°e DPC和 JAM-A°e DPC，將對(duì)照用載體轉(zhuǎn)染的毛乳頭細(xì)胞稱之為C0N-DPC。）
[0039] 在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，轉(zhuǎn)染步驟具體為：
[0040] 取97ulDMEM到lml 0D管中，加入3ul fugen-6到DMEM中，用加樣槍混勻或拿手指 輕輕彈動(dòng)，之后室溫放置5分鐘。同時(shí)去1微克質(zhì)粒加入到總體積100微升的DMEM中，輕輕 混勻，靜置5分鐘。5分鐘后，將兩種液體用槍混勻，室溫放置30分鐘。30分鐘后用lOOul 槍吸出反應(yīng)液，均勻的滴入12孔板中，輕輕拍打，放入培養(yǎng)箱。培養(yǎng)過(guò)夜后，第二天早上換 正常培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)并用G418篩選陽(yáng)性克隆。分別標(biāo)記為JAM-A3'UTR°e DPC和JAM-A°e DPC，將對(duì)照用載體轉(zhuǎn)染的毛乳頭細(xì)胞稱之為C0N-DPC。
[0041] 本發(fā)明還提供了上述方法獲得的JAM-A 3' UTR°e-DPC，即JAM-A3' UTR高表達(dá)的人 毛乳頭細(xì)胞。
[0042] 繼續(xù)培養(yǎng)，觀察JAM-A 3' UTITDPC的生長(zhǎng)狀態(tài)，以及是否維持凝聚樣生長(zhǎng)，并記錄 其凝聚樣生長(zhǎng)可維持的代