數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，均可發(fā)現(xiàn)JAM-A 3'UTR°eDPC傳代至9代仍可 維持毛乳頭細(xì)胞的典型的生長特點(diǎn)即凝聚樣生長，并且同對照相比有較高的versican和 ALPL的表達(dá)。本發(fā)明用免疫組化法測量各組細(xì)胞的原始性指標(biāo)（ALPL和versican);本發(fā) 明通過裸鼠皮下注射法測量各組細(xì)胞促毛發(fā)再生的能力。
[0043] 本發(fā)明的第三方面，提供JAM-A3' UTR、含有JAM-A3' UTR的重組載體在毛發(fā)再生或 制備皮膚移植物中的應(yīng)用。
[0044] 較佳地，所述的含有JAM-A3' UTR的重組載體為重組人pcDNA3. 1-JAM-A3' UTR真核 表達(dá)載體。
[0045] 進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供了根據(jù)上述的在體外培養(yǎng)條件下維持和/或恢復(fù)人毛乳 頭細(xì)胞原始性的方法獲得的JAM-A 3' UTIT-DPC在毛發(fā)再生或制備皮膚移植物中的應(yīng)用。
[0046] 所述的應(yīng)用，也指制備促毛發(fā)再生或毛發(fā)增粗材料或在制備皮膚移植。
[0047] 本發(fā)明通過體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞形態(tài)無明顯變化，均是成纖維狀，凝聚 樣生長（見圖1)。實(shí)時(shí)PCR結(jié)果表明JAM-A3' UTR表達(dá)量增加（見圖2)。免疫組化鑒定發(fā) 現(xiàn)，JAM-A 3' UTR°e DPC較CON-DPC，versican和ALPL的表達(dá)量增加，細(xì)胞聚集樣生長的代 數(shù)增加（見圖3)。以104的細(xì)胞量接種于出生后21天的裸鼠背部皮膚下，14天后可JAM-A 3' UTR°eDPC移植組有較多的毛發(fā)出現(xiàn)（見圖4)，局部取材H. E染色可見JAM-A3' UTR°e DPC 移植組毛囊及毛乳頭直徑較對照組顯著增粗（見圖5)。
[0048] 本發(fā)明為人毛乳頭細(xì)胞體外培養(yǎng)、維持以及恢復(fù)DPC細(xì)胞的原始性提供了新的思 路和方式。本發(fā)明也為DPC移植誘導(dǎo)毛發(fā)再生提高了新的思路和方法。
【附圖說明】
[0049] 圖1為分離培養(yǎng)的人毛乳頭細(xì)胞；其中A為JAM-A 3' UTR高表達(dá)的第5代DPC，B 為空載體轉(zhuǎn)染的第5代DPC，C為JAM-A 3' UTR高表達(dá)的第7代DPC，D為空載體轉(zhuǎn)染的第 7代DP，E為JAM-A 3' UTR高表達(dá)的第9代DPC，F(xiàn)為空載體轉(zhuǎn)染的第9代DPCC，G為JAM-A 3' UTR高表達(dá)的第11代DPC，H為空載體轉(zhuǎn)染的第11代。可見JAM-A 3' UTR °e DPC凝聚樣 生長的時(shí)間延長。
[0050] 圖2為實(shí)時(shí)PCR的檢測結(jié)果，表明在第5代DPC中，JAM-A3'UTR表達(dá)量增加在 JAM-A 3' UTR。6 DPC 中較 C0N-DPC 顯著增加。
[0051] 圖3為免疫組化的鑒定結(jié)果。A為第5代JAM-A 3' UTR °e DPC中versican的組化 結(jié)果，B為第5代C0N-DPC中versican的組化結(jié)果，可見，JAM-A3' UTR過表達(dá)后，versican 的表達(dá)量也增加。C為第5代JAM-A3' UTIT DPC中ALPL的組化結(jié)果，D為第5代C0N-DPC 中ALPL的組化結(jié)果，可見，JAM-A3' UTR過表達(dá)后，ALPL的表達(dá)量也增加.
[0052] 圖4為JAM-A 3'UTR °e DPC及C0N-DPC移植后毛發(fā)再生情況；其中A為JAM-A 3' UTR°e DPC移植組，B為C0N-DPC移植組，C為同體積PBS移植組?？梢夾組移植處有較多 的毛發(fā)生成。
[0053] 圖5為JAM-A 3' UTR°e DPC及C0N-DPC移植處皮膚顯微結(jié)構(gòu)的改變。A為JAM-A 3' UTR°e DPC移植組，B為C0N-DPC移植組，C為同體積PBS?？梢夾組移植皮膚顯微結(jié)構(gòu)中 可見非常典型的毛囊樣結(jié)構(gòu)，毛乳頭大而明顯。
【具體實(shí)施方式】
[0054] 現(xiàn)結(jié)合實(shí)施例和附圖，對本發(fā)明作詳細(xì)描述，但本發(fā)明的實(shí)施不僅限于此。
[0055] 本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得或可按文獻(xiàn)方法制備。下列實(shí)施例中未注明 具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人《分子克?。簩?shí)驗(yàn)室指南》（New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照常規(guī)條件，或 按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。
[0056] 實(shí)施例1:構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3. 1-JAM-A3' UTR，感染人毛乳頭細(xì)胞（DPC)。
[0057] 1、毛乳頭細(xì)胞分離培養(yǎng)
[0058] 成人體皮來自長海醫(yī)院整形外科。原代培養(yǎng)得到毛乳頭細(xì)胞。因隨傳代次數(shù)增 加，毛乳頭細(xì)胞的形態(tài)及一些標(biāo)記分子的表達(dá)會(huì)發(fā)生變化，為保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性， 我們所有的體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)均選擇第5代毛乳頭細(xì)胞。
[0059] 2、制備人基因組DNA
[0060] 用Promega的Wizard?基因組DNA純化試劑盒，方法如下：
[0061] [1] ?收集人的細(xì)胞至一干凈的1. 5ml 0D管中；
[0062] [2].加入600微升核裂解液，用移液槍反復(fù)吹打以裂解組織，直到可見的組織塊 消失，65度靜置20min;
[0063] [3] ?加入3微升RNA酶，顛倒2-5次，37度30min，然后冷卻至室溫。
[0064] [4].加入200微升蛋白沉淀液并使用渦旋振蕩器高速劇烈振蕩2〇 SeC，轉(zhuǎn)移至冰 上冷卻5min;
[0065] [5].室溫12000rpm離心4min，形成白色致密的蛋白沉淀；
[0066] [6].小心移取上清（含DNA)至一干凈的1. 5毫升0D管中，加入600微升異丙醇， 移取上清的時(shí)候勿碰到沉淀；
[0067] [7].輕輕上下顛倒混勻溶液，直至白色線狀DNA形成塊狀沉淀；
[0068] [8].室溫12000rpm離心5min，此時(shí)可見白色DNA沉淀，小心棄去上清；
[0069] [9].加入600微升70%乙醇，輕輕顛倒0D管數(shù)次清洗DNA沉淀，室溫12000rpm 離心2min;
[0070] [10].小心棄去上清，并將0D管倒置于干凈的吸水紙上，自然干燥10至15min;
[0071] [11] ?加入100微升ddH20,60度烘箱中孵育1小時(shí)以溶解DNA;
[0072] [12] ? DNA樣品保存于-20°C冰箱。
[0073] 3、合成引物及構(gòu)建pcDNA3. 1-JAM-A 3' UTR真核表達(dá)載體
[0074](1)設(shè)計(jì)引物
[0075] FllRXhoIF:
[0076] 5'CCGCTCGAG GCCTGGTCGGCTCACCGCCTATC 3' （SEQ ID N0:1)
[0077] FlIRNotIR:
[0078] 5'ATAAGAATGCGGCCGCTAAAGAATTGGATATTTTTTAATGCAAATTG 3' （SEQ ID N0:2)
[0079] 酶切位點(diǎn)為Xhol和Notl，分別加入引物的5'端，并加入酶切位點(diǎn)的保護(hù)堿基。
[0080](2) PCR擴(kuò)增目的片段
[0081] 在0. 2mL EP管中配制以下體系，基因組DNA模板原液稀釋20倍后取0. 5iiL擴(kuò)增 F11R ：
[0082]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 鏈接粘附分子JAM-A基因的3' UTR端在制備人毛乳頭細(xì)胞體外培養(yǎng)試劑中的應(yīng)用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的鏈接粘附分子JAM-A基因的3' UTR端在制備人毛乳頭細(xì)胞體 外培養(yǎng)試劑中的應(yīng)用，其特征在于，所述的試劑在體外培養(yǎng)條件下維持或恢復(fù)人毛乳頭細(xì) 胞的原始性。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的鏈接粘附分子JAM-A基因的3' UTR端在制備人毛乳頭細(xì)胞體 外培養(yǎng)試劑中的應(yīng)用，其特征在于，所述的試劑使人毛乳頭細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下，隨著傳 代次數(shù)增加，versican，ALPL和a-SMA的表達(dá)量不會(huì)降低。
4. 一種在體外培養(yǎng)條件下維持或恢復(fù)人毛乳頭細(xì)胞原始性的方法，其特征在于，該方 法包括以下步驟： A、 構(gòu)建JAM-A3' UTR的重組質(zhì)粒； B、 將步驟A獲得的重組質(zhì)粒去轉(zhuǎn)染人毛乳頭細(xì)胞，獲得JAM-A 3' UTR高表達(dá)的人毛乳 頭細(xì)胞。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的在體外培養(yǎng)條件下維持或恢復(fù)人毛乳頭細(xì)胞原始性的方法， 其特征在于，步驟A構(gòu)建的重組質(zhì)粒為pcDNA3. 1-JAM-A3' UTR。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的在體外培養(yǎng)條件下維持或恢復(fù)人毛乳頭細(xì)胞原始性的方法， 其特征在于，所述的步驟A為：首先是根據(jù)JAM-A 3'UTR的基因結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)引物，以人表皮細(xì) 胞總DNA為模板，通過RT-PCR調(diào)取目的片段，再構(gòu)建重組人pcDNA3. 1-JAM-A3' UTR真核表 達(dá)載體。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的在體外培養(yǎng)條件下維持或恢復(fù)人毛乳頭細(xì)胞原始性的方法， 其特征在于，所述的步驟A如下： A、 構(gòu)建pcDNA3. 1-JAM-A3' UTR真核表達(dá)載體 設(shè)計(jì)并合成引物如下： PI ：CCGCTCGAG GCCTGGTCGGCTCACCGCCTATC(SEQ ID N0:1) P2 ：ATAAGAATGCGGCCGCTAAAGAATTGGATATTTTTTAATGCAAATTG(SEQ ID NO:2)； 以人表皮細(xì)胞總DNA為模板，通過RT-PCR擴(kuò)增，合成JAM-A 3' UTR (SEQ ID NO: 3)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的在體外培養(yǎng)條件下維持或恢復(fù)人毛乳頭細(xì)胞原始性的方法， 其特征在于，所述的步驟B如下： B、 將pcDNA3. 1-JAM-A3'UTR真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人毛乳頭細(xì)胞，篩選陽性克隆，獲得 JAM-A 3' UTRoe DPC ； 所述的轉(zhuǎn)染步驟為：按脂質(zhì)體：質(zhì)粒=3:1(微升/微克）的比例對生長至60%融合的 細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，24小時(shí)后更換新的培養(yǎng)基并用G418篩選陽性克隆。
9. 鏈接粘附分子JAM-A基因的3' UTR端在制備毛發(fā)再生、毛發(fā)增粗材料或制備皮膚移 植物中的應(yīng)用。
10. -種JAM-A 3' UTR高表達(dá)的人毛乳頭細(xì)胞在制備毛發(fā)再生、毛發(fā)增粗材料或制備 皮膚移植物中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明提供了JAM-A的3'UTR的新用途，本發(fā)明成功構(gòu)建JAM-A的3'UTR的表達(dá)質(zhì)粒，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人毛乳頭細(xì)胞(DPC)，獲得JAM-A3'UTRoeDPC。JAM-A3'UTRoe DPC較DPC，可在體外較長時(shí)間維持毛乳頭的原始性，更多代數(shù)的其凝聚樣生長，更高水平的表達(dá)DPC的特異性標(biāo)記分子如versican和ALPL。將各組細(xì)胞移植到3周齡裸鼠皮膚組織，發(fā)現(xiàn)該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的DPC，可顯著地促進(jìn)裸鼠毛發(fā)的生長并且使得新生毛發(fā)較對照組增粗。本發(fā)明為人毛乳頭細(xì)胞體外培養(yǎng)、維持以及恢復(fù)DPC細(xì)胞的原始性提供了新的思路和方式。本發(fā)明也為DPC移植誘導(dǎo)毛發(fā)再生提高了新的思路和方法。
【IPC分類】C12N15-85, A61P17-14, C12N15-113, C12N5-10, A61L27-60, A61K35-36, A61L27-38
【公開號(hào)】CN104673831
【申請?zhí)枴緾N201410830811
【發(fā)明人】劉厚奇, 仵敏娟, 王越, 徐辰, 夏照帆, 徐莎
【申請人】中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)
【公開日】2015年6月3日
【申請日】2014年12月22日