配W無血清 培養(yǎng)基（Opti-MEM I Reduced Serum Medium(Gibco) 200 yl、轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體 Lipofectmine 2000 (Invitrogen) 10 y 1 和巧光探針 FAM-AAM-155 (lOnmol)或 FAM-Control 混合溫育 5min 后加入1790 yl無血清培養(yǎng)基（Opti-MEM I Reduced Serum Medium),室溫下解育20min。加 入巧光探針的細(xì)胞37°C下解育6小時(shí)和24小時(shí)。去除細(xì)胞孔內(nèi)混合培養(yǎng)基，用PBS液清洗 S次，每次5min，加入4%多聚甲醒200 y 1固定細(xì)胞30min，用PBS液清洗S次，每次5min， 加入200 y 1 TritonX-100透膜20min，用PBS液清洗S次，每次5min，加入150 y 1 DAPI染 核5min，后再用PBS清洗S次。準(zhǔn)備載玻片，滴上封片液，將帶有已完成巧光轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的載 玻片細(xì)胞面覆蓋其上并封片。
[0164] 制備完成的細(xì)胞片置于共聚焦巧光顯微鏡下觀察，HepG2及化La細(xì)胞的 FAM-AAM-155和對照組FAM-Control細(xì)胞水平分布如圖7。經(jīng)過6小時(shí)解育，F(xiàn)AM-AAM-155 組細(xì)胞內(nèi)的巧光水平高于對照組的巧光強(qiáng)度，解育24小時(shí)后，F(xiàn)AM-AAM-155組巧光仍較強(qiáng) 烈，而FAM-Control則明顯減弱，二者差別增大。如結(jié)果所示，AAM-155和control對照組 均能被轉(zhuǎn)染至化pG2細(xì)胞和化La細(xì)胞內(nèi)，但經(jīng)過24小時(shí)的解育后，AAM-155仍能保持足夠 的活性，和祀位點(diǎn)穩(wěn)定結(jié)合而少有降解。
[0165] 3.腫瘤細(xì)胞攝取率
[0166] 當(dāng)24孔板中的MCF-7細(xì)胞生長密度達(dá)到80%左右時(shí)，向每孔中分別加入等量的 99mTc-AAM-155(lpmol)和"-Tc，同時(shí)加入脂質(zhì)體，進(jìn)行常規(guī)轉(zhuǎn)染操作。分別在加入后lh、2h、 化、6h、她、1化時(shí)分別收集上清和細(xì)胞，分別測定其放射性計(jì)數(shù)。將培養(yǎng)液與3次的PBS洗 液合并，并用井型計(jì)數(shù)器測定放射性計(jì)數(shù)，計(jì)做Cout ;之后用含有0. 5M氨氧化鋼和1 %的 SDS細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞后，收集裂解液及3次PBS洗液，同樣測定其合并的放射性計(jì)數(shù)，計(jì) 做Cin，細(xì)胞攝取率計(jì)算按照如下公式計(jì)算Cin/(Cin+Cout)。
[0167] 結(jié)果如圖8所示，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的探針的腫瘤攝取率均隨著時(shí)間的延長而不斷增 加。"mjc-AAM-lSS組的腫瘤細(xì)胞攝取率，在lOh時(shí)達(dá)到最大，為50. 15 + 1.90% (n = 4)， 99-Tc液對照組在1化的細(xì)胞攝取率為2. 11 + 0. 15% (n = 4)，二者存在顯著差異任<0.01)， "mTc-AAM-155組的腫瘤細(xì)胞攝取率明顯高于"-Tc對照組，表明"mjc-AAM-lSS提高腫瘤細(xì) 胞攝取率，攝取率高，說明能特異性分布于腫瘤細(xì)胞的能力強(qiáng)。
[0168] 四、荷瘤裸鼠活體評價(jià)
[0169] 1、動(dòng)物模型的構(gòu)建
[0170] 動(dòng)物選擇BALB/c nu/nu裸鼠（雌性，20±4g，4-6周齡），購買及飼養(yǎng)于北京大學(xué) 第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中屯、。成瘤方式有兩種，一種為細(xì)胞注射法，于每只裸鼠右上肢膠下注射 1 X 1〇7腫瘤細(xì)胞，將單層培養(yǎng)的細(xì)胞消化脫壁后稀釋為一定濃度的細(xì)胞懸液，移植于動(dòng)物 皮下或其他部位。另一種為瘤塊接種，將選取的瘤組織將瘤取出后，切開，選出生長良好而 無變性壞死、呈淡紅色、魚肉狀的瘤組織，切成小塊（約l-2mm);飼養(yǎng)1周左右即可在注射 部位成瘤。當(dāng)腫瘤成長至直徑為1cm時(shí)，分別作生物學(xué)分布實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)顯像實(shí)驗(yàn)。
[0171] 2、荷瘤裸鼠的體內(nèi)分布
[0172] 當(dāng)腫瘤達(dá)到合適大小的時(shí)候，分別通過尾靜脈注射lyg(5〇yCi)的實(shí)施例1的 "mTc-AAM-155 和 1 y g (50 y Ci) "-Tc-control 探針，體積均為 200 y 1。分別于注射后 lh、2h、 化、6K她或lOh，對每組3只裸鼠進(jìn)行取血，并脊髓拖斷處死。分別解剖取屯、、肝、脾、肺、腎 臟、胃、小腸、膀脫、小腿長骨、肌肉和腫瘤，稱重并利用Nal(Tl)計(jì)數(shù)儀測定放射性計(jì)數(shù)。分 布結(jié)果分別記為每克組織的放射性計(jì)數(shù)的百分?jǐn)?shù)（％ ID/g)和腫瘤/非腫瘤（T/NT)比值。
[0173] 體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)顯示，在U87荷瘤裸鼠模型中，各臟器放射性計(jì)數(shù)隨時(shí)間延長而下 降（表1和表2)。放射性標(biāo)記的核酸分子在肝臟的放射性計(jì)數(shù)在各時(shí)間點(diǎn)均為最高，其次 為腎臟。血液的放射性在注射后開始較高，但是隨著時(shí)間延長迅速下降，注射后1化達(dá)到最 低。血運(yùn)豐富的臟器例如屯、臟、肺臟、脾臟和骨髓的放射性分布情況與血液的分布情況類 似，均隨著時(shí)間延長不斷降低。注射"mTc-AAM-155探針后，雖然腫瘤的放射性計(jì)數(shù)在注射后 逐漸減少，由化51 + 1. 51) % ID/g降低至化12 + 0. 01) % ID/g，但是其它臟器的放射性計(jì) 數(shù)降低得更快，特別是血液的放射性分布，血液的放射性分布由化82 + 2. 01) % ID/g降至 (0.36 + 0.04)% ID/g?？梢?，miR-155祀向的核酸在腫瘤部位其放射性攝取清除較慢。相 比之下，"-Tc-control對照探針的腫瘤的放射性攝取較低，注射后比到化的放射性攝取逐 漸減低，由化96 + 0. 27) % ID/g降至化49 + 0. 05) % ID/g，顯著低于實(shí)驗(yàn)組探針各時(shí)間點(diǎn) 時(shí)的腫瘤攝取（P<〇. 01)。"mTc-AAM-155探針在血液和肌肉等多種器官的T/NT比值顯著高 于對照組（圖9及圖10)。此外，"mTc-AAM-155探針在荷MCF-7腫瘤裸鼠模型中，同樣顯示 出較好的腫瘤攝取，其腫瘤部位的放射性分布及各部位的T/NT比值均顯示99-Tc-AAM-155 探針的活體腫瘤祀向分布特性（表3及圖11)。
[0174] 表1 99-Tc-AAM-155實(shí)驗(yàn)組探針在l、2、4、6、8、10h各時(shí)間點(diǎn)的荷U87裸鼠實(shí)驗(yàn)組 體內(nèi)生物分布結(jié)果（％ ID/g)。每個(gè)數(shù)值表示為平均值+標(biāo)準(zhǔn)差（n = 3)
[0175]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種microRNA-155靶向探針A，其核苷酸序列為序列2,且序列2的第一位核苷酸通 過己基連接伯胺，序列2第1-6位核苷酸和第18-23位核苷酸均經(jīng)硫代修飾，第1-3位核苷 酸和第21-23位核苷酸均經(jīng)2' -甲氧基修飾。
2. -種microRNA-155靶向探針B，為用放射性核素標(biāo)記所述靶向探針A，得到 microRNA-155 靶向探針 B。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的靶向探針B，其特征在于：所述放射性核素為99nTc。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的靶向探針B，其特征在于：所述放射性核素是通過螯合劑 NHS-MAG3標(biāo)記到所述靶向探針A上。
5. -種顯像劑，其活性成分為權(quán)利要求1所述的靶向探針A或權(quán)利要求2-4中任一所 述的靶向探針B。 或microRNA-155作為腫瘤顯像劑靶點(diǎn)中的應(yīng)用。
6. 權(quán)利要求2-4中任一所述的靶向探針B在制備顯像劑中的應(yīng)用。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述顯像劑或權(quán)利要求6所述應(yīng)用，其特征在于：所述顯像劑為腫 瘤影像顯像劑。
8. -種制備靶向探針B的方法，包括如下步驟： 1) 將權(quán)利要求1所述的靶向探針A和NHS-MAG3溶液混勻，螯合反應(yīng)，收集反應(yīng)產(chǎn)物，即 得到螯合后靶向探針A ; 2) 將所述螯合后靶向探針A和放射性核素在含有氯化亞錫和酒石酸鈉的反應(yīng)體系中 反應(yīng)，收集反應(yīng)產(chǎn)物，即得到靶向探針B。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于： 所述放射性核素為99mTc ; 步驟1)中，所述NHS-MAG3溶液中NHS-MAG3的濃度為7-8mg/ml，所述NHS-MAG3溶液中 NHS-MAG3的濃度具體為L 25mg/ml ; 步驟2)中，所述含有氯化亞錫和酒石酸鈉的反應(yīng)體系中的氯化亞錫的濃度為3-5mg/ ml，所述含有氯化亞錫和酒石酸鈉的反應(yīng)體系中的氯化亞錫的濃度具體為4mg/ml ; 所述含有氯化亞錫和酒石酸鈉反應(yīng)體系中的酒石酸鈉的濃度為6-8 μ g/ μ 1 ;所述含 有氯化亞錫和酒石酸鈉反應(yīng)體系中的酒石酸鈉的濃度具體為7 μ g/ μ 1。
10. 權(quán)利要求1所述的microRNA-155靶向探針A或權(quán)利要求2-4中任一所述靶向探針 B在制備1)-6)至少一種產(chǎn)品中的應(yīng)用： 1) 促進(jìn)腫瘤細(xì)胞中的C/ΕΒΡβ蛋白表達(dá)產(chǎn)品； 2) 提尚腫瘤細(xì)胞攝取率廣品； 3) 腫瘤影像顯像劑； 4) 用于腫瘤的活體顯像產(chǎn)品； 5) 在活體水平示蹤microRNA-155的體內(nèi)分布情況產(chǎn)品； 6) 檢測和/或定位腫瘤產(chǎn)品； 所述腫瘤具體為乳腺癌、膠質(zhì)瘤、宮頸癌、肝癌或黑色素瘤； 所述腫瘤細(xì)胞具體為乳腺癌細(xì)胞MCF-7、膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87、宮頸癌細(xì)胞HeLa、肝癌細(xì)胞 !fepG2或黑色素瘤細(xì)胞A375。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于腫瘤顯像的放射性核素標(biāo)記的microRNA-155靶向探針。本發(fā)明提供了一種microRNA-155靶向探針A，為將microRNA-155靶向核酸的5’端與1個(gè)氨基通過己基連接，所述microRNA-155靶向核酸的核苷酸序列為序列表中序列2；所述序列2自5’末端第1-6位核苷酸和第18-23位核苷酸均經(jīng)硫代修飾，且自5’末端第1-3位核苷酸和第21-23位核苷酸均經(jīng)2’-甲氧基修飾。本發(fā)明的99mTc-AAM-155可有效的用于腫瘤的活體顯像，而且能夠在活體水平示蹤miR-155的體內(nèi)分布情況。
【IPC分類】A61K103-10, C12N15-11, A61K51-06, C12N15-10
【公開號】CN104630216
【申請?zhí)枴緾N201510037255
【發(fā)明人】康磊, 王榮福, 徐小潔, 閆平, 張春麗, 霍焱
【申請人】北京大學(xué)第一醫(yī)院
【公開日】2015年5月20日
【申請日】2015年1月23日