例2、miR-155祀向探針"mTc-AAM-155的功能驗證
[0124] 一、血清穩(wěn)定性的評價
[0125] 將實施例1制備的miR-155祀向探針"mTc-AAM-155置于人新鮮血清中，室溫條件 下放置12h，HPLC測定其放射化學純度及凝膠電泳測定核酸穩(wěn)定性。
[01%] 1.核酸血清穩(wěn)定性
[0127] 測定探針在新鮮人血清中的12h內的穩(wěn)定性（Oh、化、化、化、她、10h、12h)
[012引 （1)取人新鮮血清80 y 1-120 y 1，均分為8份；
[0129] (2)將99-Tc-AAM-155 (化學修飾AAM-155,總量為4nmol)用45 y 1緩沖液溶解，按 照體積比1:2或1:3溶于血清，每樣約44化mol,加樣時按照倒序加樣，最先加樣12h點，臨 跑膠時加樣化?；靹?，室溫靜置。
[0130] 做配制2%的瓊脂糖凝膠，200V，鑒定。
[0131] W未進行化學修飾的AAM-155為對照。
[0132] 未進行化學修飾的AAM-155的制備方法；與"mTc-AAM-155方法基本一致，僅將化 學修飾后miR-155祀向核酸替換為未進行化學修飾miR-155祀向核酸；
[0133] 未進行化學修飾miR-155祀向核酸與化學修飾后miR-155祀向核酸的區(qū)別僅在于 不進行硫代修飾和2' -甲氧基修飾，其余均相同。
[0134] 結果如圖4,與未進行化學修飾的AAM-155相比，"mTc-AAM-155在12h內，探針在 凝膠中均表現(xiàn)為唯一條帶，但隨著時間延長，條帶亮度未見明顯降低，條帶單一，未見拖尾 及擴散征象。相比之下，未進行化學修飾的AAM-155可見條帶亮度隨時間延長明顯減低，且 向周圍擴散，提示未化學修飾的探針在血清中降解明顯。此結果證明2' -OMe及PS化學修 飾方式能夠顯著提高探針在血清中的穩(wěn)定性。
[01巧]2.放射性探針的標記穩(wěn)定性
[0136] 將"mTc-AAM-155置于新鮮人血清中在37°C條件下解育，探針濃度為0. 01 y g/ y 1。使用HPLC,流動相A為己膳，流動相B為0.1 M的TEAB，pH 8. 0,洗脫梯度為A從Omin 時20 %到35min時40 %，洗脫流速為1. 5ml/min)，填充物為Se地adex G25(柱體積為 25mmX9mm、上樣量為30nmol)，測定產物的放射性計數(shù)，分別測定探針化、她、12h的放化純 度。
[0137] 分別測定99-Tc-AAM-155探針在人新鮮血清中解育化、她、1化時的放化純度，HPLC 結果如圖5,顯示各時間點下探針的260nm吸光度值和放射性值均顯示為單峰，所得放化純 度均大于98%，說明標記探針在血清中沒有受到多種酶成分的影響而降解，且無脫標現(xiàn)象， 提示探針具有良好的血清穩(wěn)定性。W上結果提示2'-0Me及PS化學修飾方式可W大大提高 miRNA-155分子在多種理化條件下的穩(wěn)定性，且通過MAG3馨合的"-Tc標記的產物可在多種 條件下保持標記的穩(wěn)定性，都為將來miRNA反義探針在體內試驗的研究奠定了研究基礎。 [013引 二、"mTc-AAM-155細胞水平祀向調控C/EBP 0蛋白活性
[0139] C/EBP0蛋白是miRNA-155的祀蛋白之一，miR-155抑制C/EBP0的表達，而 AAM-155能夠通過抑制miR-155的活性從而增加細胞內C/EBP0的表達。本研究通過評價 AAM-155轉染后的細胞中C/EBP e蛋白的表達，進而對99-TC-AAM-155標記探針的活性評價。 具體步驟如下：
[0140] 1.細胞轉染
[0141] 1)6孔細胞培養(yǎng)板
[0142] MCF-7細胞系（購自美國典型培養(yǎng)物保藏中屯、（ATCC)，保藏編號為皿-8065)飼 養(yǎng)于高糖培養(yǎng)基值U化ecco' S Modified Eagle Medium,DMEM)中。轉染前一天，W合適的 細胞密度（30% -40% )接種到6孔培養(yǎng)板上，得到6孔細胞培養(yǎng)板。轉染時，細胞要達到 60 ~70%。
[0143] 2)混合液A
[0144] 每孔準備 240 y 1 的無血清培養(yǎng)基（Opti-MEM I Reduced Serum Medium)和 10 y 1 轉染脂質體（Lipofectmine 2000)(總體積250 y 1)混合，溫育5min，得到混合液A。
[0145] 扣混合液B
[0146] 每孔準備終濃度lOnmol的核酸探針和無血清培養(yǎng)基的pti-MEM I Re化ced Serum Medium)混勻，得到的混合液B，體積為250 y 1。
[0147] 4)轉染
[0148] 向1)的6孔細胞培養(yǎng)板中每孔均加入混合液A和混合液B，室溫下靜置20min ;再 將6孔板中的細胞用PBS沖洗細胞，加入2ml無血清培養(yǎng)基；再將解育后的混合液A逐滴加 入孔中，搖動培養(yǎng)板，輕輕混勻，得到轉染后細胞。
[0149] 在37°C，5%的C〇2中解育6小時后，更換含有10%的胎牛血清（Gibco)的全培養(yǎng) 基，在37°C，5%的CA中48~7化檢測蛋白表達水平。實驗設置=個復孔。
[0150] 上述核酸探針為未偶聯(lián)AAM-155探針（實施例1的步驟一的2制備 的MAG3-AAM-155)、未標記的MAG3-AAM-155探針（實施例1的步驟二的1制備的 MAG3-AAM-155)、標記的"mTc-AAM-155探針（實施例1的步驟二的2制備的w-Tc-AAM-ISS)、 未偶聯(lián)control探針（實施例1的步驟一的2制備的control)、未標記的MAG3-control探 針（實施例1的步驟二的1制備的MAG3-control)、標記的"-Tc-control探針（實施例1 的步驟二的2制備的"-Tc-control)。
[0151] 通過導入不同的核酸分子上述實驗分為6組；未偶聯(lián)AAM-155探針組、偶聯(lián) MAG3-AAM-155 探針組、"mTc-AAM-155 組、control 對照組、偶聯(lián) MAG3-control 對照組及 "-Tc-control標記對照組。
[0152] 2.蛋白印跡（Western-blotting)檢測C/EBP0蛋白的表達
[015引轉染后3d采用Western blotting法測定各組細胞中miR-155祀蛋白C/EBP0的 表達量，測定AAM-155對C/EBP 0蛋白的影響效果，具體如下；
[0154] 分別收集轉染后3天的上述1的6個組的2 X 106個細胞，加入0. 5~1ml預冷細 胞裂解液巧0mmol/L肥陽S，PH 7.0,500mmol/L化Cl，l%NP-40，100μg/mlPMSF，lμg/ml AEBS巧，充分混勻，冰浴放置30分鐘，期間縱禍振蕩2~3次。10, 00化pm，4°C離屯、10分鐘， 取上清，測定蛋白濃度。
[0155] SDS-聚丙締酷胺凝膠電泳（SDS-PAGE)的分離膠濃度為8%。上述提取的細胞總 蛋白的上樣量為150 y g/孔道，恒壓5V/cm電泳，電泳畢，置凝膠于轉膜緩沖液中平衡5分 鐘。取聚偏氣己締膜（Hybond-polyvin}didene difluoride membranes, ?￥0巧，先用甲醇 浸潤后再用純水漂洗5分鐘，置轉膜緩沖液中平衡10分鐘。采用干轉系統(tǒng)炬io-Rad)，恒 壓15V，轉膜lh。轉膜畢，將PVDF膜置于含5%脫脂牛奶的lXTBS溶液中常溫封閉lh。一 抗分別用加入1 ;400稀釋的C/EBP 0 -抗和1 ; 5000稀釋的對照蛋白GAPDH抗體，4度解育 過夜。用0. 05% Tween-20的TBST溶液洗漆S次，每次5分鐘。一抗均購于Santa化UZ 公司。二抗；1:5000稀釋的HRP標記的二抗IgG(北京中衫生物科技公司），室溫振蕩解 育比后，0. 05 % Tween-20的TBST溶液洗漆3次，每次10分鐘。按試劑說明，加發(fā)光試劑 Qiemiluminescence Luminant Reagent 解育 1 分鐘，X 光膠片曝光成像。
[0156] Western blotting結果見圖6左圖，可見相比對照組，未偶聯(lián)AAM-155探針、未標 記的MAG3-AAM-155探針和標記的"mTc-AAM-155探針處理組的C/EBP 0蛋白表達均顯著增 局，而AAM-155換針之間無顯者差異。
[0157] 參照管家蛋白的表達量，如圖6右圖所不，未偶聯(lián)AAM-155探針、未標記的 MAG3-AAM-155探針和標記的"mTc-AAM-155探針處理組中C/EBP0蛋白的上調率為68. 7%、 69. 9%和69. 4%，此結果說明本實驗采用的MAG3馨合W及"-Tc標記并未影響核酸探針的 生物活性，保證了核酸仍然具有良好的腫瘤特異祀向性，miR-155祀向探針"mTc-AAM-155 促進C/EBP0蛋白表達。
[0158] S、"mTc-AAM-155的細胞分布及攝取
[0159] 1.細胞轉染
[0160] IfepG2細胞系（購自美國典型培養(yǎng)物保藏中屯、（ATCC)，保藏編號為皿-8065)、HeLa 細胞系（購自美國典型培養(yǎng)物保藏中屯、（ATCC)，保藏編號為Ca-2)、MCF7(購自美國典型 培養(yǎng)物保藏中屯、（ATCC)，保藏編號為HTB-22)飼養(yǎng)于高糖培養(yǎng)基DMEM佑ibco)中。
[0161] 轉染方法同上述二"mTc-AAM-155細胞水平抑制活性的測定中的轉染方法，核酸分 子為實施例1制備的巧光探針FAM-AAM-155或FAM-Control。
[0162] 2.細胞水平分布
[0163] HepG2細胞和化La細胞分別W合適的密度與轉染前一天接種至欲置蓋玻片 的6孔板中。轉染時，HepG2和化La細胞生長密度達到高倍鏡視野下每視野5個左 右。按照每孔共2ml混合新鮮培養(yǎng)基替換細胞孔內舊培養(yǎng)基。新鮮培養(yǎng)基