個核巧酸均為2' -甲氧基修飾（下劃線部分）。
[0084] 2)化學(xué)修飾后對照寡核巧酸
[0085] 化學(xué)修飾后對照寡核巧酸（命名為control)為： 5' -N&-(邸2) .-CATTAATGTCGGACAA CTCAAT-3 '，其連接方式和修飾方式均與化學(xué)修飾后 miR-155祀向核酸相同。
[0086] AAM-155和control探針均由生工生物工程（上海）有限公司合成，經(jīng)HPLC純化 及分子量鑒定后，W凍干形態(tài)保存于-80°C。
[0087] 3、FAM 標(biāo)記 AAM-155 探針和 FAM 標(biāo)記 control 探針
[008引合成FAM標(biāo)記修飾后miR-155祀向核酸和FAM標(biāo)記修飾后對照寡核巧酸，用于細(xì) 胞水平的探針分布鑒定，具體如下：
[0089] 1) FAM標(biāo)記修飾后miR-155祀向核酸
[0090] FAM標(biāo)記修飾后miR-155祀向核酸（命名為FAM-155)為5' -FAM-ACCCCT ATCACGATTAG CATTAA-3'，其為在miR-155祀向核酸的5'端連接FAM基團，
[OOW] miR-155祀向核酸的序列為A￡￡CCT ATCACGATTAG CATIM(序列2)，且其核巧酸序 列前6個核巧酸和后6個核巧酸均為硫代修飾（斜體表示），且其核巧酸序列前3個核巧酸 和后3個核巧酸均為2' -甲氧基修飾（下劃線部分）。
[0092] 2) FAM標(biāo)記修飾后對照寡核巧酸
[0093] FAM標(biāo)記修飾后對照寡核巧酸（命名為FAM-control)為；5' -FAM-CATTAA TGTCGGACAA CTCMI-3'，其連接方式和修飾方式均與化學(xué)修飾后miR-155祀向核酸相同。
[0094] 二、miR-155 祀向探針"mTc-AAM-155 的獲得
[0095] 1、聲合后探針MAG3-AAM-155的獲得
[0096] 馨合后探針MAG3-AAM-155的制備方法；將雙功能馨合劑琉基己酷=甘氨酷-N-哲 基了二酉先亞胺酯（N-hydroxysuccinimidyl-S-acetyl-mercaptoacetyltriglycline， N服-MAG3)的了二酷亞胺醋鍵斷裂成幾基與上述制備的化學(xué)修飾后miR-155祀向核酸的伯 胺形成酷胺鍵，得到馨合后探針MAG3-AAM-155 ;具體方法如下：
[0097] 1) N服-MAG3溶液的制備
[009引分別配制0. 3M肥陽S水溶液侶恥馬04巧和0. 3M肥陽S鋼鹽水溶液 (CsHi^化O4S)，將二者等體積混勻，調(diào)抑值至7. 6,得到核酸溶解液肥陽S緩沖液；稱取適 量的畑S-MAG3粉末，將其加入肥陽S緩沖液中，得到畑S-MAG3溶液，使畑S-MAG3的終濃度 為 7. 25mg/ml ;
[0099] 2)聲合
[0100] 取適量體積1)得到的NHS-MAG3溶液和上述一制備的AAM-155混勻，使得AAM-155 濃度達(dá)到l〇yg/y 1，其中，MAG3 ;AAM-155的最終摩爾比為15:1-20:1(在本實施例中一般 使用20:1)?；靹蚝蟪仂o置化進(jìn)行充分反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)液中加入5yl醋酸 錠溶液（2. 0M)，隨即加入適量含SnCl2 ? 2H2〇(20mg/ml)的酒酒石酸鋼緩沖液（含0. 5M碳 酸氨鋼、0. 25M醋酸錠和0. 175M的氨氧化錠，濃度為lOOmg/ml)用于終止反應(yīng)，得到混合液 (含有馨合后探針MAG3-AAM-155)。
[0101] 將混合液沸水浴20min后低轉(zhuǎn)速（7000g)離屯、5min收取上清液，將上清液進(jìn)行 HPLC鑒定、純化、分離。流動相A為己膳，流動相B為0. 1M的TEAB，pH 8.0,洗脫梯度為A從 Omin時20 %到35min時40 %，洗脫流速為1. 5ml/min)，填充物為Se地adex G25 (柱體積為 25mmX9mm、上樣量為30nmol)，根據(jù)洗脫產(chǎn)物在260nm波長處的吸光度峰值，收集28-30min 左右洗脫液并凍干，保存于-80°C備用，得到馨合后探針MAG3-AAM-155。
[0102] NHS-MAG3作為一種雙功能馨合劑，與核酸的5'末端連接的氨基而結(jié)合，去除保護 琉基的己酷基基團，通過轉(zhuǎn)馨合作用而與 99-Tc馨合被標(biāo)記。其優(yōu)點是可W在室溫和中性條 件下進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)，該種溫和的反應(yīng)環(huán)境對保護反應(yīng)中的核酸分子起到重要作用，且該馨 合劑具有穩(wěn)定性高、標(biāo)記率高、脫祀少的優(yōu)勢，對后續(xù)標(biāo)記其中支持作用。
[0103] 采用同樣的方法制備連接馨合劑的control探針；將雙功能馨合劑琉基己酷S甘 氨酷-N-哲基了二酷亞胺醋（N-hy化oxysuccinimidy；L-S-acet5d-me;rcaptoacet5dt;riglyc line, NHS-MAG3)的了二酷亞胺醋鍵斷裂成幾基與上述一制備的化學(xué)修飾后control革己向 核酸的伯胺形成酷胺鍵，得到連接馨合劑的control探針。
[0104] 2、"mTc 標(biāo)記獲得 miR-155 祀向探針"mTc-AAM-155
[010引 miR-155祀向探針99-Tc-AAM-155 ;將99-Tc標(biāo)記與上述1制備的馨合后探針 MAG3-AAM-155反應(yīng)，得到miR-155祀向探針"mTc-AAM-155,具體如下；
[0106] 1)配制新鮮的SnCl2溶液
[0107] 將維生素C溶于lOmM的肥1中，配制濃度為1. Omg/ml維生素C肥1溶液，將SnCl2 與新鮮配制的維生素鹽酸溶液混勻，得到SnCl2溶液，且SnCl 2在SnCl 2溶液中的終濃度為 4mg/ml ；
[010引 2)配制濃度為50mg/ml、抑值為9. 2的酒酒石酸鋼緩沖液
[0109] 將碳酸氨鋼、己酸錠、氨氧化錠和水混勻得到混合液，碳酸氨鋼在混合液中的終濃 度為0. 5M、己酸錠在混合液中的終濃度為0. 25M、氨氧化錠在混合液中的終濃度為0. 175M， 得到濃度為50mg/ml、抑值為9. 2的酒石酸鋼酒石酸鋼緩沖液；
[0110] ：3)MAG3-核酸溶液
[01取上述1獲得的聲合后探針MAG3-AAM-155溶于己酸錠溶液化25M，抑=5. 2)， 使其終濃度為500 y g/ml，得到MAG3-核酸溶液。
[0112] 4)miR-155 祀向探針"mTc-AAM-155
[0113] 向3) 45ul得到的MAG3-核酸溶液中加入15ul 2)得到的酒酒石酸鋼緩沖液（使 酒石酸鋼在反應(yīng)體系的終濃度達(dá)到7yg/yL)，再加入3yl 1)中新鮮配制的氯化亞錫溶 液，隨即再加入15ul新鮮放射性活度"-Tc化1林洗液（中國原子能科學(xué)研究院同位素研究 所），充分混勻后沸水浴靜置反應(yīng)Ih，得到反應(yīng)產(chǎn)物。
[0114] MAG3-核酸溶液；99mTc(V淋洗液；酒酒石酸鋼緩沖液；氯化亞錫溶液的體積配比為 15:5:5:1 ；
[0115] 上述不同條件的反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)HPLC柱層析分離、純化。流動相A為己膳，流動相B為 0. 1M的TEAB，pH 8. 0,洗脫梯度為A從Omin時20%到35min時40%，洗脫流速為1. 5ml/ min)，填充物為S巧hadex G25 (柱體積為25mmX 9mm、上樣量為30nmol)，收集A260nm值與 放射性活度高峰的產(chǎn)物，一般為5-6min左右所出峰，即為miR-155祀向探針"mTc-AAM-155。
[0116] 采用同樣的方法制備對照祀向探針"-Tc-control ;將"-Tc標(biāo)記與上述1制備的連 接馨合劑的control探針反應(yīng)，得到對照祀向探針"-Tc-control。
[0117] 3、標(biāo)記產(chǎn)物的標(biāo)記結(jié)果
[011引通過測定HPLC柱層析時放射性活度峰下面積測定上述2獲得的miR-155祀向探 針"mTc-AAM-155的標(biāo)記率r°Tc-AAM-155的放射性活度/總放射性活度）。
[0119] 結(jié)果如圖2所示，表明，當(dāng)反應(yīng)體系中加入少量SnClg ? 2&0 (4mg/na)(如 1 y 1-3 y 1)，而且保證"-Tc液新鮮且體積不超過25 y 1 (如15 y 1)，在室溫下反應(yīng)60min或 加熱3〇111；[]1，標(biāo)記率可達(dá)97%~99%(]1 = 5)，放化純接近100%，比活度達(dá)3.75189/叫。標(biāo) 記產(chǎn)物的放射性活度高峰出現(xiàn)單一，僅在約6-7min左右出現(xiàn)明顯峰值，與A260的紫外吸光 度峰值出現(xiàn)的保留時間一致。而單獨"-Tc的保留時間為3. 5min。此結(jié)果證明經(jīng)過MAG3偶 聯(lián)后的核酸探針能夠被99-Tc所標(biāo)記，且標(biāo)記率高。
[0120] 4、標(biāo)記產(chǎn)物的鑒定
[0121] 使用瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定上述2獲得的miR-155祀向探針"mTc-AAM-155的 探針完整性及標(biāo)記效果，排除標(biāo)記反應(yīng)后的寡核巧酸發(fā)生降解或脫標(biāo)現(xiàn)象。于瓊脂糖凝膠 (2% )上分別依次加樣未馨合探針AAM-155、標(biāo)記探針99mTc-AAM-155、99mTc〇4-淋洗液。120V 電壓下電泳40min后，紫外光下觀察核酸條帶的位置，并等份切開凝膠測定相應(yīng)放射性計 數(shù)。
[0122] 凝膠電泳結(jié)果如圖3，顯示未聲合探針AAM-155 (AAM)、標(biāo)記探針 ""Tc-AAM-lSSr-Tc-AAM)的條帶唯一，位于同一位置，未見拖尾及降解現(xiàn)象，99-Tc〇4-淋洗液 r-Tc)泳道無條帶出現(xiàn)。測量凝膠放射性分布結(jié)果顯示，標(biāo)記探針的放射性分布與條帶位 置完全一致，純化前的標(biāo)記樣品可見2個放射性峰，左峰與純化后樣品一致，為標(biāo)記探針?biāo)?在位置；右峰與99-Tc液位置一致，提示為多余99-Tc液。純化后標(biāo)記樣品僅見單獨的標(biāo)記探 針峰，未見脫標(biāo)現(xiàn)象。未標(biāo)記探針無放射性計數(shù)峰值分布。由此可見，寡核巧酸探針在標(biāo)記 前后、純化前后均具有良好的核酸完整性，為保持生物活性提供保障。
[0123] 實施