由染料分子標(biāo)記的四嗪探針及其制備方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種膽堿類似物以及由染料分子標(biāo)記的四嗪探針。本發(fā)明提供的膽堿類似物與由染料分子標(biāo)記的四嗪探針之間的偶聯(lián)反應(yīng)在常溫、生理環(huán)境中就能快速發(fā)生，且無需銅催化，避免了金屬催化對細(xì)胞及活體的毒性影響；本發(fā)明提供的膽堿類似物與由染料分子標(biāo)記的四嗪探針之間的偶聯(lián)反應(yīng)后，通過檢測所述標(biāo)記的染料分子可快速、高靈敏高分辨率地對細(xì)胞膜上的膽堿類似物進(jìn)行定位和示蹤。本發(fā)明還提供了一種膽堿類似物以及由染料分子標(biāo)記的四嗪探針的制備方法，該方法簡單易行，可以進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)，且生產(chǎn)成本低。本發(fā)明還提供了一種膽堿類似物以及由染料分子標(biāo)記的四嗪探針的應(yīng)用。
【專利說明】由染料分子標(biāo)巧的四瞎探針及其制備方法和應(yīng)用
[0001] 本申請是針對于2013年12月31日提交到中國專利局、申請?zhí)枮?01310752617.4、 發(fā)明名稱為"膽堿類似物及其制備方法和應(yīng)用、由染料分子標(biāo)記的四嗦探針及其制備方法 和應(yīng)用"的母案申請作出的分案申請，上述母案申請的內(nèi)容W引入的方式并入本文中。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明設(shè)及生物醫(yī)藥材料領(lǐng)域，具體設(shè)及膽堿類似物及其制備方法和應(yīng)用、由染 料分子標(biāo)記的四嗦探針及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0003] 膽堿(化0)是細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和脂蛋白構(gòu)成上的重要組成部分。在真核生物中，憐脂頭 端最普遍的基團(tuán)是膽堿，含憐脂膽堿是細(xì)胞膜中最豐富的憐脂，也是細(xì)胞膜的主要結(jié)構(gòu)成 分，在細(xì)胞代謝和信號傳導(dǎo)中起著至關(guān)重要的作用，
[0004] A化ian Salic課題組利用膽堿在細(xì)胞中的代謝途徑，通過對膽堿的末端修飾烘 基，在不影響其功能的前提下實現(xiàn)了其對細(xì)胞的原位標(biāo)記，并用帶疊氮的染料通過click銅 催化對細(xì)胞內(nèi)膽堿的代謝行為進(jìn)行示蹤分析。然而，在該方法采用的是傳統(tǒng)疊氮-烘基 Husigen[3+3]環(huán)加成反應(yīng)，催化劑銅的存在會引起細(xì)胞的毒性，因而在活細(xì)胞乃至活體的 應(yīng)用中受到很大的限制。
[0005] 化i-化η Xie課題組采用新型的click無銅催化，改用疊氮修飾膽堿，并用其與細(xì) 胞共培育，用無銅[3+2]click環(huán)加成試劑苯并環(huán)辛烘DBC0-巧光素來檢測，在無銅的情況下 驗證疊氮-膽堿成功的標(biāo)記在細(xì)胞膜上。然而該反應(yīng)的反應(yīng)速度相對較慢，因而易在體內(nèi)被 清除而影響其結(jié)合的效率。
[0006] 因此，有必要提供一種對細(xì)胞毒性低，且反應(yīng)快速、高靈敏、高分辨率的膽堿示蹤 方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種膽堿類似物及其制備方法和應(yīng)用。此外，本發(fā) 明還提供了 一種由染料分子標(biāo)記的四嗦探針及其制備方法和應(yīng)用。
[000引本發(fā)明提供的膽堿類似物與由染料分子標(biāo)記的四嗦探針之間的偶聯(lián)反應(yīng)無需銅 催化，避免了金屬催化對細(xì)胞及活體的毒性影響，能夠快速、高靈敏高分辨率地對細(xì)胞膜上 的膽堿類似物進(jìn)行定位和示蹤。
[0009]第一方面，本發(fā)明提供了一種膽堿類似物，結(jié)構(gòu)式如P1所示：
[0010]
[ΟΟ?]式中，k為2~4的自然數(shù)。
[001 ^ 第二方面，本發(fā)明還提供了 一種膽堿類似物的制備方法，包括如下步驟：
[0013] S10、提供如下結(jié)構(gòu)式表示的化合物A和化合物B:
[0014]
[001引在催化劑存在的條件下，將所述化合物A和化合物B按1:1~1.5的摩爾比溶于第一 有機(jī)溶劑中，得到反應(yīng)液，所述反應(yīng)液在20~30°C下反應(yīng)0.5~1小時后，經(jīng)萃取、干燥、硅膠 柱層析分離純化得到化合物C，其結(jié)構(gòu)式如C所示：
[0017] S20、提供如下結(jié)構(gòu)式表示的化合物D:
[0016] .，：
[001 引
[0019] 式中，k為2~4的自然數(shù)，
[0020] 在催化劑存在的條件下，將所述化合物C和化合物D按1:2~5的摩爾比溶于第二有 機(jī)溶劑中，得到反應(yīng)液，所述反應(yīng)液在20~30°C下反應(yīng)0.5~1小時后，經(jīng)萃取、干燥、硅膠柱 層析分離純化得到化合物E，其結(jié)構(gòu)式如E所示：
[0021]
[0022] 式中，k為2~4的自然數(shù)，
[0023] S30、將所述化合物E和二甲基乙醇胺按1:1~3的摩爾比溶于第Ξ有機(jī)溶劑中，得 到反應(yīng)液，所述反應(yīng)液在回流狀態(tài)下反應(yīng)12~16小時后，經(jīng)濃縮、硅膠柱層析分離純化得到 化合物P1，其結(jié)構(gòu)式如P1所示：
[0024]
[0025] 式中，k為2~4的自然數(shù)。
[00%]需要說明的是，本發(fā)明設(shè)及的結(jié)構(gòu)式中的
為正電荷的符號。
[0027] 優(yōu)選地，所述步驟S10中，所述催化劑為化晚。
[0028] 優(yōu)選地，所述步驟S10中，所述催化劑的摩爾濃度為所述化合物A的2~4倍。
[0029] 優(yōu)選地，所述步驟S10中，所述萃取的方式為在反應(yīng)結(jié)束后的反應(yīng)液中加入飽和氯 化錠溶液進(jìn)行萃取。
[0030] 優(yōu)選地，所述步驟S10中，所述干燥的方式為將萃取所得有機(jī)相用無水硫酸鋼干 燥，蒸干。
[0031] 優(yōu)選地，所述步驟S10中，所述第一有機(jī)溶劑為二氯甲燒、四氨巧喃、氯仿或N，N-二 甲基甲酯胺。
[0032] 優(yōu)選地，所述步驟S20中，所述催化劑為Ξ乙胺或N，N-二異丙基乙胺。
[0033] 優(yōu)選地，所述步驟S20中，所述催化劑的摩爾濃度為所述化合物C的2~5倍。
[0034] 優(yōu)選地，所述步驟S20中，所述純化的方式為將反應(yīng)結(jié)束后的反應(yīng)液濃縮后加入二 氯甲燒進(jìn)行稀釋，并用NaO田容液及水溶液洗涂。
[0035] 優(yōu)選地，所述步驟S20中，所述干燥的方式為將萃取所得有機(jī)相用無水硫酸鋼干 燥，蒸干。
[0036] 優(yōu)選地，所述步驟S20中，所述第二有機(jī)溶劑為N，N-二甲基甲酯胺、二甲基亞諷或 四氨巧喃。
[0037] 優(yōu)選地，所述步驟S30中，所述第Ξ有機(jī)溶劑為N，N-二甲基甲酯胺、二甲基亞諷或 四氨巧喃。
[0038] 本發(fā)明提供的膽堿類似物的合成方法，W非銅催化的雙締體（13,85，化）-雙環(huán) [6.1.0]壬-4-烘基-9-基甲醇(BCN)為起始化合物，通過對其末端徑基的活化，與漠胺類進(jìn) 行反應(yīng)得到漠代中間體，并最終與二甲基乙醇胺反應(yīng)生成膽堿類似物。該方法操作簡便、反 應(yīng)條件溫和、重現(xiàn)性好。
[0039] 該方法的優(yōu)選步驟包括：1)BCN的活化(BCN-pNC):用對硝基苯基氯甲酸醋(pNC)在 化晚及二氯甲燒的條件下對BCN進(jìn)行活化;2)中間體BCN-Br的合成：活化后的BCN-pnc與2- 漠乙胺在Ξ乙胺的作用下生成中間體漠代BCN-化；3) BCN修飾的膽堿類似物合成（BCN- 化0):BCN-化與二甲基乙醇胺在四氨巧喃(TW)回流得到目標(biāo)化合物BCN-化0。
[0040] 本發(fā)明提供的化合物A為雙締體（IR，8S，化)-雙環(huán)[6.1. ο]壬-4-烘基-9-基甲醇 (BCN)，化合物Β為對硝基苯基氯甲酸醋(pNC)，化合物C為BCN-pNC，化合物D為漠胺類，化合 物E為BCN-Br。
[0041] 優(yōu)選地，所述漠胺類為2-漠乙胺或3-漠丙胺。
[0042] 第Ξ方面，本發(fā)明提供了一種由染料分子標(biāo)記的四嗦探針，包括染料分子和四嗦 分子，所述染料分子與四嗦分子的氨基形成共價鍵，所述染料分子與四嗦分子通過所述共 價鍵相連，所述染料分子為巧光染料分子或近紅外染料分子，所述四嗦分子的結(jié)構(gòu)式如P2 所示：
[0043]
[0044] 其中，町為
[0045] R2為昭！
申，X為CH或N。
[0046] 優(yōu)選地，所述巧光染料分子為羅丹明、異硫氯酸巧光素、鄰苯二甲醒、二甲氨基糞 橫酷氯、巧甲氧幾酷氯、6-氨基哇嘟基-N-徑基班巧酷亞胺基甲酸醋或N-9-巧甲氧基碳酷- 氨基酸基-N-簇酸酢。
[0047] 本發(fā)明采用的巧光染料分子優(yōu)選為但不限于所述羅丹明、異硫氯酸巧光素、鄰苯 二甲醒、二甲氨基糞橫酷氯、巧甲氧幾酷氯、6-氨基哇嘟基-N-徑基班巧酷亞胺基甲酸醋或 N-9-巧甲氧基碳酷-氨基酸基-N-簇酸酢。
[0048] 在本發(fā)明采用的巧光染料分子中，所述異硫氯酸巧光素為氯酸醋類巧光染料、所 述鄰苯二甲醒為芳香鄰二醒類巧光染料、所述二甲氨基糞橫酷氯為酷氯類巧光染料、所述 巧甲氧幾酷氯為氯甲酸醋類巧光染料質(zhì)、所述6-氨基哇嘟基-N-徑基班巧酷亞胺基甲酸醋 為碳酸醋類巧光染料、所述N-9-巧甲氧基碳酷-氨基酸基-N-簇酸酢為酸酢類巧光染料，所 述氯酸醋類、芳香鄰二醒類、酷氯類、氯甲酸醋類、碳酸醋類或酸酢類巧光染料具有能與蛋 白質(zhì)的氨基反應(yīng)的活性基團(tuán)，能對蛋白質(zhì)進(jìn)行巧光標(biāo)記;而本發(fā)明提供的四嗦分子含有可 供反應(yīng)的氨基，采用所述巧光染料分子標(biāo)記所述四嗦分子時，巧光染料分子的活性基團(tuán)與 所述四嗦分子的氨基反應(yīng)形成共價鍵，從而得到所述由染料分子標(biāo)記的四嗦探針。
[0049] 優(yōu)選地，當(dāng)所述巧光染料分子為異硫氯酸巧光素(FITC，結(jié)構(gòu)式如Μ所示）時，所述 共價鍵為四嗦分子的自由氨基經(jīng)碳酷氨化而形成的硫碳氨基鍵。
[(Κ)加]
[0051]優(yōu)選地，當(dāng)所述巧光染料分子為羅丹明（結(jié)構(gòu)式如Ν所示），所述共價鍵為四嗦分子 的自由氨基經(jīng)脫水縮合而形成的酷胺鍵，
[0化2]
[0053] 優(yōu)選地，所述近紅外染料分子為嗎I噪菁染料分子或者二氨化吩分子。
[0054] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述嗎I噪菁染料分子的結(jié)構(gòu)式如L所示：
[0化5]
[0化6] 其中，X為C1、化、I或C1化，Υ為0、N、S或CH(C曲)2，R1為烷基或芳香基，R2為烷基或芳 香基，R3為Η、CH3、S〇3一或C 出0，R4為Η、CH3、S〇3一或邸3〇，η為0、1 或2。
[0057]更進(jìn)一步優(yōu)選地，所述嗎I噪菁染料分子為Cy3或Cy5.5。
[005引具體地，所述Cy3和Cy5.5的結(jié)構(gòu)式如下所示：
[0化9]
[0060]本發(fā)明采用的近紅外染料分子優(yōu)選為但不限于所述嗎I噪菁染料分子。
[0061 ]第四方面，本發(fā)明提供了一種由染料分子標(biāo)記的四嗦探針的制備方法，包括W下 步驟：
[0062] (1)、提供四嗦分子，所述四嗦分子的結(jié)構(gòu)式如P2所示：
[0063]
[0064] 其中，町為
[00化]R2為Η或
中，X為CH或Ν;
[0066] (2 )、提供染料分子，所述染料分子為巧光染料分子或近紅外染料分子.
[0067] (3)、將所述染料分子標(biāo)記在所述四嗦分子的氨基上，得到由染料分子標(biāo)記的四嗦 探針，所述由染料分子標(biāo)記的四嗦探針包括染料分子和四嗦分子，所述染料分子與四嗦分 子的氨基形成共價鍵，所述染料分子與四嗦分子通過所述共價鍵相連。
[0068] 優(yōu)選地，所述步驟(2)中，所述巧光染料分子為羅丹明、異硫氯酸巧光素、鄰苯二甲 醒、二甲氨基糞橫酷氯、巧甲氧幾酷氯、6-氨基哇嘟基-Ν-徑基班巧酷亞胺基甲酸醋或Ν-9- 巧甲氧基碳酷-氨基酸基-N-簇酸酢。
[0069] 本發(fā)明采用的巧光染料分子優(yōu)選為但不限于所述羅丹明、異硫氯酸巧光素、鄰苯 二甲醒、二甲氨基糞橫酷氯、巧甲氧幾酷氯、6-氨基哇嘟基-N-徑基班巧酷亞胺基甲酸醋或 N-9-巧甲氧基碳酷-氨基酸基-N-簇酸酢。
[0070] 優(yōu)選地，所述步驟(2)中，所述近紅外染料分子為嗎I噪類菁染料分子。
[0071] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述嗎I噪菁染料分子的結(jié)構(gòu)式如L所示：
[0072]
[007引其中，X為C1、化、I或C1化，Y為0、N、S或CH(C曲)2，R1為烷基或芳香基，R2為烷基或芳 香基，R3為Η、C出、S03一或C出0，R4為Η、C出、S03一或C出0，η為0、1或2。
[0074] 更進(jìn)一步優(yōu)選地，所述嘲噪菁染料分子為Cy3或Cy5。
[0075] 本發(fā)明采用的近紅外染料分子優(yōu)選為但不限于所述嗎I噪菁染料分子。
[0076] 優(yōu)選地，所述步驟(3)中，當(dāng)所述巧光染料分子為異硫氯酸巧光素(FITC，結(jié)構(gòu)式如 Μ所示)時，所述共價鍵為四嗦分子的自由氨基經(jīng)碳酷氨化而形成的硫碳氨基鍵。
[0077]
[0078] 優(yōu)選地，所述步驟(3)中，當(dāng)所述巧光染料分子為羅丹明（結(jié)構(gòu)式如Ν所示），所述共 價鍵為四嗦分子的自由氨基經(jīng)脫水縮合而形成的酷胺鍵，
[0079]
[0080] 優(yōu)選地，所述步驟(3)中，所述將染料分子標(biāo)記在四嗦分子的氨基上，得到由染料 分子標(biāo)記的四嗦探針的操作為：
[0081] 在Ν，Ν-二環(huán)己基碳二亞胺和4-二甲胺基化晚存在的條件下，將染料分子與化合物 Ρ2按1:1~1.5的摩爾比溶于有機(jī)溶劑中，得到反應(yīng)液，所述反應(yīng)液在20~30°C下反應(yīng)0.5~ 1小時后，經(jīng)萃取、干燥、硅膠柱層析分離純化得到所述由染料分子標(biāo)記的四嗦探針;其中， 所述N，N-二環(huán)己基碳二亞胺和4-二甲胺基化晚的摩爾濃度分別為所述染料分子的0.9~ 2.5倍和0.1~0.5倍。
[0082] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述染料分子為羅丹明，所述羅丹明的結(jié)構(gòu)式如N所示：
[0083]
,
[0084] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述由染料分子標(biāo)記的四嗦探針的結(jié)構(gòu)式如P3所示；
[0085] P
[0086] 在此優(yōu)選條件下，本發(fā)明采用4-[l，2,4,5]四嗦-3-基-節(jié)胺(Tz)對羅丹明B(Rb)進(jìn) 行標(biāo)記:Τζ和Rb在縮合劑N，N-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和催化劑4-二甲胺基化晚(DMAP)的 作用下縮合，生成四嗦-羅丹明（Tz-Rb)nTz為非銅催化的親雙締體，能夠與雙締體BCN在常 溫下發(fā)生快速的偶聯(lián)反應(yīng)，從而能夠快速檢驗細(xì)胞膜上是否含有BCN-化0。
[0087] 本發(fā)明第四方面提供的制備方法采用非銅催化的配體基團(tuán)（1R，8S，9r)-雙環(huán) [6.1.0]壬-4-烘基-9-基甲醇(BCN)修飾膽堿，避免了金屬催化對細(xì)胞及活體的毒性影響； 四嗦基團(tuán)與BCN的非銅催化click化學(xué)的高效反應(yīng)速率使得膽堿的標(biāo)記有更高的靈敏度和 分辨率。
[0088] 本發(fā)明提供的膽堿類似物在細(xì)胞內(nèi)能通過膽堿激酶的憐酸化作用形成含有膽堿 類似物的憐脂，該憐脂通過一系列細(xì)胞內(nèi)的代謝作用整合到細(xì)胞膜上，從而對細(xì)胞進(jìn)行原 位標(biāo)記。然后采用本發(fā)明提供的由染料分子標(biāo)記的四嗦探針與所述結(jié)合在細(xì)胞膜表面上的 膽堿類似物發(fā)生非銅催化click化學(xué)反應(yīng)，再通過檢測所述四嗦探針上的染料分子，即可對 細(xì)胞膜表面的膽堿類似物進(jìn)行示蹤。
[0089] 本發(fā)明提供的膽堿類似物與由染料分子標(biāo)記的四嗦探針之間的偶聯(lián)反應(yīng)在常溫、 生理環(huán)境中就能快速發(fā)生，且無需銅催化，避免了金屬催化對細(xì)胞及活體的毒性影響；其 次，通過檢測所述標(biāo)記的染料分子可快速、高靈敏高分辨率地對細(xì)胞膜上的膽堿類似物進(jìn) 行定位和示蹤。
[0090] 第五方面，本發(fā)明提供了一種如第一方面所述的膽堿類似物或第Ξ方面所述的膽 堿類似物的制備方法在制備細(xì)胞原位檢測試劑盒中的應(yīng)用。
[0091] 第六方面，本發(fā)明提供了一種如第二方面所述的由染料分子標(biāo)記的四嗦探針或第 四方面所述的由染料分子標(biāo)記的四嗦探針的制備方法在制備細(xì)胞原位檢測試劑盒中的應(yīng) 用。
[0092] 第屯方面，本發(fā)明提供了一種細(xì)胞原位檢測化合物，所述細(xì)胞原位檢測化合物為 如第一方面所述的膽堿類似物和如第二方面所述的由染料分子標(biāo)記的四嗦探針進(jìn)行偶聯(lián) 反應(yīng)后得到的化合物。
[0093] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述化合物的結(jié)構(gòu)式如P4所示：
[0094]
[0095] 式中，k為2~4的自然數(shù)。
[0096] 本發(fā)明提供的膽堿類似物及其制備方法和應(yīng)用、由染料分子標(biāo)記的四嗦探針及其 制備方法和應(yīng)用具有如下有益效果：
[0097] 1)本發(fā)明提供的膽堿類似物與由染料分子標(biāo)記的四嗦探針之間的偶聯(lián)反應(yīng)在常 溫、生理環(huán)境中就能快速發(fā)生，且無需銅催化，避免了金屬催化對細(xì)胞及活體的毒性影響；
[0098] 2)本發(fā)明提供的膽堿類似物與由染料分子標(biāo)記的四嗦探針之間的偶聯(lián)反應(yīng)后，通 過檢測所述標(biāo)記的染料分子可快速、高靈敏高分辨率地對細(xì)胞膜上的膽堿類似物進(jìn)行定位 和不蹤；
[0099] 3)本發(fā)明提供的膽堿類似物與由染料分子標(biāo)記的四嗦探針的制備方法簡單易行， 可W進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)，且生產(chǎn)成本低；
[0100] 4)本發(fā)明提供的膽堿類似物與由染料分子標(biāo)記的四嗦探針可用于制備細(xì)胞原位 檢測試劑盒。
【附圖說明】
[0101] 圖1為本發(fā)明實施例1~3提供的膽堿類似物的制備流程圖；
[0102] 圖2為本發(fā)明實施例1提供的膽堿類似物的質(zhì)譜圖；
[0103] 圖3為本發(fā)明實施例4~6提供的由染料分子標(biāo)記的四嗦探針的制備流程圖；
[0104] 圖4為本發(fā)明實施例4提供的樣品的巧光光譜圖。
【具體實施方式】
[0105] W下所述是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員 來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可W做出若干改進(jìn)和潤飾，運些改進(jìn)和潤飾也視為 本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0106] 圖1為本發(fā)明提供的一種膽堿類似物的制備流程圖，結(jié)合圖1，本發(fā)明提供了實施 例1~3如下：
[0107] 實施例1
[01 ο引一種膽堿類似物(BCN-化ο)的合成，包括如下步驟：
[0109] 1)BCN 的活化(BCN-pNC)
[0110] 在100血無水二氯甲燒中溶解5mmo 1的BCN，其中加入1 Ommo 1的化晚，攬拌數(shù)分鐘后 加入對5mmol的對硝基苯基氯甲酸醋（pNC)，20°C下反應(yīng)30min，結(jié)束后加入飽和氯化錠溶 液，萃取，有機(jī)相用無水硫酸鋼干燥，蒸干，硅膠柱層析分離純化，得到白色固體BCN-pNC(產(chǎn) 率為70%);
[0111] 2)中間體BCN-Br的合成
[0112] 將4.4mmo 1的BCN-pNC溶解在1 OmL的N，N-二甲基甲酯胺(DMF)中，加入1 Ommo 1的2- 漠乙胺鹽酸鹽和lOmmol的Ξ乙胺，在20°C下反應(yīng)30min。混合物濃縮后加入一定量二氯甲 燒，并用1N的化0田容液及水溶液洗涂，有機(jī)相用無水硫酸鋼干燥，蒸干，硅膠柱層析分離純 化，得到白色固體BCN-Br (產(chǎn)率為70 % );
[0113] 3)BCN修飾的膽堿類似物合成(BCN-化0)
[0114] 將5mmol的BCN-化溶解在20mL的四氨巧喃（THF)中，加入lOmmol的二甲基乙醇胺， 充分?jǐn)埌韬?，回流狀態(tài)下反應(yīng)12小時。反應(yīng)液濃縮，硅膠柱層析分離純化的到白色固體BCN- Ch〇(產(chǎn)率為60%)。
[0115] 對BCN-Cho進(jìn)行質(zhì)譜檢測，得到質(zhì)譜(MS m/z):309.2160(M+)。為充分說明本發(fā)明 的有益效果，本實施例還提供了BCN-化o的質(zhì)譜圖，如圖3所示。
[0116] 實施例2
[0117] -種膽堿類似物(BCN-化0)的合成，包括如下步驟：
[011 引 1)BCN 的活化(BCN-pNC)
[0119] 在100血無水二氯甲燒中溶解5mmo 1的BCN，其中加入15mmo 1的化晚，攬拌數(shù)分鐘后 加入對6mmol的對硝基苯基氯甲酸醋（pNC)，25°C下反應(yīng)40min，結(jié)束后加入飽和氯化錠溶 液，萃取，有機(jī)相用無水硫酸鋼干燥，蒸干，硅膠柱層析分離純化，得到白色固體BCN-pNC(產(chǎn) 率為74%);
[0120] 2)中間體BCN-Br的合成
[01別]將4.4mmol的BCN-pNC溶解在lOmL的N，N-二甲基甲酯胺(DMF)中，加入20mmol的3- 漠丙胺鹽酸鹽和15mmol的Ξ乙胺，在25°C下反應(yīng)40min?；旌衔餄饪s后加入一定量二氯甲 燒，并用1N的化0田容液及水溶液洗涂，有機(jī)相用無水硫酸鋼干燥，蒸干，硅膠柱層析分離純 化，得到白色固體BCN-Br (產(chǎn)率為78 % );
[0122] 3) BCN修飾的膽堿類似物合成(BCN-化0)
[0123] 將5mmo 1的BCN-化溶解在20mL的四氨巧喃（THF)中，加入15mmo 1的二甲基乙醇胺， 充分?jǐn)埌韬?，回流狀態(tài)下反應(yīng)14小時。反應(yīng)液濃縮，硅膠柱層析分離純化的到白色固體BCN- Ch〇(產(chǎn)率為70%)。
[0124] 對BCN-Cho進(jìn)行質(zhì)譜檢測，得到質(zhì)譜(MS m/z) :323.2327(M+)。
[0125] 實施例3
[01 %] -種膽堿類似物(BCN-化ο)的合成，包括如下步驟：
[0127] 1)BCN 的活化(BCN-pNC)
[0128] 在100血無水二氯甲燒中溶解5mmol的BCN，其中加入20mmol的化晚，攬拌數(shù)分鐘后 加入對7.5mmol的對硝基苯基氯甲酸醋(pNC)，30°C下反應(yīng)60min，結(jié)束后加入飽和氯化錠溶 液，萃取，有機(jī)相用無水硫酸鋼干燥，蒸干，硅膠柱層析分離純化，得到白色固體BCN-pNC(產(chǎn) 率為69%);
[0129] 2)中間體BCN-Br的合成
[0130] 將4.4mmo 1的BCN-pNC溶解在1 OmL的N，N-二甲基甲酯胺(DMF)中，加入15mmo 1的4- 漠下胺鹽酸鹽和20mmol的Ξ乙胺，在30°C下反應(yīng)60min?；旌衔餄饪s后加入一定量二氯甲 燒，并用1N的化0田容液及水溶液洗涂，有機(jī)相用無水硫酸鋼干燥，蒸干，硅膠柱層析分離純 化，得到白色固體BCN-Br (產(chǎn)率為80 % );
[0131] 3)BCN修飾的膽堿類似物合成(BCN-化0)
[0132] 將5mmo 1的BCN-化溶解在20mL的四氨巧喃（THF)中，加入1 Ommo 1的二甲基乙醇胺， 充分?jǐn)埌韬?，回流狀態(tài)下反應(yīng)16小時。反應(yīng)液濃縮，硅膠柱層析分離純化的到白色固體BCN- Ch〇(產(chǎn)率為75%)。
[0133] 對BCN-Cho進(jìn)行質(zhì)譜檢測，得到質(zhì)譜(MS m/z):337.2607(M+)。
[0134] 圖3為本發(fā)明提供的一種由染料分子標(biāo)記的四嗦探針的制備流程圖；結(jié)合圖3,本 發(fā)明提供實施例4~6如下：
[0135] 實施例4
[0136] -種由染料分子標(biāo)記的四嗦探針的制備方法，包括W下步驟：
[0137] 將5mmo 1的羅丹明Rb溶解5mL的DMF當(dāng)中，加入4.5mmo 1的N，N-二環(huán)己基碳二亞胺 (DCC)，0.5mmol的4-二甲胺基化晚(DMAP)和5mmol四嗦（Tz)，20°C下攬拌反應(yīng)12個小時，反 應(yīng)結(jié)束后加入二氯甲燒，用飽和食鹽水洗涂，有機(jī)相用無水硫酸鋼干燥，濃縮，硅膠柱層析 分離純化得到紅色粉末Τζ-肺(產(chǎn)率為75% )。
[0138] 對Τζ-肺進(jìn)行質(zhì)譜檢測，得到質(zhì)譜(MS m/z):613.3159(M+)。
[0139] 實施例5
[0140] -種由染料分子標(biāo)記的四嗦探針的制備方法，包括W下步驟：
[0141 ] 將5mmol的羅丹明Rb溶解一定量的DMF當(dāng)中，加入7.5mmol的Ν,Ν-二環(huán)己基碳二亞 胺化CC)，0.25mmo 1的4-二甲胺基化晚(DMAP)和7mmo 1四嗦(Τζ)，25 °C下攬拌反應(yīng)14個小時， 反應(yīng)結(jié)束后加入二氯甲燒，用飽和食鹽水洗涂，有機(jī)相用無水硫酸鋼干燥，濃縮，硅膠柱層 析分離純化得到紅色粉末Τζ-肺(產(chǎn)率為80%)，并采用薄層層析(TLC)對照分析本實施例制 備的Tz-Rb。
[0142] 實施例6
[0143] -種由染料分子標(biāo)記的四嗦探針的制備方法，包括W下步驟：
[0144] 將5mmol的羅丹明（肺)溶解一定量的DMF當(dāng)中，加入12.5mmol的Ν,Ν-二環(huán)己基碳二 亞胺(DCC)，0.25mmol的4-二甲胺基化晚（DMAP)和7.5mmol四嗦（Tz)，30°C下攬拌反應(yīng)16個 小時，反應(yīng)結(jié)束后加入二氯甲燒，用飽和食鹽水洗涂，有機(jī)相用無水硫酸鋼干燥，濃縮，硅膠 柱層析分離純化得到紅色粉末Τζ-肺(產(chǎn)率為85%)，并采用薄層層析(TLC)對照分析本實施 例制備的Tz-Rb。
[0145] 實施例7
[0146] 為充分說明本發(fā)明的有益效果，本實施例采用實施例1制備的膽堿類似物BCN-化0 與實施例4制備的由染料分子標(biāo)記的四嗦探針Tz-Rb進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)方程式如下：
[0147]
[0148] 為充分說明本發(fā)明的有益效果，本實施例還提供了所述BCN-化ο與所述Tz-Rb進(jìn)行 反應(yīng)后所得產(chǎn)物的巧光光譜分析，作為對照，同時還對所述Tz-Rb進(jìn)行了巧光光譜分析，結(jié) 果如圖4所示，其中，曲線1為實施例1制備的膽堿類似物Tz-Rb的巧光光譜，曲線2為所述 BCN-Cho與所述Tz-Rb進(jìn)行反應(yīng)后所得產(chǎn)物的巧光光譜。有圖4可知，曲線1的巧光強(qiáng)度低于 曲線2，即所述Tz-Rb的四嗦環(huán)與BCN-cho反應(yīng)后提高了 Tz-Rb的巧光強(qiáng)度。
[0149] 本發(fā)明提供的膽堿類似物與由染料分子標(biāo)記的四嗦探針之間的偶聯(lián)反應(yīng)在常溫、 生理環(huán)境中就能快速發(fā)生，且無需銅催化，避免了金屬催化對細(xì)胞及活體的毒性影響。
[0150] W上結(jié)果充分說明了采用本發(fā)明提供的膽堿類似物與由染料分子標(biāo)記的四嗦探 針能在無銅催化的條件下快速發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，能用于對細(xì)胞膜上的膽堿類似物進(jìn)行定位和 示蹤，具有低毒、快速、高靈敏、高分辨率的優(yōu)點。
[0151] W上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用W限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種由染料分子標(biāo)記的四嗪探針，其特征在于，包括染料分子和四嗪分子，所述染料 分子與四嗪分子的氨基形成共價鍵，所述染料分子與四嗪分子通過所述共價鍵相連，所述 染料分子為焚光染料分子或近紅外染料分子，所述四嗪分子的結(jié)構(gòu)式如P2所不：2. 如權(quán)利要求1所述的由染料分子標(biāo)記的四嗪探針，其特征在于， 所述熒光染料分子為羅丹明、異硫氰酸熒光素、鄰苯二甲醛、二甲氨基萘磺酰氯、芴甲 氧羰酰氯、6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞胺基甲酸酯或N-9-芴甲氧基碳酰-氨基酸基-N-羧酸酐;所述近紅外染料分子為吲哚菁染料分子或者二氫卟吩分子。3. -種由染料分子標(biāo)記的四嗪探針的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： (1 )、提供四嗪分子，所述四嗪分子的結(jié)構(gòu)式如P2所示：(2 )、提供染料分子，所述染料分子為熒光染料分子或近紅外染料分子； (3)、將所述染料分子標(biāo)記在所述四嗪分子的氨基上，得到由染料分子標(biāo)記的四嗪探 針，所述由染料分子標(biāo)記的四嗪探針包括染料分子和四嗪分子，所述染料分子與四嗪分子 的氨基形成共價鍵，所述染料分子與四嗪分子通過所述共價鍵相連。4. 如權(quán)利要求3所述的由染料分子標(biāo)記的四嗪探針的制備方法，其特征在于，所述步驟 (2)中，所述熒光染料分子為羅丹明、異硫氰酸熒光素、鄰苯二甲醛、二甲氨基萘磺酰氯、芴 甲氧羰酰氯、6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞胺基甲酸酯或N-9-芴甲氧基碳酰-氨基酸基-N-羧酸酐;所述近紅外染料分子為吲哚菁染料分子。5. -種如權(quán)利要求3所述的由染料分子標(biāo)記的四嗪探針的制備方法，其特征在于，所述 步驟(3)中將所述染料分子標(biāo)記在四嗪分子的氨基上，得到由染料分子標(biāo)記的四嗪探針的 操作為： 在N，N-二環(huán)己基碳二亞胺和4-二甲胺基吡啶存在的條件下，將染料分子與化合物P2按 1:1~1.5的摩爾比溶于有機(jī)溶劑中，得到反應(yīng)液，所述反應(yīng)液在20~30°C下反應(yīng)0.5~1小 時后，經(jīng)萃取、干燥、硅膠柱層析分離純化得到所述由染料分子標(biāo)記的四嗪探針;其中，所述 N，N-二環(huán)己基碳二亞胺和4-二甲胺基吡啶的摩爾濃度分別為所述染料分子的0.9~2.5倍 和0.1~0.5倍。6. 如權(quán)利要求1所述的由染料分子標(biāo)記的四嗪探針在制備細(xì)胞原位檢測試劑盒中的應(yīng) 用。7. -種細(xì)胞原位檢測化合物，其特征在于，所述細(xì)胞原位檢測化合物為一種膽堿類似 物和如權(quán)利要求1所述的由染料分子標(biāo)記的四嗪探針進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)后得到的化合物，其中， 所述膽堿類似物的結(jié)構(gòu)式如Pl所示：
【文檔編號】G01N21/64GK106010507SQ201610348541
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2013年12月31日
【發(fā)明人】蔡林濤, 李文軍, 潘正銀, 張鵬飛, 劉宏
【申請人】深圳先進(jìn)技術(shù)研究院