與早產(chǎn)的發(fā)生相關(guān)的rantes基因snp分子標(biāo)記及檢測其的試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種檢測與早產(chǎn)的發(fā)生相關(guān)的RANTES 基因的SNP分子標(biāo)記及檢測該分子標(biāo)記的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 早產(chǎn)（Preterm Bbth，PTB)是導(dǎo)致新生兒發(fā)病和死亡的重要原因，同時(shí)也是導(dǎo)致 嬰幼兒發(fā)生諸如腦擁、發(fā)育遲緩、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、慢性肺部疾病W及聽覺和視覺障礙等 并發(fā)癥和后遺癥的重要因素。75%的新生兒發(fā)病和死亡與早產(chǎn)有關(guān)。每年在全球約有1500 萬的早產(chǎn)兒，而且該個(gè)數(shù)字在不斷上升。據(jù)世界衛(wèi)生組織發(fā)布數(shù)據(jù)顯示，2011年我國早產(chǎn)兒 的發(fā)病率為7. 8%，有近110萬的早產(chǎn)兒出生，出生數(shù)量僅次于印度。早產(chǎn)已成為一個(gè)世界 性的衛(wèi)生問題。已有的流行病學(xué)研究表明早產(chǎn)有明顯的家族聚集現(xiàn)象。而且早產(chǎn)的發(fā)病率 具有種族和民族差異，在非洲裔的美國人群中早產(chǎn)的發(fā)病率是歐洲白種人的兩倍。上述研 究表明遺傳因素在自發(fā)性早產(chǎn)發(fā)病中起重要作用。因此，鑒定早產(chǎn)的易感基因有助于預(yù)測 早產(chǎn)發(fā)生的個(gè)體風(fēng)險(xiǎn)和群體風(fēng)險(xiǎn)，且有助于闡明與此疾病相關(guān)的發(fā)病機(jī)制。
[0003] 妊娠是一個(gè)復(fù)雜的生理過程，炎癥反應(yīng)在早產(chǎn)及胎膜早破的發(fā)病中起重要作用， 是早產(chǎn)及胎膜早破發(fā)生的主要原因。炎癥細(xì)胞因子的基因在早產(chǎn)和胎膜早破中發(fā)揮重要作 用，是研究早產(chǎn)及胎膜早破易感性很好的候選基因。趨化性細(xì)胞因子對(duì)白細(xì)胞的趨化作用 是炎癥發(fā)生過程中的重要起始步驟，也是機(jī)體防御和清除入侵病原體等異物先天性免疫 功能的一個(gè)重要方面。
[0004] 受激活調(diào)節(jié)正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌因子（regulated upon activation normal T cell expressed and secreted factor, RANTES),是趨化性細(xì)胞因子 CC 亞族成員（(XL巧。 RANTES對(duì)單核細(xì)胞、巨嚼細(xì)胞、T淋己細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞具有趨化功能。RANTES能引起 嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞脫粒，能引起嗜酸性細(xì)胞產(chǎn)生呼吸爆發(fā)，有刺激T淋己細(xì)胞 增生的作用RANTES就是通過它的該些生物學(xué)功能在急慢性炎癥中發(fā)揮作用。
[0005] 目前，已經(jīng)有關(guān)于RANTES基因多態(tài)性與冠屯、病、大動(dòng)脈炎、糖尿病、呼吸道合胞病 毒感染、HIV、肺結(jié)核和移植抗宿主反應(yīng)等疾病易感性的研究報(bào)道。已有的研究主要集中在 RANTES基因啟動(dòng)子區(qū)域的G-403A(ra2107538)、C-28G(rs2280788)和內(nèi)含子區(qū)影響轉(zhuǎn)錄功 能的Ini. 1T/C(rs2280789) S個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。然而，RANTES基因多態(tài)性在早產(chǎn)發(fā)生中的作 用尚未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種與早產(chǎn)的發(fā)生相關(guān)的RANTES基因的SNP分子標(biāo)記，該分 子標(biāo)記為RANTES基因的IN1. 1T/C(rs2280789)多態(tài)性位點(diǎn)。
[0007] 本發(fā)明的另一目的在于提供檢測上述分子標(biāo)記的試劑盒。
[000引為達(dá)到上述目的，本發(fā)明首先對(duì)來自醫(yī)院的大量臨床病例樣本和實(shí)驗(yàn)室樣本進(jìn)行 統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)攜帶RANTES Ini. 1 CC基因型的個(gè)體對(duì)早產(chǎn)有更高的易感性。
[0009] 因此，本發(fā)明首先提供一種用于檢測與早產(chǎn)的發(fā)生相關(guān)的RANTES基因的SNP分子 標(biāo)記，其SNP位點(diǎn)為IN1. 1T/C。
[0010] 進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了 RANTES基因的IN1. 1T/C位點(diǎn)在制備判斷早產(chǎn)發(fā)生風(fēng)險(xiǎn) 的試劑盒中的應(yīng)用。
[0011] 更進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了上述應(yīng)用中，當(dāng)個(gè)體RANTES基因IN1. 1T/C位點(diǎn)為CC 基因型時(shí)，表明其對(duì)早產(chǎn)的易感性高。本發(fā)明還提供上述SNP分子標(biāo)記在制備判斷早產(chǎn)發(fā) 生風(fēng)險(xiǎn)的診斷試劑中的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明還提供了用于檢測上述SNP分子標(biāo)記的引物，其核巧酸序列為：
[0013] 上游引物；5' -CCTGGTCTTGACCACCACA-3，，
[0014] 下游引物；5 ' -GCTGACAGGCATGAGTCAGA-3，。
[0015] 含有上述引物對(duì)的試劑盒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0016] 本發(fā)明的試劑盒是利用PCR對(duì)IN1. 1T/C位點(diǎn)進(jìn)行檢測。
[0017] 本發(fā)明試劑盒的工作程序?yàn)椋?br>[001引 （1)提取待測樣品基因組DNA，W其為模板，W權(quán)利要求5所述的引物對(duì)為擴(kuò)增引 物，進(jìn)行PCR反應(yīng)；所述PCR反應(yīng)在95°C 5min預(yù)變性后進(jìn)行2個(gè)階段的擴(kuò)增：第1階段為 94°C變性30s，退火溫度從58°C開始每個(gè)循環(huán)降0. 5°C退火30s，72°C延伸50s，一共16個(gè)循 環(huán)；第2階段為94°C變性30s，50°C退火30s，72°C延伸50s，一共14個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸 7min ;
[0019] 似回收擴(kuò)增產(chǎn)物，測序，根據(jù)峰圖判斷基因型。
[0020] 其中，步驟（1)中PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為；總體系為25 y 1時(shí)，含有基因組DNA ;20 ng，IX Ex Taq Buffer，dNTP 0.2 ml,上下游引物各 0.2 ml, Ex Taq Polymerase DNA 聚合 酶0. 5 U，加水補(bǔ)至25 y 1反應(yīng)體系。
[0021] 本發(fā)明提供了一種新的判斷早產(chǎn)發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的易感基因和基因型，其為RANTES基 因的IN1. 1T/C(rs2280789)多態(tài)性位點(diǎn)，雖然該多態(tài)性位點(diǎn)已廣泛用于冠屯、病、大動(dòng)脈炎、 糖尿病、呼吸道合胞病毒感染、HIV、肺結(jié)核和移植抗宿主反應(yīng)等疾病的易感性檢測中，但其 對(duì)早產(chǎn)發(fā)生的易感性是發(fā)明人的獨(dú)創(chuàng)性發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明提供的RANTES基因的SNP位點(diǎn)可用 于制備判斷早產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒或診斷試劑，利用本發(fā)明提供的引物對(duì)，采用PCR方法和直 接測序PCR產(chǎn)物可實(shí)現(xiàn)對(duì)RANTES基因的IN1. 1T/C位點(diǎn)基因型的鑒定，通過鑒定待測樣本 RANTES基因的IN1. 1T/C基因型是否為CC，從而協(xié)助判斷樣品個(gè)體是否容易發(fā)生早產(chǎn)，具有 良好的臨床應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說明】
[0022] 圖1為RANTES基因的IN1. 1T/T基因型。
[0023] 圖2為RANTES基因的IN1. 1T/C基因型。
[0024] 圖3為RANTES基因的IN1. 1C/C基因型。
【具體實(shí)施方式】
[0025] W下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說