一種懸浮培養(yǎng)發(fā)菜糖蛋白的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的說是一種懸浮培養(yǎng)發(fā)菜糖蛋白的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]發(fā)菜(Ab1S1c /7<3職77//0/.??)，又名發(fā)狀念珠藻，是一種能夠在干旱地區(qū)良好生長的具有很高食用價值和藥用價值的陸生海藻。發(fā)菜主要生長于石灰土壤或干旱草地等表面，在我國主要分布在西北部的干旱、半干旱荒漠草原地區(qū)。
[0003]發(fā)菜的營養(yǎng)價值很高，尤其是蛋白質(zhì)的含量較高，每千克發(fā)菜中含蛋白質(zhì)200?234.1克，還含有鈣、鐵等多種礦質(zhì)元素及20多種微量元素。食用發(fā)菜對佝僂病、高血壓、產(chǎn)后血虧等病癥有治療作用，還有通便利尿，清熱解毒，愈合傷口等功效，并可使人體血脂及膽固醇含量降低。
[0004]糖蛋白是一類由糖類同多肽或蛋白質(zhì)以共價鍵連接而成的結(jié)合蛋白。具有增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)功能，抑制腫瘤作用，降血脂、降血糖、抗氧化、防疲勞、延緩人體器官的老化速度，以及具有免疫作用、分子、細(xì)胞識別等功能。研宄表明，發(fā)菜中的活性糖蛋白具有很好的醫(yī)療保健功效，具有抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、提高免疫力等活性。目前，野生發(fā)菜資源匱乏，在一定條件下限制了發(fā)菜營養(yǎng)成分的獲取。因此，研宄一種操作簡單、提取率高的從發(fā)菜中提取發(fā)菜糖蛋白的方法實為必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的為:提供一種簡單、快速、提取率高的從人工懸浮培養(yǎng)的發(fā)菜中提取發(fā)菜糖蛋白的方法，來提高發(fā)菜的利用價值。
[0006]本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題，所采用的技術(shù)方案是:一種懸浮培養(yǎng)發(fā)菜糖蛋白的制備方法，制備步驟為:
步驟一、在無菌條件下，取活化后的發(fā)菜細(xì)胞種，置于液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)18~22天，然后，將得到的發(fā)菜培養(yǎng)液以4000r/min的轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心分離8~12min，收集離心分離后得到的上層發(fā)菜細(xì)胞，轉(zhuǎn)置于培養(yǎng)瓶內(nèi)的新鮮液體培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)瓶放置在溫度為25°C的恒溫生化培養(yǎng)箱中，控制箱內(nèi)光照強(qiáng)度為4000Lux，培養(yǎng)28~32天；
步驟二、將步驟一的培養(yǎng)物采用濾紙進(jìn)行過濾，取濾液，得到去除藻體的培養(yǎng)液；步驟三、按體積比為9:1的比例，取步驟二得到的培養(yǎng)液和NaCl摩爾濃度為0-0.25mol/L的浸提液置于錐形瓶中，充分搖勻混合后，轉(zhuǎn)置于超聲波震蕩器內(nèi)進(jìn)行超聲處理15~25min，然后，將得到的混合液置于溫度為30~80°C的水浴鍋內(nèi)進(jìn)行加熱l~6h，之后，對混合液進(jìn)行過濾，所得濾液即為發(fā)菜糖蛋白混合溶液；
步驟四、將步驟三得到的發(fā)菜糖蛋白混合溶液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中進(jìn)行減壓蒸發(fā)濃縮，控制減壓濃縮時的溫度為45~55°C，直至溶液體積為原體積的1/4，即得到糖蛋白樣品液；按體積比為1:4的比例，取糖蛋白樣品液和Sevage試劑，充分震蕩混合后得到下層含有凝膠沉淀的混合溶液，除去混合溶液中上下兩層交界處的變性蛋白，之后，在4°C條件下靜置10~20h，取混合溶液中的上層液，備用；
步驟五:分5次向步驟四得到的上層液中加入無水乙醇，使每次加入后混合溶液中乙醇的質(zhì)量濃度分別為50%、60%、70%、80%和90%，且每次無水乙醇加入后均需將混合溶液置于4°C條件下靜置沉淀10~15h，收集每次靜置后得到的下層沉淀物，合并后備用；
步驟六:將步驟五收集到的沉淀物分別采用丙酮和乙醚各洗滌2~3次，然后，按照每克沉淀物加入l~3mL蒸餾水的比例進(jìn)行復(fù)溶，之后，采用透析袋對復(fù)溶后的溶液進(jìn)行透析脫鹽處理68~76h，然后，對處理后的溶液進(jìn)行冷凍干燥，得到發(fā)菜糖蛋白粗品；
步驟七、按照0.2g:5mL的比例，將步驟六得到的發(fā)菜糖蛋白粗品溶解于去離子水中，然后用孔徑為0.45 μ m的膜對溶液進(jìn)行過濾，之后，將得到的濾液上樣于DEAE-52纖維素陰離子交換柱進(jìn)行分離純化，并依次用摩爾濃度為0.05 mol/L、0.lmol/L和0.5mol/L的NaHCCV^液對交換柱進(jìn)行階段性洗脫，每次洗脫的時間為120min，之后，采用紫外吸收法在波長為280nm處對發(fā)菜糖蛋白溶液的出峰位置進(jìn)行檢測，并分別收集其第一吸收峰、第二吸收峰和第四吸收峰的發(fā)菜糖蛋白溶液，之后，對收集到的發(fā)菜糖蛋白溶液分別進(jìn)行冷凍干燥，即得到不同分子量的發(fā)菜糖蛋白純品。
[0007]所述步驟一中的液體培養(yǎng)基為BG-1I培養(yǎng)基。
[0008]所述步驟三中的浸提液為摩爾濃度為0.08mol/L的NaCl溶液。
[0009]所述步驟三中超聲波震蕩器的功率為500W。
[0010]所述步驟四中所用的透析袋為3500Da透析袋。
[0011]本發(fā)明的有益效果是:
1、本發(fā)明提供了一種操作簡便、提取率高的懸浮培養(yǎng)發(fā)菜糖蛋白的制備方法，采用懸浮培養(yǎng)發(fā)菜細(xì)胞，結(jié)合超聲振蕩、水浴加熱等輔助浸提方式制得發(fā)菜糖蛋白混合溶液，再進(jìn)行減壓蒸發(fā)、Sevage法脫蛋白、膜過濾、交換柱分離純化洗脫等步驟高效、快速的制得了發(fā)菜糖蛋白純品。提取出來的糖蛋白品質(zhì)好、藥用價值高，具有很好的醫(yī)療保健功效，有抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、提高免疫力等活性。并且此糖蛋白涉及細(xì)胞的定向歸巢、糖蛋白毒素及激素作用機(jī)制，可使藥物選擇性地集中到病灶，提高藥效，而不影響正常組織的生長和免疫系統(tǒng)的功能，降低不良反應(yīng)，具有極高的醫(yī)用價值。
[0012]2、本發(fā)明提供了一種懸浮培養(yǎng)發(fā)菜糖蛋白的制備方法，Sevage法脫蛋白一次，并長時間靜置能夠有效去除游離蛋白質(zhì)，避免了脫蛋白次數(shù)過多導(dǎo)致的糖蛋白損失；超濾選用3500Da的濾膜，在脫鹽的同時，也可以去除其他低聚肽和氨基酸等物質(zhì)；用NaHCCV^液洗脫可置換出被纖維素上陽離子基團(tuán)吸附的帶負(fù)電荷的糖蛋白，且分別用0.05mol/L、
0.lmol/L和0.5mol/L的NaHCO3S液進(jìn)行階段性洗脫，隨著洗脫溶液濃度的升高，HCO 3_濃度及溶液的PH都升高，這對洗脫糖蛋白更快捷、有利。
【具體實施方式】
[0013]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的說明:
在發(fā)菜糖蛋白的提取過程中:首先用制備的BG-1l培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)發(fā)菜，過濾去藻體，然后配置0~0.25mol/L的Nacl浸提液，與去除藻體的培養(yǎng)液按照1:9的比例混合于錐形瓶中，搖勻后首先進(jìn)行超聲波輔助提取20min，再置于水浴鍋中于30°C~80°C下熱水浸提l~6h，最后濾紙過濾，上清液即為糖蛋白混合溶液；隨后采取Sevage法和乙醇分級沉淀法，用有機(jī)溶劑洗滌，透析干燥得到粗純品；對于粗純品過濾膜，上DEAE-52纖維素陰離子交換柱進(jìn)行分離純化，用NaHCO3溶液進(jìn)行洗脫，在280nm處采用紫外吸收法檢測糖蛋白的出峰位置，冷凍干燥，得到不同分子量的發(fā)菜糖蛋白純品。
[0014]所述懸浮培養(yǎng)發(fā)菜糖蛋白的制備方法，包括以下步驟:
步驟一、懸浮培養(yǎng)發(fā)菜
無菌條件下從發(fā)菜固體培養(yǎng)基上挑取發(fā)菜細(xì)胞于BG-1l液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，每20d為一個周期；在最初培養(yǎng)20d后，4000r/min離心lOmin，然后收集細(xì)胞懸浮于新鮮無菌的BG-1l培養(yǎng)基中，于生化培養(yǎng)箱中在25°C和40001x光照強(qiáng)度條件下進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；步驟二、過濾去藻體
將發(fā)菜培養(yǎng)液經(jīng)濾紙過濾，藻體留在濾紙上，得到去除藻體的培養(yǎng)液；
步驟三、發(fā)菜糖蛋白的提取
步驟A、將步驟二得到的培養(yǎng)液與Nacl濃度為0.08mol/L的浸提液按9:1的比例混合于錐形瓶中搖勻；
步驟B、將步驟A中錐形瓶的混合液在超聲功率為500W的條件下，進(jìn)行超聲波輔助提取20min ；
步驟C、再將步驟B中的混合液置于水浴鍋中，在溫度為72~77°C下浸提4.27h ;
步驟D、最后用濾紙過濾步驟C浸提后的溶液，得到的上清液即為發(fā)菜糖蛋白混合溶液；
步驟四、發(fā)菜糖蛋白的粗純化
步驟①:將步驟三得到的發(fā)菜糖蛋白溶液減壓濃縮至原體積的四分之一，得到糖蛋白樣品液，用Sevage法將糖蛋白樣品液與Sevage試劑(Sevage試劑由氯仿與正丁醇按5:1的比例混合而成)比例為1:4除去糖蛋白樣品中的游離蛋白，脫蛋白一次，4°C靜置過夜，棄下層游離蛋白層；
步驟②:收集步驟①中的上層糖蛋白溶液，依次加入無水乙醇，分別在乙醇濃度為50%、60%、70%、80%、90%時于4°C沉淀12h，最后收集各乙醇濃度下得到的沉淀；
步驟③:將步驟②中收集的沉淀用丙酮、乙醚各洗滌2次，然后用蒸餾水復(fù)溶至8~12mL，再用3500Da透析袋透析72h脫鹽，冷凍干燥，就得到了發(fā)菜糖蛋白的粗純品；步驟五、發(fā)菜糖蛋白的精純化
取步驟四得到的發(fā)菜糖蛋白粗純品按質(zhì)量體積比0.2g:5mL的比例溶解在去離子水中，過0.45 μ m濾膜后取樣品液，將樣品液上DEAE-52纖維素陰離子交換柱進(jìn)行分離純化，上樣后分別用0.05,0.1,0.511101/11^!10)3進(jìn)行階段性洗脫，每個濃度洗脫120min，在280nm處采用紫外吸收法檢測糖蛋白的出峰位置，分別收集含有糖蛋白組分的第一吸收峰、第二吸收峰和第四吸收峰，冷凍干燥，得到不同分子量的發(fā)菜糖蛋白精純品。
[0015]實施例1
一種懸浮培養(yǎng)發(fā)菜糖蛋白的制備方法，包括以下步驟:
步驟一、懸浮培養(yǎng)發(fā)菜
無菌條件下從發(fā)菜固體培養(yǎng)基上挑取發(fā)菜細(xì)胞于BG-1l液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)18d后，將得到的發(fā)菜培養(yǎng)液以4000r/min轉(zhuǎn)速離心分離8min，然后收集細(xì)胞懸浮于新鮮無菌的BG-1l培養(yǎng)基中，于生化培養(yǎng)箱中在25°C和40001x光照強(qiáng)度條件下進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)28天； 步驟二、過濾去藻體
將發(fā)菜培養(yǎng)液經(jīng)濾紙過濾，藻體留在濾紙上，得到去除藻體的培養(yǎng)液；
步驟三、發(fā)菜糖蛋白的提取
步驟A、將步驟二得到的培養(yǎng)液與濃度為0.05mol/L的Nacl的浸提液按9:1的比例混合于錐形瓶中搖勻；
步驟B、將步驟A中錐形瓶的混合液在超聲功率為500W的條件下，進(jìn)行超聲波輔助提取15min ；
步驟C、再將步驟B中的混合液置于水浴鍋中，在溫度為30°C下浸提6h ;
步驟D、最后用濾紙過濾步驟C浸提后的溶液，得到的上清液即為發(fā)菜糖蛋白混合溶液；
步驟四、發(fā)菜糖蛋白的粗純化
步驟①:將步驟三得到的發(fā)菜糖蛋白溶液在溫度為45°C，壓強(qiáng)為IMpa的條件下減壓濃縮至原體積的四分之一，得到糖蛋白樣品液，按體積比為1:4的比例，取糖蛋白樣品液和Sevage試劑(Sevage試劑由氯仿與正丁