孔中加入150ul含有0. ImM IPTG的LB+Amp 培養(yǎng)基，37°C 220rpm培養(yǎng)6h左右，離心棄上清，將菌體用pH5. 5的緩沖液重懸，反復(fù)凍融破 壁，獲得含有木聚糖酶的大腸桿菌細(xì)胞裂解液。
[0033] 分別取出30 μ 1裂解液至兩塊新的96孔板，其中一塊于60°C處理IOmin后，稀釋 到pH 5. 5的緩沖液中，另一塊不處理，稀釋到pH 5. 5的緩沖液中，分別加入相同pH值的 30 μ 1底物，于37 °C反應(yīng)30min后，DNS法測(cè)定生成的還原糖。
[0034] 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同的突變子經(jīng)過高溫處理后保持的酶活性不同，有些突變對(duì)木聚糖 酶的活性沒有影響，有些突變甚至使其活性降低了，對(duì)依然保持高活性的突變子進(jìn)行DNA 測(cè)序。最終，申請(qǐng)人獲得了能顯著提高木聚糖酶XynH2耐熱性的突變位點(diǎn)及突變位點(diǎn)的組 合：T128G單點(diǎn)突變；T128G和Y129Q兩點(diǎn)突變；N104D、T128G和Y129Q三點(diǎn)突變。
[0035] 將上述含T128G單點(diǎn)突變的木聚糖酶突變體命名為XynH2-l，其氨基酸序列為SEQ ID NO :3,參照該序列得到一個(gè)編碼核苷酸序列為SEQ ID NO :4。
[0036] 將上述含T128G和Y129Q兩點(diǎn)突變的木聚糖酶突變體命名為XynH2-2,其氨基酸序 列為SEQ ID NO :5,參照該序列得到一個(gè)編碼核苷酸序列為SEQ ID NO :6。
[0037] 將上述含N104D、T128G和Y129Q三點(diǎn)突變的木聚糖酶突變體命名為XynH2-3,其 氨基酸序列為SEQ ID NO :7,參照該序列得到一個(gè)編碼核苷酸序列為SEQ ID NO :8。
[0038] 將上述木聚糖酶突變體基因分別用引物1、2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物兩端引入EcoR I、 Not I位點(diǎn)。PCR反應(yīng)條件為：94°C變性5min ;然后94°C變性30s，56°C復(fù)性30s，72°C延伸 45s，30個(gè)循環(huán)后，72°C保溫IOmin。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，上述木聚糖酶突變體基因均 為大小621bp的片段。
[0039] 實(shí)施例3畢赤酵母工程菌株的構(gòu)建
[0040] 將野生型木聚糖酶基因 XynH2和上述克隆得到的木聚糖酶突變體基因 XynH2-l、 XynH2-2、XynH2-3片段，分別通過EcoR I和Not I位點(diǎn)與表達(dá)載體pPIC9K相連接，構(gòu)建得 到重組表達(dá)載體 pPIC9K-XynH2、pPIC9K-XynH2-l、pPIC9K-XynH2-2、pPIC9K-XynH2-3。
[0041] 將表達(dá)載體用Sal I進(jìn)行線性化，表達(dá)質(zhì)粒線性化片段通過電穿孔法轉(zhuǎn)化畢 赤酵母GS115,在MD平板上篩選得到畢赤酵母重組菌株GS115/pPIC9K-XynH2、GS115/ pPIC9K-XynH2-l、GS115/pPIC9K-XynH2-2、GS115/pPIC9K-XynH2-3,然后在含不同濃度遺傳 霉素的YH)平板上篩選多拷貝的陽性轉(zhuǎn)化子。
[0042] 將篩選到的陽性轉(zhuǎn)化子分別命名為畢赤酵母XynH2(Pichia pastoris XynH2)、 畢赤酵母 XynH2_l(Pichia pastoris XynH2_l)、畢赤酵母 XynH2_2(Pichia pastoris XynH2_2)和畢赤酵母XynH2_3 (Pichia pastoris XynH2_3)。將上述陽性轉(zhuǎn)化子分別轉(zhuǎn)接 于BMGY培養(yǎng)基中，30°C、250rpm振蕩培養(yǎng)Id ;再轉(zhuǎn)入BMM培養(yǎng)基中，30°C、250rpm振蕩培養(yǎng)； 每天添加0. 5%的甲醇，誘導(dǎo)表達(dá)4d ;離心去除菌體，得到含重組木聚糖酶的發(fā)酵上清液； 將其進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)分析。結(jié)果如圖1所示：發(fā)酵上清液中重組木聚糖酶突變體與 野生型木聚糖酶的分子量大小均為20kDa (箭頭所指處），與預(yù)期一致。
[0043] (1)木聚糖酶酶活單位的定義
[0044] 在37°C、pH值為5. 5的條件下，每分鐘從濃度為5mg/ml的木聚糖溶液中釋放 I μ mol還原糖所需要的酶量即為一個(gè)酶活力單位U。
[0045] (2)酶活測(cè)定方法
[0046] 取2ml濃度為1 %的木聚糖底物（pH5. 5乙酸-乙酸鈉緩沖液配制），加入到比色 管中，37°C平衡lOmin，再加入2ml經(jīng)pH5. 5乙酸-乙酸鈉緩沖液適當(dāng)稀釋并經(jīng)37°C平衡好 的酸性木聚糖酶酶液，混勻于37°C精確保溫反應(yīng)30min。反應(yīng)結(jié)束后，加入5ml DNS試劑， 混勻以終止反應(yīng)。然后沸水浴煮沸5min，用自來水冷卻至室溫，加蒸餾水定容至25ml，混勻 后，以標(biāo)準(zhǔn)空白樣為空白對(duì)照，在540nm處測(cè)定吸光值A(chǔ) e。
[0047] 酶活計(jì)算公式：
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種木聚糖酶突變體，其特征在于，所述的木聚糖酶突變體的氨基酸序列為SEQ ID NO :3〇
2. -種基因，其特征在于，所述的基因編碼權(quán)利要求1所述的木聚糖酶突變體。
3. 如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于，所述的基因的核酸序列為SEQ ID NO :4。
4. 一種木聚糖酶突變體，其特征在于，所述的突變體的氨基酸序列為SEQ ID NO :5。
5. -種基因，其特征在于，所述的基因編碼權(quán)利要求4所述的木聚糖酶突變體。
6. -種木聚糖酶突變體，其特征在于，所述的突變體的氨基酸序列為SEQ ID NO :7。
7. -種基因，其特征在于，所述的基因編碼權(quán)利要求6所述的木聚糖酶突變體。
8. -種質(zhì)粒，其特征在于，所述的質(zhì)粒攜帶有權(quán)利要求2、5或7所述的基因。
9. 一種重組宿主細(xì)胞，其特征在于，所述的重組宿主細(xì)胞為攜帶有權(quán)利要求8所述質(zhì) 粒的宿主細(xì)胞。
10. 如權(quán)利要求9所述的重組宿主細(xì)胞，其特征在于，所述的宿主細(xì)胞為畢赤酵母。
【專利摘要】本發(fā)明的目的是提供一種酸性木聚糖酶突變體及其應(yīng)用，即通過對(duì)繩狀青霉的木聚糖酶進(jìn)行大量突變的篩選，發(fā)現(xiàn)N104D、T128G、Y129Q這三個(gè)突變位點(diǎn)能引起木聚糖酶耐熱性的提高。本發(fā)明提供的野生型木聚糖酶XynH2的最適反應(yīng)溫度為50℃，而突變體XynH2-1和XynH2-2的最適反應(yīng)溫度為55℃，突變體XynH2-3的最適反應(yīng)溫度高達(dá)60℃，而且，在高于53℃條件下，三個(gè)突變體的相對(duì)酶活水平均顯著高于野生型；65℃處理5min后，野生型木聚糖酶XynH2的酶活殘留率僅為5％；而木聚糖酶突變體XynH2-1、XynH2-2、XynH2-3的酶活殘留率分別為20％、35％、46％，從而說明本發(fā)明篩選到的木聚糖酶突變體的耐熱性均得到顯著提高。
【IPC分類】C12N1-19, C12N9-42, C12R1-84, C12N15-81, C12N15-56
【公開號(hào)】CN104560920
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510039485
【發(fā)明人】徐曉東, 肖志壯, 李冬冬, 王海
【申請(qǐng)人】青島蔚藍(lán)生物集團(tuán)有限公司
【公開日】2015年4月29日
【申請(qǐng)日】2015年1月26日