專利名稱：Fgf21突變體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼FGF21突變多肽的核酸分子，F(xiàn)GF21突變體多肽，包含F(xiàn)GF21突變 多肽的藥物組合物，以及使用所述核酸、多肽或者藥物組合物治療代謝紊亂的方法。
背景技術(shù)：
FGF21屬于成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)亞族的分泌多肽，所述成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因 子(FGF)亞族包括FGF19、FGF21和FGF23(Itoh等，2004，1'代11(1 Genet. 20 :563_69)。FGF21 是一種非典型的FGF，其是獨(dú)立于肝素，并在葡萄糖、脂類調(diào)控和能量代謝中作為激素發(fā)揮 功能。FGF21作為肝臟分泌因子分離自肝臟cDNA文庫(kù)。其在肝臟和胰臟中高度表達(dá)，也 是FGF家族主要在肝臟表達(dá)的唯一成員。過(guò)表達(dá)FGF21的轉(zhuǎn)基因小鼠顯示出了低生長(zhǎng)率、 低血糖和甘油三酯水平以及的代謝表型，并且沒(méi)有出現(xiàn)與年齡相關(guān)的2型糖尿病、胰島增 生與肥胖。對(duì)糖尿病鼠模型藥物施用重組FGF21蛋白導(dǎo)致血糖水平正常，甘油三酯和膽固 醇水平降低，并改善糖耐受和胰島素敏感性。此外，F(xiàn)GF21通過(guò)增加能量消耗、身體活性和 代謝率減低體重和身體脂肪。實(shí)驗(yàn)研究提供了 FGF21用于治療人類2型糖尿病、肥胖、血脂 異常及其他代謝紊亂的藥物學(xué)給藥的支持。人類FGF21在體內(nèi)半衰期很短。在小鼠和食蟹猴中，人類FGF21的有效半衰期是1 至2小時(shí)。在開(kāi)發(fā)用作治療2型糖尿病的治療劑的FGF21蛋白中，需要增加其半衰期。具 有增加的半衰期的FGF21蛋白將允許給藥該蛋白的患者的給藥頻率減少。發(fā)明概述在一實(shí)施方案，本發(fā)明提供了分離的核酸分子，其包括編碼SEQ ID N0:4多肽的 核苷酸序列，所述多肽具有至少一個(gè)氨基酸置換(a)在36, 72, 77,126和175位中的一個(gè) 或多個(gè)的賴氨酸殘基；(b)在 37,38,46,91,69,77,79,87,91,112,113,120,121,125,126, 175，170和179位中的一個(gè)或多個(gè)的半胱氨酸殘基；(c)在56，59，69和122位中的一個(gè)或 多個(gè)的精氨酸殘基；(d)在170位的甘氨酸殘基；(e)在171位的甘氨酸殘基；以及(a)-(e) 的組合。在另一實(shí)施方案，本發(fā)明提供了一分離的核酸分子，其包括編碼SEQ ID N0:4多 肽的核苷酸序列，所述多肽具有至少一個(gè)氨基酸置換(a)在36，72，77，126和175位中的 一個(gè)或多個(gè)的賴氨酸殘基；(b)在 37,38,46,91,69,77,79,87,91,112,113,120,121,125, 126，175，170和179位中的一個(gè)或多個(gè)的半胱氨酸殘基；(c)在56，59，69和122位中的 一個(gè)或多個(gè)的精氨酸殘基；(d)在170位的甘氨酸殘基；(e)在171位的甘氨酸殘基；以及 (a)-(e)的組合，其包含使所述多肽與SEQ ID NO :4至少85%—致的增加、缺失或進(jìn)一步置換，前提條件是權(quán)利要求I (a)-(e)所述的至少一種氨基酸置換不進(jìn)行進(jìn)一步修飾。本發(fā)明還提供包含本發(fā)明核酸分子的載體和宿主細(xì)胞。在進(jìn)一步實(shí)施方案，本發(fā)明提供分離的多肽，其具有下列至少一個(gè)氨基酸置換的SEQ ID NO :4的氨基酸序列(a)在36，72，77，126和175位中的一個(gè)或多個(gè)的賴氨酸殘基；(b)在 37,38,4 6,91,69,77,79,87,91,112，113，120，121，125，126，175，170 和 179 位中的一個(gè)或多個(gè)的半胱氨酸殘基；(c)在56，59，69和122位中的一個(gè)或多個(gè)的精氨酸殘基；(d)在170位的甘氨酸殘基；(e)在171位的甘氨酸殘基；以及(a)-(e)的組合。在進(jìn)一步實(shí)施方案，本發(fā)明提供編碼多肽的分離的核酸，所述多肽包含具有下列至少一種氨基酸置換的SEQ ID NO 4的氨基酸序列(a)在36，72，77，126和175位中的一個(gè)或多個(gè)的賴氨酸殘基；(b)在 37，38，46，91，69，77，79，87，91，112，113，120，121，125，126，175，170和179位中的一個(gè)或多個(gè)的半胱氨酸殘基；(c)在56，59，69和122位中的一個(gè)或多個(gè)的精氨酸殘基；(d)在170位的甘氨酸殘基；(e)在171位的甘氨酸殘基；以及
(a)-(e)的組合，以及其包含使所述多肽與SEQID NO :4至少85%—致的增加、缺失或進(jìn)一步置換，前提條件是權(quán)利要求I (a)-(e)所述的至少一種氨基酸置換不進(jìn)行進(jìn)一步修飾。在又一實(shí)施方案，本發(fā)明提供分離的多肽，包含具有下列至少一種氨基酸置換的SEQ ID NO :4的氨基酸序列(a)在36，72，77，126和175位中的一個(gè)或多個(gè)的賴氨酸殘基；
(b)在37,38,46,91,69,77,79,87,91,112，113，120，121，125，126，175，170 和 179 位中的一個(gè)或多個(gè)的半胱氨酸殘基；(c)在56，59，69和122位中的一個(gè)或多個(gè)的精氨酸殘基；(d)在170位的甘氨酸殘基；(e)在171位的甘氨酸殘基；以及(a)-(e)的組合，以及其包含使所述多肽與SEQ ID NO :4至少85%—致的增加、缺失或進(jìn)一步置換，前提條件是權(quán)利要求I (a)-(e)所述的至少一種氨基酸置換不進(jìn)行進(jìn)一步修飾。另外，本發(fā)明提供組合物，包含通過(guò)接頭結(jié)合第二多肽的第一多肽，所述第一多肽含有任選地具有下列至少一種氨基酸置換的SEQ ID NO 4的氨基酸序列(a)在36，72，77，126和175位中的一個(gè)或多個(gè)的賴氨酸殘基；(b)在37，38，46，91，69，77，79，87，91，112，113，120，121，125，126，175，170和179位中的一個(gè)或多個(gè)的半胱氨酸殘基；(c)在56，59，69和122位中的一個(gè)或多個(gè)的精氨酸殘基；(d)在170位的甘氨酸殘基；(e)在171位的甘氨酸殘基；以及(a)-(e)的組合，所述第二多肽包括任選地具有下列至少一種氨基酸置換的SEQ ID NO :4的氨基酸序列的多肽(a)在36，72，77，126和175位中的一個(gè)或多個(gè)的賴氨酸殘基；(b)在 37,38,46,91,69,77,79,87,91,112，113，120，121，125，126，175，170和179位中的一個(gè)或多個(gè)的半胱氨酸殘基；(c)在56，59，69和122位中的一個(gè)或多個(gè)的精氨酸殘基；(d)在170位的甘氨酸殘基；(e)在171位的甘氨酸殘基；以及(a)-(e)的組合。本發(fā)明還提供本發(fā)明多肽的化學(xué)修飾形式?；瘜W(xué)修飾形式的多肽包含附接N-端和/或天然或非天然存在的聚合物附接位點(diǎn)的聚合物。本發(fā)明還提供藥物組合物和治療代謝紊亂的方法，例如肥胖癥和糖尿病，包括向需要的患者施用本發(fā)明的藥物組合物。本發(fā)明的特定實(shí)施方案從某些實(shí)施方案的下列詳細(xì)描述和所附權(quán)利要求書中是明顯可見(jiàn)的。附圖簡(jiǎn)述圖I是具有附接其序列的兩種聚合物(例如PEG分子)的FGF21分子的草圖。圖2包含四種SDS-PAGE凝膠，其示出9種FGF21突變體的PEG化程度，所述FGF21突變體具有單一工程化聚合物附接位點(diǎn)，所述附接位點(diǎn)用PEG化學(xué)修飾，即E37C，R77C和H125C(左上)，D38C, D46C 和 D79C(右上)，H87C, E91C, G113C(左下)和 G120C, R126C,N121C (右下)。圖3包含SDS-PAGE凝膠，其示出3種FGF21突變體的PEG化程度，所述FGF21突變體具有單一工程化聚合物附接位點(diǎn)，所述附接位點(diǎn)用20kDa甲氧基PEG馬來(lái)酰亞胺分子化學(xué)修飾，即K69C， R175C和Y179C。圖4包括兩個(gè)圖，其示出對(duì)FGF21突變多肽進(jìn)行ELK-熒光素酶測(cè)定的結(jié)果，所述FGF21突變多肽具有單一工程化聚合物附接位點(diǎn)，所述附接位點(diǎn)通過(guò)附接20kDa甲氧基PEG馬來(lái)酰亞胺分子而化學(xué)修飾，即E37C，R77C，E91C，野生型FGF21和N-端PEG化FGF21 (上圖)和 G113C, N121C, D46C,野生型 FGF21 和 N-端 PEG 化 FGF21 (下圖)。圖5包括兩個(gè)圖，其示出對(duì)FGF21突變多肽進(jìn)行ELK-熒光素酶測(cè)定的結(jié)果，所述FGF21突變多肽具有單一工程化聚合物附接位點(diǎn)，所述附接位點(diǎn)通過(guò)附接20kDa甲氧基-PEG馬來(lái)酰亞胺而化學(xué)修飾，即H125C，G120C, R126C，野生型FGF21和N-端PEG化FGF21 (上圖)和 D79C, D38C,野生型 FGF21 和 N-端 PEG 化 FGF21 (下圖)。圖6包括兩個(gè)圖，其示出對(duì)野生型FGF21和FGF21突變多肽進(jìn)行ELK-熒光素酶測(cè)定的結(jié)果，它們具有單一工程化聚合物附接位點(diǎn)，所述附接位點(diǎn)通過(guò)附接20kDa甲氧基PEG馬來(lái)酰亞胺分子而化學(xué)修飾，即K69C，D79C，野生型FGF21和N-端PEG化FGF21 (上圖)和R175C, Y179C，野生型 FGF21 和 N-端 PEG 化 FGF21 (下圖)。圖7是本發(fā)明的系鏈分子的草圖。圖8示出在小鼠中在單次注射賦形劑(PBS)，野生型FGF21或N-端PEG化野生型FGF21后從時(shí)間O開(kāi)始血糖水平的改變百分率的圖。圖9示出在小鼠中在單次注射賦形劑(PBS)或者用20，30或40kDa甲氧基PEG馬來(lái)酰亞胺分子N-端PEG化的野生型FGF21后從時(shí)間O開(kāi)始血糖水平的改變百分率的圖。

圖10包括兩個(gè)圖，其示出在小鼠中在單次注射PBS或N-端PEG化FGF21突變多肽后從時(shí)間O開(kāi)始在9天中血糖水平的改變百分率的圖，N-端PEG化FGF21突變多肽包含突變體R77C或R126K，其在這些引入的聚合物附接位點(diǎn)使用20kDa甲氧基PEG馬來(lái)酰亞胺分子進(jìn)一步PEG化，融合蛋白包含F(xiàn)e分子和G170E FGF21突變多肽(上圖)；或N-端PEG化FGF21突變多肽，包含突變體R77C，其在這些引入的聚合物附接位點(diǎn)使用20kDa甲氧基PEG馬來(lái)酰亞胺分子和P171G(下圖)進(jìn)一步PEG化。圖11是示出在單次注射賦形劑(IOmM磷酸鉀，5%山梨糖醇，pH 8)或FGF21突變多肽后從時(shí)間O開(kāi)始血糖水平的改變百分率的圖，F(xiàn)GF21突變多肽在這些引入的聚合物附接位點(diǎn)使用20kDa甲氧基PEG馬來(lái)酰亞胺分子雙PEG化，即E91C/H125C，E91C/R175C，E37C/G120C, E37C/H125C和E37C/R175C ;還研究包含F(xiàn)e分子和P171G FGF21突變多肽的融合蛋白。圖12是示出在單次注射賦形劑(IOmM磷酸鉀，5%山梨糖醇，pH 8)或FGF21突變多肽后從時(shí)間O開(kāi)始血糖水平的改變百分率的圖，F(xiàn)GF21突變多肽在這些引入的聚合物附接位點(diǎn)使用20kDa甲氧基PEG馬來(lái)酰亞胺分子雙PEG化，即E91C/H121C，G120C/H125C或E37C/R77C ;還研究包含F(xiàn)e分子和G170E FGF21突變多肽的融合蛋白。圖13是示出在小鼠中在單次注射賦形劑(IOmM磷酸鉀，5%山梨糖醇，pH 8)或FGF21突變多肽后從時(shí)間O開(kāi)始血糖水平的改變百分率的圖，F(xiàn)GF21突變多肽在這些引入的聚合物附接位點(diǎn)使用20kDa甲氧基PEG馬來(lái)酰亞胺分子雙PEG化，即E37C/R77C，E91C/R175C, E37C/H125C, E37C/R77C/P171G, E91C/R77C/P171G 和 E37C/R125C/P171G。圖14是示出在小鼠中在單次注射賦形劑(IOmM磷酸鉀，5%山梨糖醇，pH 8)或FGF21突變多肽后從時(shí)間O開(kāi)始血糖水平的改變百分率的圖，F(xiàn)GF21突變多肽在這些引入的聚合物附接位點(diǎn)使用20kDa甲氧基PEG馬來(lái)酰亞胺分子雙PEG化，即E37C/R77C/P171G和E91C/R125C/P171G，或包含兩個(gè)相同F(xiàn)GF21突變多肽的系鏈分子，F(xiàn)GF21突變多肽具有相同的引入突變體，即R77C/P171G(2x)和R78C/P172G (2x)，其通過(guò)20kDa甲氧基PEG馬來(lái)酰亞胺分子結(jié)合在一起。

圖15是在小鼠中在單次注射賦形劑(IOmM Tris HCl,150mM NaCl, pH 8. 5)或FGF21突變多肽后從時(shí)間O開(kāi)始作為劑量函數(shù)的血糖水平的改變百分率的圖，F(xiàn)GF21突變多肽在這些引入的聚合物附接位點(diǎn)使用20kDa甲氧基PEG馬來(lái)酰亞胺分子雙PEG化，即E37C/R77C/P171G,并且以劑量 O. 01mg/kg, O. 03mg/kg, O. lmg/kg, O. 3mg/kg 或 lmg/kg 來(lái)施用。圖16是示出在小鼠中在單次注射賦形劑(IOmM磷酸鉀，5%山梨糖醇，pH 8)或FGF21突變多肽后從時(shí)間O開(kāi)始的體重改變的圖，F(xiàn)GF21突變多肽在這些引入的聚合物附接位點(diǎn)使用20kDa甲氧基PEG馬來(lái)酰亞胺分子雙PEG化，即E37C/R77C，E91C/R175C，E37/H125C, E37C/R77C/P171G,E91C/R77C/P171G 和 E37C/R125C/P171G。圖17是示出在小鼠中在單次注射賦形劑(IOmM磷酸鉀，5%山梨糖醇，pH 8)或FGF21突變多肽后從時(shí)間O開(kāi)始的體重改變的圖，F(xiàn)GF21突變多肽在這些引入的聚合物附接位點(diǎn)使用20kDa甲氧基PEG馬來(lái)酰亞胺分子雙PEG化，即E37C/R77C/P171G和E91C/R125C/P171G，或包含兩個(gè)FGF21突變多肽的系鏈分子，F(xiàn)GF21突變多肽具有相同的引入突變體，即R37C/P171G(2x)和R77C/P171G (2x)，其通過(guò)20kDa甲氧基PEG馬來(lái)酰亞胺分子結(jié)合在一起。圖18是在小鼠中在單次注射賦形劑(IOmM Tris HCl,150mM NaCl, pH 8. 5)或FGF21突變多肽后從時(shí)間O開(kāi)始作為劑量函數(shù)的體重改變的圖，F(xiàn)GF21突變多肽在這些引入的聚合物附接位點(diǎn)使用20kDa甲氧基PEG馬來(lái)酰亞胺分子雙PEG化，即E37C/R77C/P171G，并且施加5種不同的劑量。圖19A-19F是一系列6個(gè)圖，其示出在8個(gè)星期腎臟液泡研究中小鼠體重改變的圖，其使用一周給藥賦形劑(方塊)，5mg/kg(三角形)和25mg/kg(空心圓)PEG化FGF21分子。使用雙半胱氨酸靶向的PEG-FGF21給藥的小鼠顯示出保持體重減輕，而給藥系鏈分子的那些顯示出主要瞬間體重減輕。圖20包括兩個(gè)棒圖，其示出在注射賦形劑或FGF21突變多肽的小鼠中8個(gè)星期腎臟液泡研究結(jié)果的圖，F(xiàn)GF21突變多肽在這些引入的聚合物附接位點(diǎn)使用20kDa甲氧基PEG馬來(lái)酰亞胺分子雙 PEG 化，即 E37C/R77C/P171G ；E37/H125C/P171G ；E91C/H125C/P171G ；E37C/P171G ；R77C/P171G ;和 R77C/P171G ;測(cè)試兩種不同劑量。發(fā)明詳述人FGF21蛋白，如增加半衰期具有增強(qiáng)特性可以準(zhǔn)備使用的方法和標(biāo)準(zhǔn)披露外分子生物學(xué)方法。據(jù)了解，由一個(gè)或多個(gè)具有約束力的水溶性聚合物，如聚乙二醇分子，在蛋白的蛋白質(zhì)半衰期可以延長(zhǎng)。因此，在不同的實(shí)施例，天然FGF21半衰期可以延長(zhǎng)引入蛋白質(zhì)氨基酸置換的形式在哪個(gè)聚合物可附著在FGF21蛋白點(diǎn)。這種修飾的蛋白質(zhì)，在此統(tǒng)稱為FGF21突變體和本發(fā)明的形式體現(xiàn)。也可引入聚合物結(jié)合的非天然聚合物附接位點(diǎn)引入的N-端的FGF21分子。本文中使用的重組核酸方法包括在實(shí)施例中，通常為Sambrook et al.，Molecular Cloning A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)或 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al. , eds., GreenPublishers Inc. and Wiley and Sons 1994)中闡述的那些，為了任何目的其通過(guò)引用方式全部并入本文。
I.通用定義如本文中使用的，除非另有說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)“一種”表示一種或多種。術(shù)語(yǔ)“分離的核酸分子“是指該發(fā)明的核酸分子(I)已脫離至少約50個(gè)蛋白質(zhì)，脂肪，碳水化合物，或其他材料自然地發(fā)現(xiàn)它是從源細(xì)胞總核酸分離的，(2)不與全部或部分聚核苷酸對(duì)其中的“分離的核酸分子”是聯(lián)系在一起的性質(zhì)，(3)可操作地鏈接到它的聚核苷酸在沒(méi)有聯(lián)系的性質(zhì)，或(4)不發(fā)生在自然界作為一個(gè)更大的聚核苷酸序列的一部分。優(yōu)選，分尚的核酸分子的本發(fā)明實(shí)質(zhì)上從任何其他污染核酸分子或其他污染物，為它的天然環(huán)境，在多肽干預(yù)其生產(chǎn)或它的治療，診斷，預(yù)防或研究發(fā)現(xiàn)使用自由使用。術(shù)語(yǔ)“分離的多肽“是指本發(fā)明的多肽，(I)已至少?gòu)木酆塑账峒s50，脂肪，碳水化合物，百分之分居或其他材料自然地發(fā)現(xiàn)它是從源細(xì)胞總核酸分離的(2)不鏈接(共價(jià)鍵或共價(jià)相互作用)的全部或一部分的多肽其中“分離的多肽“在本質(zhì)上是聯(lián)系在一起，
(3)可操作地鏈接(共價(jià)鍵或共價(jià)交互)到與它沒(méi)有聯(lián)系的性質(zhì)，或(4)不發(fā)生在自然界多肽。優(yōu)選，分離的多肽實(shí)質(zhì)上從任何其他污染多肽或其他污染物，為它的天然環(huán)境，干擾其治療，診斷，預(yù)防或研究發(fā)現(xiàn)自由使用。術(shù)語(yǔ)“載體”是指任何分子(例如核酸，質(zhì)?；虿《?，用于傳輸編碼信息到宿主細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“表達(dá)載體“，是指載體，它可以通過(guò)一個(gè)合適的宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并包含核酸序列，直接和/或控制插入的外源核酸序列的表達(dá)。表達(dá)包括但不限于加工，如轉(zhuǎn)錄，翻譯和RNA的剪接，如內(nèi)含子存在。術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞“，是用來(lái)指已經(jīng)改變，或者是能夠被轉(zhuǎn)化與核酸序列和表達(dá)了當(dāng)時(shí)人們感興趣的某些基因的細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)包括了母細(xì)胞后代，不論是在形態(tài)的后代在遺傳相同或化妝到原來(lái)的父母，只要選定的基因存在。術(shù)語(yǔ)“自然形成“使用時(shí)，如核酸分子，多肽，宿主細(xì)胞的生物材料連接，等等，這是指在自然界中發(fā)現(xiàn)，并非由人操縱的材料。同樣，“非天然“是指這里所用的一個(gè)不存在于自然界，或已被修改或人為結(jié)構(gòu)合成材料。使用時(shí)與核苷酸的聯(lián)系，術(shù)語(yǔ)“自然發(fā)生“是指基地腺嘌呤(A)，胞嘧啶(C)，鳥(niǎo)嘌呤(G)，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)的。使用時(shí)，與氨基酸連接，術(shù)語(yǔ)“自然發(fā)生“是指20種氨基酸丙氨酸(A)，半胱氨酸(C)和天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)和苯丙氨酸(F)的甘氨酸(G)，組氨酸(H)，異亮氨酸(I)，賴氨酸⑷時(shí)，亮氨酸(L)和蛋氨酸(M)，天冬酰胺(N)，脯氨酸(P)，谷氨酰胺(Q)，精氨酸(R)，絲氨酸(S)和蘇氨酸(T)，纈氨酸(V)，色氨酸(W)和酪氨酸(Y)。術(shù)語(yǔ)“FGF21多肽“是指任何天然野生型多肽在人類表達(dá)。就本申請(qǐng)而言術(shù)語(yǔ)，“FGF21多肽“可以互換使用來(lái)指全長(zhǎng)FGF21多肽，它由209個(gè)氨基酸殘基的(SEQ ID :2)，是由核苷酸編碼序列如SEQ ID 1 ;以及多肽成熟的形式，它由181個(gè)氨基酸殘基的(SEQ ID 4)組成，是由如SEQ ID NO的核苷酸序列編碼3，其中28個(gè)氨基酸殘基或繼續(xù)其全長(zhǎng)的FGF21多肽(即構(gòu)成的信號(hào)肽)已被刪除氨基-端。FGF21多肽可表示有或沒(méi)有的N-端蛋氨酸殘基，正如文中提到的，N-端甲硫氨酸殘基可以添加設(shè)計(jì)或作為細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)的功能。術(shù)語(yǔ)“生物活性”，適用于FGF21多肽，包括FGF21突變多肽所述，指的是野生型FGF21多肽，如降低血糖，胰島素，甘油三酯，或膽固醇的能力，自然發(fā)生的活性；減少體重，改善糖耐量，能量消耗，或胰島素的敏感性。適用于FGF21突變多肽，術(shù)語(yǔ)是不是在類型或已納入FGF21突變多肽引進(jìn)一些修改而定。例如，一些FGF21突變多肽擁有了 FGF21活性有所下降水平相對(duì)于野生型FGF21多肽，但仍然被認(rèn)為是具 有生物活性的FGF21突變多肽。在一個(gè)特定的FGF21突變多肽活性之間的差異可以看出在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)，任何此類的差異與使用的特殊檢測(cè)。這樣的觀察，但并不影響術(shù)語(yǔ)，意思是“生物活性”和FGF21突變多肽露出了野生型FGF21多肽，如降低血糖，胰島素，甘油三酯，或膽固醇的能力，自然發(fā)生的活性；降低體重，改善糖耐量，能量消耗，在任何或胰島素的敏感性，在體內(nèi)或體外試驗(yàn)是“生物活性?！毙g(shù)語(yǔ)“有效量“和”治療有效量“互換使用，并參考了 FGF21突變多肽的使用量，以支持一個(gè)或多個(gè)生物活性的野生型FGF21多肽，如能夠降低，可觀察的水平血糖，胰島素，甘油三酯，或膽固醇水平，降低體重，或改善糖耐量，能量消耗，或胰島素的敏感性。術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的載體“或”生理學(xué)上可接受的載體“作為此處使用的是指一個(gè)或多個(gè)配方材料完成或提高FGF21突變多肽交付使用。這種材料的例子中可以在Remington上文找到，通過(guò)引入并入本文。術(shù)語(yǔ)“系鏈分子“是指由兩個(gè)或兩個(gè)以上建設(shè)FGF21分子的一個(gè)接頭分子拴在一起。一個(gè)系鏈分子至少包括兩個(gè)FGF21多肽，其中至少一種是FGF21突變多肽所述外，但可以由三，四個(gè)或更多的FGF21或FGF21突變多肽接頭一起加入，因此，術(shù)語(yǔ)系鏈分子不局限于一個(gè)分子組成的只有一個(gè)或兩個(gè)FGF21或FGF21突變多肽組合。術(shù)語(yǔ)“高分子附接位點(diǎn)“是指一個(gè)多肽主要氨基酸序列(例如一 FGF21多肽)，它適應(yīng)于有化學(xué)聚合物(例如聚乙二醇分子的所有分子量，聚甘露糖，聚糖共價(jià)鍵合區(qū)域等)。聚合物附接位點(diǎn)可能意味著一個(gè)單一的氨基酸(例如半胱氨酸，賴氨酸，精氨酸或適當(dāng)?shù)姆翘烊话被?或術(shù)語(yǔ)可以指兩個(gè)或多個(gè)相鄰氨基酸無(wú)論是在相互順序或空間。術(shù)語(yǔ)“化學(xué)修飾，“在使用時(shí)就一個(gè)FGF21野生型或FGF21突變所披露者外多肽，是指一個(gè)FGF21多肽已經(jīng)從它的天然狀態(tài)的修改由一個(gè)或多個(gè)外源分子共價(jià)附接第外源分子的例子包括聚乙二醇(PEG)的，單甲氧基-聚乙二醇，右旋糖酐，纖維素，聚-(N-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇，丙二醇均聚物，聚環(huán)氧丙烷/環(huán)氧乙烷共聚物，聚氧乙烯化多元醇，羥基升乙基淀粉(HES)和聚乙烯醇。多肽的化學(xué)修飾FGF21的例子包括聚乙二醇化野生型FGF21和FGF21突變多肽。2.FGF21 突變多肽在各方面，本發(fā)明公開(kāi)了一種為定點(diǎn)聚乙二醇化的FGF21和FGF21突變多肽，可提高對(duì)FGF21分子藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，同時(shí)盡量減少對(duì)體外培養(yǎng)方法的系列活性的影響。增強(qiáng)這些聚乙二醇化FGF21分子藥動(dòng)學(xué)特征具有在體內(nèi)的分子療效上通過(guò)增加接觸到的治療劑的影響。此外，本文所述的策略與聚乙二醇化創(chuàng)建多個(gè)站點(diǎn)，這可能都進(jìn)一步提高對(duì)分子藥代動(dòng)力學(xué)特性，降低其液泡形成潛在的不兼容。采用兩種主要戰(zhàn)略是實(shí)現(xiàn)這個(gè)目標(biāo)，如本文所述。一方面，本發(fā)明涉及FGF21在其中一個(gè)或更多的修改已經(jīng)實(shí)施序列。因此，術(shù)語(yǔ)“FGF21突變多肽”和“FGF21突變體”，它可以互換使用，是指一 FGF21多肽在其中野生型FGF21氨基酸序列(例如如SEQ ID 2或4)已被修改。這些修改包括但不限于一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換，包括與非天然氨基酸類似物，截?cái)嗖迦牒椭脫Q。因此，F(xiàn)GF21多肽突變包括但不限于定點(diǎn)FGF21突變體，如引入非天然聚合物附接位點(diǎn)的人，或傳授程度的抵抗蛋白質(zhì)，如本文所述。為了確定具體的氨基酸突變體的FGF21在本 發(fā)明中，氨基酸殘基截?cái)嗷蛲蛔兙幪?hào)置換的目的對(duì)應(yīng)于成熟的181個(gè)殘基的FGF21多肽(即該的N-端序列開(kāi)始HPIPD，這些殘基都分別指定為殘基第1，2，3，4和5)。N-端蛋氨酸殘基可以但并不需要存在，這N-端甲硫氨酸殘基是不是在蛋白質(zhì)的編碼方案包括在內(nèi)。如上所述，F(xiàn)GF21突變包括截?cái)嘈问降腇GF21包括一個(gè)或多個(gè)置換或插入，其中包括非天然氨基酸構(gòu)成本發(fā)明實(shí)施例體。這樣可以插入或置換傳授包括聚合物附接地點(diǎn)采取行動(dòng)的各種屬性。在這種情況下，非天然氨基酸可以被納入除了各種突變體此處描述成一個(gè)FGF21序列。因此，一 FGF21突變可以由一個(gè)或更多的突變體所述，可以進(jìn)一步包括一個(gè)或多個(gè)非天然氨基酸。一個(gè)非限制性的非天然存在的，可以插入到FGF21序列或在FGF21序列野生型的氨基酸殘基取代的例子清單包括含-氨基酸，均氨基酸，環(huán)狀氨基酸和氨基酸衍生物側(cè)鏈。例子包括(L-形或D-形；縮寫)對(duì)-乙?；?苯丙氨酸，對(duì)-疊氮基-苯丙氨酸，對(duì)-溴-苯丙氨酸，對(duì)-碘-苯丙氨酸和對(duì)-乙炔基-苯丙氨酸，瓜氨酸(CU)，高瓜氨酸(hCit) ,Na-甲基瓜氨酸(NMeCit) ,Na-甲基高瓜氨酸(N a -MeHoCit)，鳥(niǎo)氨酸(Orn)，Na -甲基鳥(niǎo)氨酸(Na -MeOrn或NMeOrn)，肌氨酸(Sar)，高賴氨酸(hLys或hK)，高精氨酸(hArg或hR)，高谷胱甘肽(hQ), Na-甲基精氨酸(NMeR), Na-甲基亮氨酸(Na-MeL或匪eL)，N_甲基高賴氨酸(匪eHoK) ,Na -甲基谷氨酰胺(匪eQ)，異亮氨酸(Nle)，正纈氨酸，(Nva)，1，2，3，4-四氫異喹啉(Tic)，八氫吲哚_2_羧酸(Oic)，3_(1_萘基)丙氨酸(I-Nal)，
3-(2-萘基)丙氨酸(2-Nal)，l，2，3，4-四氫異喹啉(Tic)，2-茚滿基甘氨酸(IgI)，對(duì)-碘苯丙氨酸(Pl-Phe),對(duì)-氨基苯丙氨酸(4AmP或4-氨基-Phe) ,4-胍基苯丙氨酸(Guf),甘氨酰賴氨酸(縮寫"K(Ne-甘氨酰)"或"K(甘氨酰)"或"K(gly)")，硝基苯丙氨酸(nitrophe),氨基苯丙氨酸(氨基苯或氨基-Phe),節(jié)基苯丙氨酸(節(jié)基phe), Y -羧基谷氨酸(Y -羧基glu),輕基脯氨酸(輕基pro), p-羧基I-苯丙氨酸(Cpa), a -氨基己二酸(Aad), Na-甲基纈氨酸(^eVal)，N-a -甲基亮氨酸(NMeLeu), Na-甲基異亮氨酸(匪eNle)，環(huán)戊基甘氨酸(Cpg)，環(huán)己基甘氨酸(Chg)，乙?；彼?乙?；鵤rg)，a，^ - 二氨基丙酸(Dpr), a , Y-二氨基丁酸(Dab)，二氨基丙酸(Dap)，環(huán)己基丙氨酸(Cha)，
4-甲基-苯丙氨酸(MePhe) - 二苯基-丙氨酸(BiPhA)，氨基丁酸(Abu) ,4-苯基-苯丙氨酸(或二苯丙氨酸4Bip)，a-氨基-異丁酸(Aib)，￠-丙氨酸，￠-氨基丙酸，哌啶酸，氨基己酸，氨基庚酸，氨基庚二酸，desmosine, 二氨基庚二酸，N-乙基甘氨酸，N-乙基天冬酰胺，輕基賴氨酸，異-輕基賴氨酸，isodesmosine,別-異亮氨酸,N-甲基甘氨酸,N-甲基異亮氨酸，N-甲基纈氨酸，4-羥基脯氨酸(Hyp)，Y-羧基谷氨酸鹽，e -N, N，N-三甲基賴氨酸，e -N-乙?；嚢彼?，0-磷酸絲氨酸，N-乙酰基絲氨酸，N-甲酰蛋氨酸，3-甲基組氨酸，5-羥基賴氨酸，Co -甲基精氨酸，4-氨基-O-鄰苯二甲酸(4APA)，和其他類似氨基酸以及那些特定列出的任一種的衍生形式。 在本發(fā)明實(shí)施例等，F(xiàn)GF21突變多肽包括一個(gè)氨基酸序列即至少百分之85至野生型相同F(xiàn)GF21氨基酸序列(例如如SEQ ID 2或4)，但其中的具體殘基介紹非天然聚合物附接位點(diǎn)中的FGF21突變多肽本有沒(méi)有得到進(jìn)一步的修改。換句話說(shuō)，隨著殘基的FGF21異常突變序列已被修改，以便引入非天然聚合物附接位點(diǎn)或一抗突變，提高蛋白質(zhì)，約15百分之的所有其他氨基酸殘基在FGF21突變序列可能會(huì)被修改。例如，在FGF21突變多肽G170C，多達(dá)15%的所有氨基酸殘基的其他比甘氨酸殘基的位置170可以修改。還有一些實(shí)施方案中，F(xiàn)GF21多肽的氨基酸序列突變包括至少是百分之九十左右，約有95，96，97，或98或百分之99到野生型相同F(xiàn)GF21氨基酸序列(例如的SEQ ID :2，4，6或8)，但其中的具體殘基已被修改，那是引入非天然聚合物附接位點(diǎn)或提高蛋白質(zhì)阻力沒(méi)有得到進(jìn)一步的修改。這種FGF21突變多肽具有至少對(duì)野生型FGF21多肽一種活性。FGF21突變多肽可產(chǎn)生氨基酸置換引入，無(wú)論是保守或不保守的性質(zhì)和利用自然或不自然產(chǎn)生的氨基酸的FGF21多肽在特定的位置。這種置換可以在設(shè)計(jì)或置換除了提出一個(gè)理想的觀察傳授屬性到FGF21多肽。通過(guò)舉例的方式，一種FGF21突變多肽能包括設(shè)計(jì)來(lái)實(shí)現(xiàn)，如引入非天然聚合物附接位點(diǎn)或增強(qiáng)抗水解一個(gè)理想的屬性，置換，并能進(jìn)一步包括一個(gè)或更多的保守或不保守的置換可能，但不需要維護(hù)野生型FGF21多肽的生物活性。FGF21突變體，可以保守或不保守。一個(gè)"保守氨基酸置換"會(huì)涉及到與外來(lái)的殘基取代原生氨基酸殘基(即殘基中的野生型FGF21多肽序列中指定的位置找到)(即殘基是不發(fā)現(xiàn)一對(duì)野生型FGF21多肽序列中指定位置)等，很少有或沒(méi)有對(duì)氨基酸殘基在該位置極性或電荷效應(yīng)。保守的氨基酸置換也是包括非天然氨基酸殘基那通常是由化學(xué)合成肽，而不是在生物系統(tǒng)的合成中。這些措施包括肽和氨基酸倒基逆轉(zhuǎn)或其他形式。天然存在的殘基可基于通常側(cè)鏈性質(zhì)來(lái)分類(I)疏水性:異亮氨酸，Met, Ala, Val, Leu, He ；(2)中性親水性Cys, Ser, Thr ；(3)酸性Asp, Glu ；(4)堿性Asn, Gin, His, Lys, Arg ；(5)影響側(cè)鏈取向的殘基Gly, Pro ;以及(6)芳族Trp, Tyr, Phe。保守的置換可涉及這些類中的一個(gè)成員，在同一類的其他成員交換。非保守置換可能涉及的一個(gè)成員對(duì)這些類的一個(gè)成員從另一個(gè)類的交換。所需的氨基酸置換的(無(wú)論保守或不保守)可以被那些在當(dāng)時(shí)這種置換由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定的。一種氨基酸置換的例子(但不限于)列表列于表I。表I氨基酸置換
權(quán)利要求
1.一種分離的核酸分子，包含編碼SEQ ID NO :4的多肽的核苷酸序列，所述多肽具有下列至少ー種氨基酸置換 (a)在36，72，77，126和175位中的ー個(gè)或多個(gè)的賴氨酸殘基；(b)在37，38，46，91，69，77，79，87，91，112，113，120，121，125，126，175，170 和 179 位中的一個(gè)或多個(gè)的半胱氨酸殘基； (c)在56，59，69和122位中的ー個(gè)或多個(gè)的精氨酸殘基； (d)在170位的甘氨酸殘基； (e)在171位的甘氨酸殘基； 以及(a)-(e)的組合。
2.ー種載體，包含權(quán)利要求I所述的核酸分子。
3.—種宿主細(xì)胞，包含權(quán)利要求2所述的載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的宿主細(xì)胞，其是真核細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的宿主細(xì)胞，其是原核細(xì)胞。
6.一種制備由權(quán)利要求2所述的載體編碼的多肽的方法,包括在合適的條件下培養(yǎng)包含權(quán)利要求2所述的載體的宿主細(xì)胞，以表達(dá)所述多肽，并且任選地分離所述多肽。
7.一種由權(quán)利要求6所述的方法制備的多肽。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的多肽，還包含引入所述多肽的C-端的脯氨酸或甘氨酸殘基。
9.一種分離的多肽，包含具有下列至少ー種氨基酸置換的SEQ ID NO :4的氨基酸序列 (a)在36，72，77，126和175位中的ー個(gè)或多個(gè)的賴氨酸殘基；(b)在37，38，46，91，69，77，79，87，91，112，113，120，121，125，126，175，170 和 179 位中的一個(gè)或多個(gè)的半胱氨酸殘基； (c)在56，59，69和122位中的ー個(gè)或多個(gè)的精氨酸殘基； (d)在170位的甘氨酸殘基； (e)在171位的甘氨酸殘基； 以及(a)-(e)的組合。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的多肽，還包含引入所述多肽的C-端的脯氨酸或甘氨酸殘基。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的多肽，其中所述多肽共價(jià)連接一種或多種聚合物。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的分離的多肽，其中所述多肽共價(jià)連接一種聚合物。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的分離的多肽，其中所述聚合物是水溶性聚合物。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的分離的多肽，其中所述水溶性聚合物是聚こニ醇(PEG)，單甲氧基-聚こニ醇，右旋糖酐，纖維素，聚-(N-こ烯吡咯烷酮)聚こニ醇，丙ニ醇均聚物，聚環(huán)氧丙烷/環(huán)氧こ烷共聚物，聚氧こ烯化多元醇或聚こ烯醇。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的分離的多肽，其中所述水溶性聚合物是PEG。
16.根據(jù)權(quán)利要求11所述的分離的多肽，其中所述聚合物是分支聚合物。
17.根據(jù)權(quán)利要求9所述的分離的多肽，其中所述多肽具有共價(jià)連接其氨基-端的PEG部分。
18.根據(jù)權(quán)利要求9所述的分離的多肽，其中所述多肽共價(jià)連接兩種聚合物。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的分離的多肽，其中所述兩種聚合物中的ー種是水溶性聚合物。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的分離的多肽，其中所述水溶性聚合物是聚こニ醇(PEG)，單甲氧基-聚こニ醇，右旋糖酐，纖維素，聚-(N-こ烯吡咯烷酮)聚こニ醇，丙ニ醇均聚物，聚環(huán)氧丙烷/環(huán)氧こ烷共聚物，聚氧こ烯化多元醇或聚こ烯醇。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的分離的多肽，其中所述水溶性聚合物是PEG。
22.根據(jù)權(quán)利要求18所述的分離的多肽，其中所述聚合物中的一種是分支的。
23.根據(jù)權(quán)利要求18所述的分離的多肽，其中所述聚合物中的兩種都是分支的。
24.根據(jù)權(quán)利要求9所述的分離的多肽，其中所述多肽具有共價(jià)連接其氨基-端的PEG部分。
25.ー種藥物組合物，包含根據(jù)權(quán)利要求9所述的分離的多肽和藥學(xué)上可接受的配制齊U。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的藥物組合物，其中所述藥學(xué)上可接受的配制劑是載體、佐齊U、增溶剤、穩(wěn)定劑或抗氧化劑。
27.ー種治療代謝紊亂的方法，包括向需要的人患者施用權(quán)利要求26所述的藥物組合物。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述代謝紊亂是糖尿病。
29.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述代謝紊亂是肥胖癥。
30.一種編碼多肽的分離的核酸，所述多肽包括具有下列至少ー種氨基酸置換的SEQID NO 4的氨基酸序列 (a)在36，72，77，126和175位中的ー個(gè)或多個(gè)的賴氨酸殘基；(b)在37，38，46，91，69，77，79，87，91，112，113，120，121，125，126，175，170 和 179 位中的一個(gè)或多個(gè)的半胱氨酸殘基； (c)在56，59，69和122位中的ー個(gè)或多個(gè)的精氨酸殘基； (d)在170位的甘氨酸殘基； (e)在171位的甘氨酸殘基； 以及(a)-(e)的組合， 以及其包含使所述多肽與SEQ ID NO 4至少85%—致的増加、缺失或進(jìn)ー步置換，前提條件是權(quán)利要求I (a)-(e)所述的至少ー種氨基酸置換不進(jìn)行進(jìn)ー步修飾。
31.ー種載體，包含權(quán)利要求30所述的核酸分子。
32.—種宿主細(xì)胞，包含權(quán)利要求31所述的載體。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的宿主細(xì)胞，其是真核細(xì)胞。
34.根據(jù)權(quán)利要求32所述的宿主細(xì)胞，其是原核細(xì)胞。
35.一種制備由權(quán)利要求30所述的載體編碼的多肽的方法，包括在合適的條件下培養(yǎng)包含權(quán)利要求30所述的載體的宿主細(xì)胞，以表達(dá)所述多肽，并且任選地分離所述多肽。
36.一種由權(quán)利要求35所述的方法制備的多肽。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的多肽，還包含引入所述多肽的C-端的脯氨酸或甘氨酸殘基。
38.一種分離的多肽，包含具有下列至少ー種氨基酸置換的SEQID NO :4的氨基酸序列(a)在36，72，77，126和175位中的ー個(gè)或多個(gè)的賴氨酸殘基；(b)在37，38，46，91，69，77，79，87，91，112，113，120，121，125，126，175，170 和 179 位中的一個(gè)或多個(gè)的半胱氨酸殘基； (c)在56，59，69和122位中的ー個(gè)或多個(gè)的精氨酸殘基； (d)在170位的甘氨酸殘基； (e)在171位的甘氨酸殘基； 以及(a)-(e)的組合， 以及其包含使所述多肽與SEQ ID NO :4至少85%—致的増加、缺失或進(jìn)ー步置換，前提條件是權(quán)利要求I (a)-(e)所述的至少ー種氨基酸置換不進(jìn)行進(jìn)ー步修飾。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的多肽，還包含引入所述多肽的C-端的脯氨酸或甘氨酸殘基。
40.根據(jù)權(quán)利要求38所述的分離多肽，其中所述多肽共價(jià)連接一種聚合物。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的分離的多肽，其中所述聚合物是水溶性聚合物。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的分離的多肽，其中所述水溶性聚合物是聚こニ醇(PEG)，單甲氧基-聚こニ醇，右旋糖酐，纖維素，聚-(N-こ烯吡咯烷酮)聚こニ醇，丙ニ醇均聚物，聚環(huán)氧丙烷/環(huán)氧こ烷共聚物，聚氧こ烯化多元醇或聚こ烯醇。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的分離的多肽，其中所述水溶性聚合物是PEG。
44.根據(jù)權(quán)利要求40所述的分離的多肽，其中所述聚合物是分支的。
45.根據(jù)權(quán)利要求38所述的分離的多肽，其中所述多肽具有共價(jià)連接其氨基-端的單一 PEG部分。
46.根據(jù)權(quán)利要求38所述的分離的多肽，其中所述多肽共價(jià)連接兩種聚合物。
47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的分離的多肽，其中所述兩種聚合物中的ー種是水溶性聚合物。
48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的分離的多肽，其中所述水溶性聚合物是聚こニ醇(PEG)，單甲氧基-聚こニ醇，右旋糖酐，纖維素，聚-(N-こ烯吡咯烷酮)聚こニ醇，丙ニ醇均聚物，聚環(huán)氧丙烷/環(huán)氧こ烷共聚物，聚氧こ烯化多元醇或聚こ烯醇。
49.根據(jù)權(quán)利要求48所述的分離的多肽，其中所述水溶性聚合物是PEG。
50.根據(jù)權(quán)利要求46所述的分離的多肽，其中所述聚合物中的兩種都是水溶性聚合物。
51.根據(jù)權(quán)利要求50所述的分離的多肽，其中所述水溶性聚合物獨(dú)立地是聚こニ醇(PEG)，單甲氧基-聚こニ醇，右旋糖酐，纖維素，聚-(N-こ烯吡咯烷酮)聚こニ醇，丙ニ醇均聚物，聚環(huán)氧丙烷/環(huán)氧こ烷共聚物，聚氧こ烯化多元醇或聚こ烯醇、以及它們的組合。
52.根據(jù)權(quán)利要求46所述的分離的多肽，其中兩種所述水溶性聚合物都是PEG。
53.根據(jù)權(quán)利要求46所述的分離的多肽，其中所述聚合物中的一種是分支的。
54.根據(jù)權(quán)利要求46所述的分離的多肽，其中所述聚合物中的兩種是分支的。
55.ー種藥物組合物，包含權(quán)利要求38所述的分離的多肽和藥學(xué)上可接受的配制劑。
56.根據(jù)權(quán)利要求55所述的藥物組合物，其中所述藥學(xué)上可接受的配制劑是載體、佐齊U、增溶剤、穩(wěn)定劑或抗氧化劑。
57.ー種治療代謝紊亂的方法，包括向需要的人患者施用權(quán)利要求56所述的藥物組合物。
58.根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其中所述代謝紊亂是糖尿病。
59.根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其中所述代謝紊亂是肥胖癥。
60.一種組合物，包含通過(guò)接頭結(jié)合第二多肽的第一多肽，所述第一多肽含有任選地具有下列至少ー種氨基酸置換的SEQ ID NO 4的氨基酸序列 (a)在36，72，77，126和175位中的ー個(gè)或多個(gè)的賴氨酸殘基；(b)在37，38，46，91，69，77，79，87，91，112，113，120，121，125，126，175，170 和 179 位中的一個(gè)或多個(gè)的半胱氨酸殘基； (c)在56，59，69和122位中的ー個(gè)或多個(gè)的精氨酸殘基； (d)在170位的甘氨酸殘基； (e)在171位的甘氨酸殘基； 以及(a)-(e)的組合， 所述第二多肽包括任選地具有下列至少ー種氨基酸置換的SEQ ID NO :4的氨基酸序列的多肽 (a)在36，72，77，126和175位中的ー個(gè)或多個(gè)的賴氨酸殘基；(b)在37，38，46，91，69，77，79，87，91，112，113，120，121，125，126，175，170 和 179 位中的一個(gè)或多個(gè)的半胱氨酸殘基； (c)在56，59，69和122位中的ー個(gè)或多個(gè)的精氨酸殘基； (d)在170位的甘氨酸殘基； (e)在171位的甘氨酸殘基； 以及(a)-(e)的組合。
61.根據(jù)權(quán)利要求60所述的多肽，其中所述第一、第二或兩種多肽還包含引入所述多肽的C-端的脯氨酸或甘氨酸殘基。
62.根據(jù)權(quán)利要求60所述的組合物，其中所述接頭是肽。
63.根據(jù)權(quán)利要求60所述的組合物，其中所述接頭是水不溶性聚合物。
64.根據(jù)權(quán)利要求63所述的組合物，其中所述水溶性聚合物是聚こニ醇(PEG)，單甲氧基-聚こニ醇，右旋糖酐，纖維素，聚-(N-こ烯吡咯烷酮)聚こニ醇，丙ニ醇均聚物，聚環(huán)氧丙烷/環(huán)氧こ烷共聚物，聚氧こ烯化多元醇或聚こ烯醇。
65.根據(jù)權(quán)利要求64所述的組合物，其中所述水溶性聚合物是PEG。
66.根據(jù)權(quán)利要求60所述的組合物，其中所述第一、第二或兩種多肽除了所述接頭還共價(jià)連接一種聚合物。
67.根據(jù)權(quán)利要求66所述的組合物，其中所述聚合物是水溶性聚合物。
68.根據(jù)權(quán)利要求67所述的組合物，其中所述水溶性聚合物是聚こニ醇(PEG)，單甲氧基-聚こニ醇，右旋糖酐，纖維素，聚-(N-こ烯吡咯烷酮)聚こニ醇，丙ニ醇均聚物，聚環(huán)氧丙烷/環(huán)氧こ烷共聚物，聚氧こ烯化多元醇或聚こ烯醇。
69.根據(jù)權(quán)利要求68所述的組合物，其中所述水溶性聚合物是PEG。
70.根據(jù)權(quán)利要求63所述的組合物，其中所述聚合物是分支的。
71.根據(jù)權(quán)利要求60所述的組合物，其中所述組合物具有共價(jià)連接其氨基-端的単一PEG部分。
72.根據(jù)權(quán)利要求60所述的組合物，其中所述組合物共價(jià)連接兩種聚合物。
73.根據(jù)權(quán)利要求72所述的組合物，其中所述兩種聚合物中的ー種是水溶性聚合物。
74.根據(jù)權(quán)利要求73所述的組合物，其中所述水溶性聚合物是聚こニ醇(PEG)，單甲氧基-聚こニ醇，右旋糖酐，纖維素，聚-(N-こ烯吡咯烷酮)聚こニ醇，丙ニ醇均聚物，聚環(huán)氧丙烷/環(huán)氧こ烷共聚物，聚氧こ烯化多元醇或聚こ烯醇。
75.根據(jù)權(quán)利要求74所述的組合物，其中所述水溶性聚合物是PEG。
76.根據(jù)權(quán)利要求72所述的組合物，其中所述聚合物中的兩種都是水溶性聚合物。
77.根據(jù)權(quán)利要求76所述的組合物，其中所述水溶性聚合物獨(dú)立地是聚こニ醇(PEG)，單甲氧基-聚こニ醇，右旋糖酐，纖維素，聚-(N-こ烯吡咯烷酮)聚こニ醇，丙ニ醇均聚物，聚環(huán)氧丙烷/環(huán)氧こ烷共聚物，聚氧こ烯化多元醇或聚こ烯醇、以及它們的組合。
78.根據(jù)權(quán)利要求77所述的組合物，其中兩種所述水溶性聚合物都是PEG。
79.根據(jù)權(quán)利要求72所述的分離的多肽，其中所述聚合物中的一種是分支的。
80.根據(jù)權(quán)利要求72所述的分離的多肽，其中所述聚合物中的兩種是分支的。
81.ー種藥物組合物，包含權(quán)利要求60所述的組合物和藥學(xué)上可接受的配制劑。
82.根據(jù)權(quán)利要求81所述的藥物組合物，其中所述藥學(xué)上可接受的配制劑是載體、佐齊U、增溶剤、穩(wěn)定劑或抗氧化劑。
83.ー種治療代謝紊亂的方法，包括向需要的人患者施用權(quán)利要求81所述的藥物組合物。
84.根據(jù)權(quán)利要求83所述的方法，其中所述代謝紊亂是糖尿病。
85.根據(jù)權(quán)利要求83所述的方法，其中所述代謝紊亂是肥胖癥。
全文摘要
本發(fā)明提供編碼FGF21突變多肽的核酸分子，F(xiàn)GF21突變多肽，包含F(xiàn)GF21突變多肽的藥物組合物，以及使用所述核酸、多肽或者藥物組合物治療代謝紊亂的方法。
文檔編號(hào)C07K14/50GK102625811SQ200980150308
公開(kāi)日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2009年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月10日
發(fā)明者C·V·小格格, E·J·貝盧斯基, J·徐, K·W·沃克, M·L·邁克爾斯, M·M·埃利森, R·I·赫希特, Y-S·李 申請(qǐng)人:安姆根有限公司