一種酸性木聚糖酶突變體及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于功能基因改造技術領域，具體涉及一種酸性木聚糖酶突變體及其應 用。 技術背景
[0002] 木聚糖（xylan)是半纖維素的重要組分，廣泛存在于自然界中，幾乎占地球可更 新有機碳含量的三分之一，它是自然界中含量僅次于纖維素的第二豐富的多聚糖。在裸 子植物中占干物質重的7% -12%，在被子植物中木聚糖占干物質重的15% -30%。但木 聚糖在動物的消化道內不能被消化和吸收，具有很強的抗營養(yǎng)作用，而且會影響其它養(yǎng)分 的吸收利用，因而大大限制了富含木聚糖飼料（大麥、小麥、黑麥等）的應用。木聚糖酶 (Xylanase)是指能專一降解半纖維素木聚糖為低聚木糖和木糖的一組酶的總稱。人們對木 聚糖酶的研宄早在六十年代就已開始，主要研宄集中在造紙、飼料、食品、能源工業(yè)等方面 的木聚糖酶，已經從不同來源的微生物中分離到大量的不同類型不同功能的木聚糖酶。并 分離出多種木聚糖酶基因，已工業(yè)化生產多種木聚糖酶產品。
[0003] 迄今為止發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)木聚糖酶最適作用pH值在6-7范圍內，關于酸性木聚糖酶 的報道比較少。近幾年對酸性木聚糖酶（PH4.0以下時仍保持較高酶活性）的開發(fā)已經引 起人們的廣泛關注，對于酸性木聚糖酶的生產、純化、性質、酸性特征的結構基礎及其在飼 料加工、釀酒工業(yè)、果汁加工、以及能源等領域的應用等方面的研宄正在不斷深入。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種酸性木聚糖酶突變體及其應用，即通過對來源于繩狀青 霉（Penicillium funiculosum)的木聚糖酶進行蛋白質工程改造，獲得了耐熱性顯著提高 的突變體，有利于其在飼料領域的廣泛應用。
[0005] 申請人對繩狀青霉的木聚糖酶進行突變，經過大量的篩選，發(fā)現(xiàn)N104D、T128G、 Y129Q這三個突變位點能引起木聚糖酶耐熱性的提高，從而促成本發(fā)明。
[0006] 本發(fā)明一方面提供了一種木聚糖酶突變體，是氨基酸序列為SEQ ID NO :1的木聚 糖酶的第128位氨基酸由Thr變?yōu)镚ly。
[0007] 上述突變體的氨基酸序列為SEQ ID NO :3,其一種編碼基因的核酸序列為SEQ ID NO :4〇
[0008] 本發(fā)明還包括攜帶有編碼序列為SEQ ID NO :4的木聚糖酶突變體的質粒。
[0009] 本發(fā)明一方面提供了另一種木聚糖酶突變體，是氨基酸序列為SEQ ID NO :3的木 聚糖酶的第129位氨基酸由Tyr變?yōu)镚ln.
[0010] 上述突變體的氨基酸序列為SEQ ID NO :5,其一種編碼基因的核酸序列為SEQ ID NO :6〇
[0011] 本發(fā)明還提供攜帶編碼序列為SEQ ID NO :6的突變體基因的質粒。
[0012] 本發(fā)明還提供了一種木聚糖酶突變體，是氨基酸序列為SEQ ID NO :5的木聚糖酶 的第104位氨基酸由Asn變?yōu)锳sp。
[0013] 所述突變體的氨基酸序列為SEQ ID NO :7,其一種編碼基因的核酸序列為SEQ ID NO :8〇
[0014] 本發(fā)明還包括攜帶有編碼序列為SEQ ID NO :8的突變體基因的質粒。
[0015] 本發(fā)明還提供了一種宿主細胞，包含攜帶有木聚糖酶突變體基因的質粒。
[0016] 所述宿主細胞優(yōu)選為畢赤酵母（Pichia pastoris)。
[0017] 本發(fā)明提供的野生型木聚糖酶XynH2的最適反應溫度為50°C，而突變體XynH2-l 和XynH2-2的最適反應溫度為55°C，突變體XynH2-3的最適反應溫度高達60°C，而且，在高 于53°C條件下，三個突變體的相對酶活水平均顯著高于野生型；65°C處理5min后，野生型 木聚糖酶XynH2的酶活殘留率僅為5% ;而木聚糖酶突變體XynH2-l、XynH2-2、XynH2-3的 酶活殘留率分別為20 %、35 %、46 %，從而說明本發(fā)明篩選到的木聚糖酶突變體XynH2-l、 XynH2-2和XynH2-3的耐熱性均得到顯著提高，其中突變體XynH2-3的耐熱性最強。此外， 本發(fā)明提供的木聚糖酶突變體XynH2-l、XynH2-2、XynH2-3的最適反應pH值均為5. 0,且對 人工胃液和人工腸液均具有很高的耐受性，有利于其在飼料中的廣泛應用。
【附圖說明】
[0018] 圖 1 為 SDS-PAGE 電泳圖；
[0019] 其中：M為蛋白分子量Marker，泳道1為轉空載體對照菌，泳道2-5分別為畢赤酵 母 XynH2、XynH2-l、XynH2-2、XynH2-3 發(fā)酵上清液；
[0020] 圖2為木聚糖酶突變體與野生型的最適反應pH比較圖；
[0021] 圖3為木聚糖酶突變體與野生型的最適反應溫度比較圖。
【具體實施方式】
[0022] 本發(fā)明用到了遺傳工程和分子生物學領域使用的常規(guī)技術和方法，例如 MOLECULAR CL0NING:A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed. (Sambrook,2001)和 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Ausubel, 2003)中所記載的方法。這些一般性參考文獻 提供了本領域技術人員已知的定義和方法。但是，本領域的技術人員可以在本發(fā)明所記載 的技術方案的基礎上，采用本領域其它常規(guī)的方法、實驗方案和試劑，而不限于本發(fā)明具體 實施例的限定。
[0023] 下面結合【具體實施方式】對本發(fā)明進行詳細描述。
[0024] 實施例1木聚糖酶基因的擴增
[0025] 根據(jù)公共基因數(shù)據(jù)庫中的基因序列，優(yōu)化了合成基因的密碼子并人工合成酸性木 聚糖酶基因 XynH2,其核苷酸序列為SEQ ID NO :2,其編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO :1。
[0026] 采用PCR反應克隆酸性木聚糖酶基因 XynH2片段，引物和反應條件如下：
[0027] 引物 I(F) :GCGCGAATTCTTTCCTTCTGAGTTGGCTCAA
[0028] 引物 2(R) :TAAAGCGGCCGCTTAAGAGACGGTAATAGTAGA
[0029] 反應條件為：94 °C變性30s，56 °C復性30s，72 °C延伸45s，30個循環(huán)后，72 °C保溫 10min。瓊脂糖電泳結果顯示，XynH2基因為大小621bp的片段。
[0030] 實施例2木聚糖酶突變體的構建及篩選
[0031] 申請人為了提高上述木聚糖酶XynH2的耐熱性，通過定向進化技術對該酶進行了 大量突變的篩選。
[0032] 以XynH2基因為模板，以引物1、2用GeneMorph II隨機突變PCR試劑盒 (Stratagene)進行PCR擴增，膠回收PCR產物，EcoRI、NotI進行酶切處理后與經同樣酶切 后的pET21a載體連接，轉化至大腸桿菌BL21 (DE3)中，涂布于LB+Amp平板，37°C倒置培養(yǎng)， 待轉化子出現(xiàn)后，用牙簽逐個挑至96孔板，每個