專利名稱:與甲醇和葡萄糖相應(yīng)答的酵母菌調(diào)節(jié)區(qū)的制作方法
本發(fā)明涉及重組DNA技術(shù)。一方面，本發(fā)明涉及甲醇誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)區(qū)，另一方面，本項(xiàng)發(fā)明涉及葡萄糖存在的條件下被阻遇了的調(diào)節(jié)區(qū)域。還有一方面，本發(fā)明涉及整合了本發(fā)明的調(diào)節(jié)區(qū)的新型表達(dá)載體，以及由此產(chǎn)生的新型轉(zhuǎn)化體和受調(diào)節(jié)的多肽的表達(dá)。
近年來，由于重組DNA技術(shù)的發(fā)展，所以就使得控制由微生物產(chǎn)生的各種有用多肽成為可能。許多真核多肽如人生長激素、白細(xì)胞干擾素、人胰島素、人胰島素原等等已由多種微生物產(chǎn)生。人們期待將來重組DNA技術(shù)能有進(jìn)一步的發(fā)展，以便得到更加有效的方法來利用微生物生產(chǎn)有用的多肽產(chǎn)品。一項(xiàng)吸引人的發(fā)展將是調(diào)節(jié)區(qū)域的分離和鑒定，該調(diào)節(jié)區(qū)域可以通過選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基、生長條件或其它條件而很容易地打開和關(guān)閉。
例如，Ellis、Brust、Koutz、Waters、Harpold和Gingeras就曾在1985年5月的《分子及細(xì)胞生物學(xué)》出版物(1111-1121頁)上揭示了DNA序列的分離和特性鑒定，該序列與甲醇的存在相應(yīng)答，并且在某些分解代謝抑制碳源如葡萄糖存在的條件下，該序列受到分解代謝產(chǎn)物阻遏。本發(fā)明是在對上述的參考資料進(jìn)行進(jìn)一步的研究后得出的結(jié)果。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的就是對Ellis等的甲醇應(yīng)答DNA序列的功能性亞片段進(jìn)行分離和特性鑒定。
本發(fā)明的這一目的及其它目的從這里所提供的說明書和權(quán)利要求
書中明顯可見。
本發(fā)明人已驚奇地發(fā)現(xiàn)由Ellis、Brust、Koutz、Waters、Harpold和Gingeras(Molecular and Cellular Biology，1985年5月，1111-1121頁)等所公布的調(diào)節(jié)區(qū)的獨(dú)特亞片段具有獨(dú)特的調(diào)節(jié)性質(zhì);一個(gè)這樣的調(diào)節(jié)區(qū)當(dāng)作為染色體成分引進(jìn)宿主體內(nèi)時(shí)，在甲醇存在的條件下能夠完全誘導(dǎo);另一個(gè)這樣的調(diào)節(jié)區(qū)當(dāng)作為染色體外成分引進(jìn)宿主體內(nèi)時(shí)，甲醇能夠?qū)ζ溥M(jìn)行完全誘導(dǎo);還有另一個(gè)這樣的調(diào)節(jié)區(qū)能夠?yàn)槎ㄎ辉谙掠蔚漠愒磫?dòng)子核苷酸序列提供這樣一種能力，即在甲醇存在的條件下被誘導(dǎo)而在分解代謝產(chǎn)物抑制碳源存在的條件下被阻遏。
圖1是畢赤酵母屬的伯醇氧化酶基因(AOXI)的5′區(qū)的限制性酶切圖譜。
圖2是質(zhì)粒pSAOH5的限制性酶切圖譜。
圖3是在pBR322基礎(chǔ)之上構(gòu)建的質(zhì)粒pPG2.5的酵母插入子的限制性酶切圖譜。
圖4是質(zhì)粒pBPf3I的限制性酶切圖譜。
圖5是實(shí)例中的討論的構(gòu)建載體的流程圖。
下面的縮寫是用在圖中以代表所用的限制性內(nèi)切酶。
縮寫 限制酶A AvaⅡB BamHⅠB2BglⅡBc BclⅠH2HincⅡH3HindⅢK KpnⅡNd1NdeⅠNr NruⅠPs PstⅠPv2PvuⅡR1EcoRⅠ
R5EcoRVS SalⅠSm SmaⅠSs SstⅠSt StuⅠ附圖中，用于DNA片段的操作的限制性酶切位點(diǎn)用圓括號(hào)將破壞位點(diǎn)的縮寫圈起來表示，不過這些點(diǎn)在連接時(shí)被破壞。
本發(fā)明提供了一種新型DNA片段，它包括與培養(yǎng)基中的甲醇的存在相應(yīng)答的調(diào)節(jié)區(qū)，該培養(yǎng)基是與該DNA片段的宿主體相聯(lián)系的。當(dāng)將本發(fā)明的一新型片段作為單拷貝整合進(jìn)宿主體的基因組(即作為染色體成分而不是作為染色體外成分被攜帶)時(shí)，它能夠在甲醇存在的條件下促進(jìn)完全誘導(dǎo)。當(dāng)作為宿主體的染色體外成分(即在宿主體內(nèi)作為自主成分維持)或作為染色體成分時(shí)，本發(fā)明的另一新型片段在甲醇存在的情況下能夠促進(jìn)完全誘導(dǎo)。當(dāng)本發(fā)明的DNA片段的調(diào)節(jié)區(qū)位于編碼產(chǎn)生mRNA的DNA的5′末端時(shí)，它能夠控制mRNA的轉(zhuǎn)錄。上述DNA片段的突變型和功能等價(jià)物也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
“完全誘導(dǎo)”一詞用在本發(fā)明書中是指所給DNA片段與甲醇的存在相應(yīng)答的能力。該詞涉及甲醇與調(diào)節(jié)區(qū)相應(yīng)答以誘導(dǎo)產(chǎn)生蛋白質(zhì)產(chǎn)物的水平的能力，該水平與使用同相調(diào)節(jié)區(qū)一結(jié)構(gòu)基因構(gòu)造物轉(zhuǎn)化的宿主的野生型AOXI蛋白質(zhì)編碼序列上游的1Kb非編碼序列新達(dá)到的水平相當(dāng)。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種由上游激活劑序列組成的DNA片段，它賦予位于下游的異源啟動(dòng)子核苷酸序列這樣一種能力，即在該DNA片段的宿主體所在的培養(yǎng)基中含有甲醇時(shí)，能夠誘導(dǎo)其表達(dá)，而在含有分解代謝產(chǎn)物抑制碳源時(shí)，能夠抑制表達(dá)。當(dāng)將本發(fā)明的這一實(shí)施方案中的DNA片段的調(diào)節(jié)區(qū)與位于編碼mRNA的5′末端的異源啟動(dòng)子相結(jié)合時(shí)，它能夠控制mRNA的轉(zhuǎn)錄。上述DNA片段突變型和功能等價(jià)物也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
按照本發(fā)明，還可進(jìn)一步提供質(zhì)粒和含有上述DNA片段的轉(zhuǎn)化體，以及使用這種轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)多肽的工序。
在本發(fā)明的另一實(shí)例方案中，還提供了一種通過使用可變數(shù)量的可操作調(diào)節(jié)區(qū)的核苷酸來控制調(diào)節(jié)區(qū)對于甲醇的應(yīng)答的方法。能夠獲得的甲醇應(yīng)答范圍從微小應(yīng)答(只有“完全”誘導(dǎo)的百分之幾)直至完全甲醇誘導(dǎo)均可達(dá)到。
本發(fā)明的調(diào)節(jié)區(qū)對于使用重組DNA修飾的宿主用以調(diào)節(jié)多肽的生產(chǎn)是非常有用的。例如，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，從整合表達(dá)盒中甲醇誘導(dǎo)多肽產(chǎn)物的表達(dá)是可能的。在另一實(shí)施方案中，從自主表達(dá)盒中甲醇誘導(dǎo)多肽產(chǎn)物的表達(dá)也是可能的。
按照本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例，多肽產(chǎn)物的表達(dá)受轉(zhuǎn)化宿主控制，而該宿主帶有一種多肽編碼序列，這一序列在甲醇誘導(dǎo)和分解代謝產(chǎn)物抑制條件相應(yīng)答的上游激活劑序列的控制之下;并且此后在甲醇或分解代謝產(chǎn)物抑制碳源存在或缺乏的條件下使轉(zhuǎn)化宿主得以維持。這樣，按照這一具體實(shí)施方案，如果需要某一特定水平的多肽產(chǎn)物，就可以對培養(yǎng)基的組成進(jìn)行調(diào)整，直至達(dá)到所需水平的多肽產(chǎn)物，然后通過向培養(yǎng)基中加入一種分解代謝產(chǎn)物抑制碳源以阻止多肽編碼序列的進(jìn)一步表達(dá)。
按照這后一種實(shí)施方案，本發(fā)明的上游激活劑序列對于在正常的非調(diào)節(jié)啟動(dòng)子的控制條件下完成多肽產(chǎn)物的調(diào)節(jié)生產(chǎn)是有用的。例如，通過摻入本發(fā)明的上游激活劑序列，可以使得組成啟動(dòng)子對甲醇誘導(dǎo)和分解代謝產(chǎn)物抑制作出反應(yīng)。按這種方式，任何能夠作為RNA轉(zhuǎn)錄的一個(gè)啟動(dòng)子的功能序列的表達(dá)都可以通過有無甲醇或分解代謝產(chǎn)物抑制碳源而受到控制。
將從Ellis、rust、Koutz、Waters、Harpold和Gingeras所揭示的伯醇氧化酶基因(AOX;見圖1)(Molecular and Cellalor Biology，1985年5月，1111-1121頁)的5′端得到的大約1kb的調(diào)節(jié)區(qū)分別從3′末端和5′末端進(jìn)行BAL31消化，然后將產(chǎn)生的突變啟動(dòng)子片段與大腸桿菌LacZ基因融合，得到一系列載體。5′端的缺失產(chǎn)生了下列載體表1載體 AO啟動(dòng)子 缺失區(qū)域pSAOH5 -900→ATG nonepBAZ3 -709→ATG 5′191bppBAZ4 -499→ATG 5′401bppBAZ6 -372→ATG 5′528bppBAZ7 -216→ATG 5′684bppBAZ8 -197→ATG 5′703bp載體pSAOH5(見圖2)代表完整的5′-乙醇氧化酶調(diào)節(jié)區(qū)，而載體pBAZ3，4，6，7和8則代表5′端缺失。將這些含有各種調(diào)節(jié)區(qū)一結(jié)構(gòu)基因(lacZ)構(gòu)建物的載體轉(zhuǎn)化一種巴斯德畢赤酵母營養(yǎng)突變體，然后當(dāng)其在作為碳源和能源的甲醇或葡萄糖上生長時(shí)，檢測β-半乳糖苷酶的產(chǎn)生。而β-半乳糖苷酶表達(dá)結(jié)果的詳細(xì)分析見實(shí)施例，其結(jié)果總結(jié)如下(a)在ATG起始密碼子上游的709堿基對與499堿基對之間存在一個(gè)弱的甲醇應(yīng)答區(qū)，該密碼子是用于含有這些序列的自主載體的，而整合載體的完全甲醇應(yīng)答不需要上游709至499堿基對的序列。因此，盡管對于整合和自主載體來說，具有0-709核苷酸序列得到了完全用醇誘導(dǎo)，而帶有乙醇氧化酶ATG上游的0-499堿基對，則自主載體僅顯示約為50%的甲醇誘導(dǎo)。由自主載體表達(dá)的完全誘導(dǎo)所需要的709個(gè)堿基對序列如下所示
序列A5′-GCTACTAACA CCATGACTTT ATTAGCCTGT CTATCCTGGCCCCCCTGGCG AGGTCATGTT TGTTTATTTC CGAATGCAACAAGCTCCGCA TTACACCCGA ACATCACTCC AGATGAGGGCTTTCTGAGTG TGGGGTCAAA TAGTTTCATG TTCCCAAATGGCCCAAAACT GACAGTTTAA ACGCTGTCTT GGAACCTAATATGACAAAAG CGTGATCTCA TCCAAGATGA ACTAAGTTTGGTTCGTTGAA ATGCTAACGG CCAGTTGGTC AAAAAGAAACTTCCAAAAGT CGCCATACCG TTTGTCTTGT TTGGTATTGATTGACGAATG CTCAAAAATA ATCTCATTAA TGCTTAGCGCAGTCTCTCTA TCGCTTCTGA ACCCGGTGGC ACCTGTGCCGAAACGCAAAT GGGGAAACAA CCCGCTTTTT GGATGATTATGCATTGTCCT CCACATTGTA TGCTTCCAAG ATTCTGGTGGGAATACTGCT GATAGCCTAA CGTTCATGAT CAAAATTTAACTGTTCTAAC CCCTACTTGG ACAGGCAATA TATAAACAGAAGGAAGCTGC CCTGTCTTAA ACCTTTTTTT TTATCATCATTATTAGCTTA CTTTCATAAT TGCGACTGGT TCCAATTGACAAGCTTTTGA TTTTAACGAC TTTTAACGAC AACTTGAGAAGATCAAAAAA CAACTAATTA TTCGAAACG-3′.
帶有象ATG上游的第一個(gè)197個(gè)這樣少的核苷酸至少觀察到微小的甲醇誘導(dǎo)。
(b)在起始密碼子ATG上游的約372和197堿基對之間存在一個(gè)強(qiáng)的甲醇應(yīng)答區(qū)。而在起始密碼子ATG上游的372和216堿基對之間存在一個(gè)葡萄糖應(yīng)答區(qū)。通過附加實(shí)驗(yàn)(其詳性見實(shí)施例)，已表明這一片段具有一上游激活劑序列(UAS)的性質(zhì)，即它可賦予下游異源啟動(dòng)子序列具有通過甲醇的存在而被誘導(dǎo)和/或通過一種分解代謝產(chǎn)物抑制碳源如葡萄糖的存在而被抑制。這種UAS片段的序列如下序列B5′-ATA ATCTCATTAA TGCTTAGCGCAGTCTCTCTA TCGCTTCTGA ACCCGGTGGC ACCTGTGCCGAAACGCAAAT GGGGAAACAA CCCGCTTTTT GGATGATTATGCATTGTCCT CCACATTGTA TGCTTCCAAG ATTCTGGTGGGAATACTGCT GATAGCCTAA CGTTCATGAT CAA-3′從5′-AOXI啟動(dòng)子的3′末端制備一系列缺失，然后依次克隆進(jìn)5′缺失載體pBAZ6和pBAZ8中，得到的載體序列列于表Ⅱ表Ⅱ載體 缺失pBAZ801 -264→197pBAZ802 -347→197pBAZ803 -445→197pBAZ805 -532→197pBAZ804 -694→197pBAZ604 -445→372pBAZ601 -532→372pBAZ603 -542→372pBAZ602 -694→372表Ⅱ中所列的一套載體在與AOXI的ATG起始密碼子相關(guān)的694和197堿基位置之間含有可變的內(nèi)部缺失?？偨Y(jié)于表Ⅱ的載體所含有的啟動(dòng)子序列的5′部分是從乙醇氧化酶調(diào)節(jié)區(qū)的3′末端缺失得到的，而總結(jié)于表Ⅱ的載體所含有的調(diào)節(jié)區(qū)的3′部分是從乙醇氧化酶調(diào)節(jié)區(qū)、pBAZ6和pBAZ8的5′末端缺失得到的。如同前面一樣，用這種調(diào)節(jié)區(qū)-β-半乳糖苷酶結(jié)構(gòu)基因構(gòu)建物集合轉(zhuǎn)化一種巴斯德畢赤酵母營養(yǎng)突變株，然后，當(dāng)其在甲醇或葡萄糖上生長時(shí)，以檢測β-半乳糖苷酶的產(chǎn)生。檢測結(jié)果的詳細(xì)分析見實(shí)施例，其結(jié)果可概括如下在ATG起始密碼子上游的約260至370核苷酸之間的大約100個(gè)堿基對區(qū)域內(nèi)存在一個(gè)非常強(qiáng)的甲醇可誘導(dǎo)成分。另外，在ATG起始密碼子上游的約500至700核苷酸鹽區(qū)域也發(fā)現(xiàn)了一個(gè)較弱的甲醇可調(diào)節(jié)DNA片段。而且，在乙醇氧化酶ATG起始密碼子上游的從約350至375堿基對區(qū)域觀察到了一個(gè)葡萄糖可抑制區(qū)。這一葡萄糖可抑制區(qū)正好在甲醇可誘導(dǎo)區(qū)上游，且可能與甲醇應(yīng)答序列相重疊。
上述所鑒定的任一甲醇可誘導(dǎo)成分都可以單獨(dú)或以重組形式插入表達(dá)載體之中，而使甲醇誘導(dǎo)的基因能夠表達(dá)。
相反地，上面所鑒定的葡萄糖可抑制區(qū)可以從甲醇可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子成分中刪掉，這樣，當(dāng)將經(jīng)修飾的啟動(dòng)子用于表達(dá)載體且產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化體在葡萄糖存在的條件下生長時(shí)，就使得非抑制基因能夠表達(dá)。或者，可以將葡萄糖可抑制區(qū)特意包括在特殊設(shè)計(jì)的載體中，以便能夠迅速地控制基因表達(dá)的“開-關(guān)”。
按照本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明提供了一種控制被整合了的調(diào)節(jié)區(qū)的應(yīng)答的方法，它是在甲醇存在的條件下通過利用一種含有可變數(shù)目的堿基對的核苷酸序列作為調(diào)節(jié)區(qū)而完成的。這樣，當(dāng)使用最小值為下列197個(gè)堿基對時(shí)，得到了完全甲醇誘導(dǎo)的5%。
序列C5′-AAATTTAACTGTTCTAAC CCCTACTTGG ACAGGCAATA TATAAACAGAAGGAAGCTGC CCTGTCTTAA ACCTTTTTTT TTATCATCATTATTAGCTTA CTTTCATAAT TGCGACTGGT TCCAATTGACAAGCTTTTGA TTTTAACGAC TTTTAACGAC AACTTGAGAAGATCAAAAAA CAACTAATTA TTCGAAACG-3′.
當(dāng)所有下列增加序列都被使用時(shí)，對于被整合的表達(dá)載體觀察到了基本上完全的甲醇誘導(dǎo)序列D5′-ATA ATCTCATTAA TGCTTAGCGCAGTCTCTCTA TCGCTTCTGA ACCCGGTGGC ACCTGTGCCGAAACGCAAAT GGGGAAACAA CCCGCTTTTT GGATGATTATGCATTGTCCT CCACATTGTA TGCTTCCAAG ATTCTGGTGGGAATACTGCT GATAGCCTAA CGTTCATGAT CAA-3′甲醇誘導(dǎo)的近似程度與在被整合表達(dá)載體中所使用的調(diào)節(jié)區(qū)的大小的關(guān)系列于表Ⅲ表Ⅲ核苷酸序列 甲醇誘導(dǎo)(%)0-197 50-197加347-372 50-197加264-372 250-372 100與此相似，本發(fā)明也提供了一種控制自主調(diào)節(jié)區(qū)對于甲醇的存在進(jìn)行應(yīng)答的方法，它是通過使用至少含有上述序列C中所列的197個(gè)核苷酸的一段核苷酸序列作為調(diào)節(jié)區(qū)而完成的。如果要達(dá)到完全甲醇表達(dá)還需要下列補(bǔ)加序列序列E5′-GCTACTAACA CCATGACTTT ATTAGCCTGT CTATCCTGGCCCCCCTGGCG AGGTCATGTT TGTTTATTTC CGAATGCAACAAGCTCCGCA TTACACCCGA ACATCACTCC AGATGAGGGCTTTCTGAGTG TGGGGTCAAA TAGTTTCATG TTCCCAAATGGCCCAAAACT GACAGTTTAA ACGCTGTCTT GGAACCTAATATGACAAAAG CGTGATCTCA TCCAAGATGA ACTAAGTTTGGTTCGTTGAA ATGCTAACGG CCAGTTGGTC AAAAAGAAACTTCCAAAAGT CGCCATACCG TTTGTCTTGT TTGGTATTGATTGACGAATG CTCAAAAATA ATCTCATTAA TGCTTAGCGCAGTCTCTCTA TCGCTTCTGA ACCCGGTGGC ACCTGTGCCGAAACGCAAAT GGGGAAACAA CCCGCTTTTT GGATGATTATGCATTGTCCT CCACATTGTA TGCTTCCAAG ATTCTGGTGGGAATACTGCT GATAGCCTAA CGTTCATGAT CAA-3′.
甲醇誘導(dǎo)的近似程度與調(diào)節(jié)區(qū)的大小的關(guān)系見表Ⅳ表Ⅳ核苷酸序列 甲醇誘導(dǎo)(%)0-197 40-216 130-372 500-499 500-709 100按照本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，將序列B所示的上游激活劑序列(UAS)插入到通常對于葡萄糖和/或甲醇的存在不敏感的畢赤酵母序列的上游。當(dāng)其生長在葡萄糖上時(shí)，含有UAS的轉(zhuǎn)化體的基因產(chǎn)物(β-半乳糖苷酶)的表達(dá)被抑制要比不含UAS的構(gòu)建物，pBPf3I大400倍以上。生長于甲醇上時(shí)這一抑制減弱;β-半乳糖苷酶的產(chǎn)生水平要比在葡萄糖上轉(zhuǎn)化體的那些增加170倍以上。
表ⅤpBPf-3Ⅰ中的插入子 生長于甲醇與葡萄糖上時(shí)產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶的比值無 1.07-197至-372 174具體的轉(zhuǎn)化株，結(jié)果等在實(shí)施例中有詳細(xì)敘述。
根據(jù)以下非限定實(shí)例，現(xiàn)在對本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)地?cái)⑹觥?br>實(shí)例下面的實(shí)例中所用的緩沖液和溶液的組成如下SD平皿 2%瓊脂6.7不含氨基酸的酵母含氮堿基(DIFCO)重量百分比為2的葡萄糖溶于1升水中YNB肉汁培養(yǎng)基 6.7克不含氨基酸的酵母含氮堿基(DIFCO)溶于1升水中Z緩沖液 0.1M磷酸鈉，pH7.00.01M Kcl0.001M Mg SO40.039M β-巰基乙醇X-gal 指示劑平皿 2%瓊脂0.5%(體積)的甲醇
6.7克不含氨基酸的酵母含氮堿基(DIFCO)0.4毫克生物素40毫克X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)溶于1升水中，用磷酸二氫鉀(monobasic potassium phosphate將pH調(diào)至7-EGTA＝乙二醇-雙-(β-氨基乙基醚)-N，N，N′，N′-四-乙酸(Sigma公司)在下面的實(shí)施例中所用到的菌株可以從被承認(rèn)的保藏單位得到，登記號(hào)如下-細(xì)菌菌株JM103，HB101和MC1061通常均可得到-畢赤酵母GS115＝NRRL Y-15851-pSAOH5(轉(zhuǎn)化到GS115＝NRRL Y-15853;轉(zhuǎn)化到大腸桿菌＝NRRL B-15862)-pBPf3Ⅰ是從質(zhì)粒pBPf1得到的(登記號(hào)為NRRL B-15892)，它用到了下列各步序列將從pYJ8(登記號(hào)NRRL B-15889)得到的0.6kbp的EcoRⅠ-PvuⅡ片段(該片段含有畢赤酵母HIS4啟動(dòng)子序列)插進(jìn)pBPf1的EcoRⅠ-SmaⅠ位點(diǎn)。所合成的質(zhì)粒被稱為pBPf3。用PstⅠ和NruⅠ降解質(zhì)粒pBPf3以釋放出含有l(wèi)acZ序列的片段。將該片段與pYM4的PstⅠ-EcoRV片段連接，以產(chǎn)生質(zhì)粒pBPf3Ⅰ，其中pYM4含有插入到pBP322的BamHⅠ位點(diǎn)的pYJ8的BglⅡ片段，而BglⅡ片段又含有HIS4，見圖4所示。
-pPG2.5(可從等于NRRL B-15868的pPG4.0得到，詳情見下)實(shí)例1AOXI啟動(dòng)子的5′-末端缺失的構(gòu)建用EcoRⅠ將30毫克質(zhì)粒pSAOH5(圖2)完全降解，苯酚抽提，及乙醇沉淀。將得到的干DNA沉淀溶于水(最終反應(yīng)體積＝100微升)，然后于23℃用1.2單位的BAL31降解。每隔3分鐘，取10微升到10微升40m MEGTA中，然后用苯酚抽提及乙醇沉淀。
從每一部分得到的重新溶解的DNA沉淀用1單位的Klenow DNA多聚酶進(jìn)行處理以增強(qiáng)平末端，然后連接到EcoRⅠ連接子(5′-GGAATTCC-3′)上，再用PstⅠ和EcoRⅠ完全降解以釋放大約9.0kbp的載體片段。然后將PstⅠ-EcoRⅠ所降解的DNA連接到來自pBR2的750bp的PstⅠ-EcoRⅠ片段上，以便再次生出β-內(nèi)酰胺酶基因。將連接的DNA轉(zhuǎn)化進(jìn)JM103，篩選出氨芐青霉素抗性的轉(zhuǎn)化株。挑選從每一BAL31降解的pSAOH5的等分試樣得到的并且在x-gal指示劑平皿上檢測對β-半乳糖苷酶陽性的單個(gè)轉(zhuǎn)化株，用微量DNA制備方法檢測在AOXI啟動(dòng)子中含有新的EcoRⅠ限制性位點(diǎn)的質(zhì)粒的存在。用EcoRⅠ和EcoRV進(jìn)行完全降解(見圖2)就能夠鑒定含有融合進(jìn)大腸桿菌lac Z基因中的各種長度的AOXI啟動(dòng)子的克隆。這些克隆的名稱如下表1載體 AO啟動(dòng)子 缺失區(qū)pSAOH5 -900→ATG nonepBAZ3 -709→ATG 5′191bppBAZ4 -499→ATG 5′401bppBAZ6 -372→ATG 5′528bppBAZ7 -216→ATG 5′684bppBAZ8 -197→ATG 5′703bp
然后按照公布過的方法(Cregg等，Molecular and Cellular Biology 5，3376-3385(1985))，用含有這些縮短了的AOXI啟動(dòng)子序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化巴斯畢赤酵母菌株GS115，篩選出Hi S表型的轉(zhuǎn)化株。使Hi S轉(zhuǎn)化株生長于各種碳源上，并且檢測β-半乳糖苷酶的產(chǎn)生(見表Ⅵ)。
表Ⅵβ-半乳糖苷酶，單位/OD600自主載體載體 缺失 生長于葡萄糖 生長于甲醇pSAOH5 None 1 1000pBAZ3 5′(191bp) 1 1000pBAZ4 5′(401bp) 1 500pBAZ6 5′(528bp) 1 500pBAZ7 5′(684bp) 15 150pBAZ8 5′(703bp) 15 40基于該項(xiàng)說明，即pBAz6含有甲醇可誘導(dǎo)的-葡萄糖可抑制的序列的大部分，而pBAz8大都缺失了這些應(yīng)答區(qū)，選擇質(zhì)粒pBAz6和pBAz8用于進(jìn)一步的研究。
實(shí)例ⅡAOXI啟動(dòng)子的3′-末端缺失的構(gòu)建用BamHⅠ將18毫克的質(zhì)粒pPG2.5(在pBR322基礎(chǔ)上構(gòu)建的質(zhì)粒，它含有pPG4.0的大約2.5kbp的EcoRⅠ-SalⅠ片段，如圖3所示)完全降解苯酚抽提及乙醇沉淀。用1.2單位的BAL31在23℃下消化溶解的DNA沉淀(最終反應(yīng)體積＝100μl)，每隔3分鐘取10微升的等分試樣到10微升40mM EGTA中，然后用苯酚抽提和乙醇沉淀。
用1個(gè)單位的Klenow DNA多聚酶處理重新溶解的每一等分試樣中的DNA沉淀，增強(qiáng)平末端，連接到EcoRⅠ連接子上，用來轉(zhuǎn)化氨芐基青霉素抗性大腸桿菌HB101菌株，從每-BAL31降解的pPG2.5的等分試樣挑選出單個(gè)轉(zhuǎn)化株，用微DNA制備方法檢測在AOXI啟動(dòng)子中含有新的EcoRⅠ限制性酶切位點(diǎn)的質(zhì)粒的存在。
分離出在AOXI的啟動(dòng)子中的AOXIATG上游的264，347，445，532，542和694核苷酸位置含有新的EcoRⅠ限制性酶切位點(diǎn)的質(zhì)粒，且分別定名為pPG2.5△4，△5，△7，△10，△12和△11，然后用EcoRⅠ降解。這些降解分別產(chǎn)生出大約1186，1103，1005，918，908和756個(gè)堿基對的新的EcoRⅠ片段。分離并乙醇沉淀所形成的EcoRⅠ片段，該片段含有后來插到BAL31誘變中并定位在EcoRⅠ連接子上游的AOXI啟動(dòng)子的部分。
實(shí)例Ⅲ用lacz融合質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的畢赤酵母的生長挑選一個(gè)轉(zhuǎn)化菌落，劃線接種于SD平皿。將通過劃線得到的一個(gè)單菌落接種于50毫升的搖瓶中，其中含有15毫升YNB肉汁培養(yǎng)基和2%甘油。于30℃以250rpm的速度搖動(dòng)過夜。培養(yǎng)24小時(shí)后的OD600在2至3之間。
為了在YNB一甲醇中生長，從搖瓶中取出10D600的培養(yǎng)物，在IEC離心機(jī)上以2000×g的轉(zhuǎn)速于室溫下離心7分鐘。沉淀了的細(xì)胞用無菌水洗一次，然后再懸浮在含有20毫升YNB肉汁培養(yǎng)基和0.5%甲醇的50毫升搖瓶中(OD600＝0.05)。將培養(yǎng)物于30℃以250rpm的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)16-20小時(shí)，在此期間OD600在0.3-0.5之間。
為了在YNB-葡萄糖中生長，從甘油搖瓶中取出0.2OD600的培養(yǎng)物，直接接種到含有20毫升YNB肉汁培養(yǎng)基和2%葡萄糖的50毫升搖瓶中(OD600＝0.01)。培養(yǎng)物于30℃以250rpm的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)16-20小時(shí)，在此期間OD600在0.3-0.5之間。
實(shí)例Ⅳ生長于葡萄糖或甲醇培養(yǎng)基上的畢赤酵母的β-半乳糖苷酶的檢測為了檢測在甲醇上生長的細(xì)胞，取出對應(yīng)OD600＝0.1的-體積的培養(yǎng)物，在DYNAC臨床離心機(jī)上以最高轉(zhuǎn)速(3350rpm)于室溫下離心5分鐘。為了檢測在葡萄糖上生長的細(xì)胞，取出對應(yīng)OD600＝0.5的-體積的培養(yǎng)物，同上一樣離心。
細(xì)胞沉淀用水洗滌一次，重新懸浮于1毫升的Z緩沖液中。得到的懸浮液與30微升CHCl和30微升0.1%的SDS混合，旋轉(zhuǎn)攪拌，然后在30℃保溫5分鐘。
反應(yīng)是通過加進(jìn)200微升預(yù)熱的0-硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(4毫克/毫升)(SIGMA公司)而開始的，旋轉(zhuǎn)攪拌混合。反應(yīng)保溫2-20分鐘，直至出現(xiàn)可見的黃色。然后加入0.5毫升的1.0M Na Co溶液以終止反應(yīng)，沉淀細(xì)胞，測定懸浮液的OD420。β-半乳糖苷酶的單位是按下列公式計(jì)算的1個(gè)單位＝ ((378)(A420))/(保溫時(shí)間)實(shí)例ⅤA、自主質(zhì)粒pBAZ801-805和pBAZ601-604的構(gòu)建用EcoRⅠ將質(zhì)粒pBAZ6和pBAZ8完全降解，然后連接到在上面的實(shí)例Ⅱ中分離到的EcoRⅠ片段上，用它來轉(zhuǎn)化氨芐青霉素抗性大腸桿菌HB101菌株。用微量DNA制備方法對轉(zhuǎn)化株進(jìn)行新的EcoRⅠ片段的存在的分析，然后用PstⅠ降解，以確認(rèn)片段在質(zhì)粒中的定位，它與pPG2.5的相對應(yīng)。在適當(dāng)?shù)奈恢煤蠩coRⅠ片段的pBAZ8和pBAZ6的連接產(chǎn)物的質(zhì)粒名稱列于下表。
表Ⅶ載體 EcoRⅠ片段大小 缺失pBAZ 801 1186 -264→197802 1103 -347→197803 1005 -445→197805 918 -532→197804 756 -694→197604 1005 -445→372601 918 -532→372603 908 -542→372602 756 -694→372將這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)巴斯德畢赤酵母GS115菌株;HiS+轉(zhuǎn)化株生長于YNB-葡萄糖或YNB-甲醇培養(yǎng)基上，測定β-半乳糖苷酶。測定結(jié)果見表Ⅷ。
表Ⅷβ-半乳糖苷酶，單位/OD600自主載體載體 缺失 生長于葡萄糖 生長于甲醇pSAOH5 無 1 1000pBAZ801 197-264 3 500pBAZ802 197-347 1 150pBAZ803 197-445 1 140pBAZ805 197-532 1 150pBAZ804 197-694 10 100pBAZ604 372-445 1 1000pBAZ601 372-532 1 500pBAZ603 372-542 1 800pBAZ602 372-694 1 600鑒于這樣一個(gè)觀察結(jié)果，即在pBAZ801中的缺失比野生型減少了50%的表達(dá)而在pBAZ802中的缺失比野生型只減少了15%的表達(dá)，我們得出如下結(jié)論在-372至-197序列的-264至-197之間有一弱的甲醇應(yīng)答區(qū)。而且，葡萄糖抑制序列的有效范圍位于-347上游。
B.整合質(zhì)粒pBAZ801 Ⅰ-805Ⅰ和pBAZ601 Ⅰ-604Ⅰ的構(gòu)建用BglⅡ降解質(zhì)粒pBAZ6和pBAZ8，再用Klenow DNA多聚酶處理以破壞BglⅡ位點(diǎn)，用連接酶環(huán)化后用其轉(zhuǎn)化氨芐青酶素抗性大腸桿菌HB101菌株，所得質(zhì)粒pBAZ6△BglⅡpBAZ8△BglⅡ用EcoRⅠ完全降解，然后連接到實(shí)例Ⅱ中分離到的EcoRⅠ片段上且轉(zhuǎn)化氨芐青酶素抗性大腸桿菌HB101菌株，用微量DNA制備方法對轉(zhuǎn)化株進(jìn)行新的EcoRⅠ片段存在的分析，然后用PstⅠ消化以確認(rèn)該片段在與pPG2.5的相對應(yīng)的質(zhì)粒中的定位。
在適當(dāng)位置含有EcoRⅠ片段的pBAZ8△BglⅡ和pBAZ6△BglⅡ的連接產(chǎn)物的質(zhì)粒命名列于表Ⅸ。
表Ⅸ載體 EcoRⅠ片段大小 缺失pBAZ 801Ⅰ 1186 -264→197802Ⅰ 1103 -347→197803Ⅰ 1005 -445→197805Ⅰ 918 -532→197804Ⅰ 756 -694→197604Ⅰ 1005 -445→372601Ⅰ 918 -532→372603Ⅰ 908 -542→372602Ⅰ 756 -694→372用BglⅡ降解質(zhì)粒以把它們對活性AOXI座位，且轉(zhuǎn)化進(jìn)畢赤酵母GS115菌株。分離出穩(wěn)定的Hi S+轉(zhuǎn)化株，它生長于YNB-葡萄糖或YNB-甲醇培養(yǎng)基中。然后檢測β-半乳糖苷酶。表Ⅹ給出了檢測結(jié)果。
表Ⅹβ-半乳糖苷酶，單位/OD600自主載體載體 缺失 生長于葡萄糖 生長于甲醇pSAOH5 無 1 320pBAZ801Ⅰ 197-264 1 73pBAZ802Ⅰ 197-347 1 19pBAZ803Ⅰ 197-445 1 30pBAZ805Ⅰ 197-532 1 20pBAZ804Ⅰ 197-694 ND NDpBAZ604Ⅰ 372-445 1 290pBAZ601Ⅰ 372-532 1 300pBAZ603Ⅰ 372-542 0 250pBAZ602Ⅰ 372-694 1 320從整合行為的穩(wěn)定性可以得出結(jié)論-372上游的序列對于整合載體的甲醇誘導(dǎo)是不需要的，因?yàn)閜BAZ602Ⅰ產(chǎn)生了野生型水平的β-半乳糖苷酶。另外，這一結(jié)果還證實(shí)了在-347至-264以及-264至-197之間分別有一強(qiáng)的和弱的甲醇應(yīng)答區(qū)。
實(shí)例Ⅵ為了便于比較，表Ⅺ一起給出了β-半乳糖苷酶與各種5′缺失和內(nèi)部缺失表達(dá)盒以自主及整合的形式存在的表達(dá)結(jié)果。
表Ⅺβ-半乳糖苷酶，單位/OD600自主載體 整合載體載體 缺失 生長于 生長于 生長于 生長于葡萄糖 甲醇 葡萄糖 甲醇pSAOH5 無 1 1000 1 320pBAZ3 5′(191bp) 1 1000pBAZ4 5′(401bp) 1 500pBAZ6 5′(528bp) 1 500pBAZ7 5′(684bp) 15 150pBAZ8 5′(703bp) 15 40pBAZ801，801Ⅰ 197-264 3 500 1 73pBAZ802，802Ⅰ 197-347 1 150 1 19pBAZ803，803Ⅰ 197-445 1 140 1 30pBAZ805，805Ⅰ 197-532 1 150 1 20pBAZ804，804Ⅰ 197-694 10 100 ND NDpBAZ604，604Ⅰ 372-445 1 1000 1 290pBAZ601，601Ⅰ 372-532 1 500 1 300pBAZ603，603Ⅰ 372-542 1 800 0 250pBAZ602，602Ⅰ 372 694 1 600 1 320這些載體的每一種衍生物在圖5中以圖解的形式進(jìn)行了總結(jié)。
實(shí)例ⅦpAHZ1的構(gòu)建質(zhì)粒pBAZ6用EcoRⅠ進(jìn)行降解，再連接到EcoRⅠ-BglⅡ人工合成接頭上(5′-AATTAGATCT-3′)，用BclⅡ和BglⅠ完全降解。分離出新得到的含有AOXⅠ UAS的大約180bp的片段，將其它連接到pBBf3Ⅰ(圖4)的唯一BglⅡ位點(diǎn)上，所得到的連接產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化氨芐青霉素抗性大腸桿菌MC1061菌株上。通過用BamHⅠ降解而鑒定出含有帶有單個(gè)UAS插入子的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化株;這種質(zhì)粒命名為pAHZ1。
用StuⅠ降解質(zhì)粒pAHZ1，然后用于轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115菌株;分離出在YNB-葡萄糖和YNB-甲醇培養(yǎng)基上生長的穩(wěn)定的HIS+轉(zhuǎn)化株。這一分析的結(jié)果如下表Ⅶβ-半乳糖苷酶，單位/OD600質(zhì)粒 生長于葡萄糖上 生長于甲醇上pBPf3Ⅰ 49.8 53.5pAHZ1 0.1 17.4這些數(shù)據(jù)表明在BglⅡ-Bcl IDNA片段上的AOXI啟動(dòng)子的-372至-197之間所含的175個(gè)堿基對對于為畢赤酵母HIS4基因啟動(dòng)子序列提供甲醇誘導(dǎo)和葡萄糖阻遇不僅是必需的而且是足夠的，因此把這一區(qū)段稱為含上游激活劑序列的區(qū)段。
以上這些實(shí)施例僅僅是用來本發(fā)明的實(shí)施，而不應(yīng)該把它看成是對本發(fā)明的范圍或所附權(quán)項(xiàng)在任何方面的限制。在不離開本發(fā)明的本質(zhì)的前提下的適當(dāng)變化和改進(jìn)都包括在本發(fā)明所要求的專利保護(hù)的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種與培養(yǎng)基中的甲醇的存在相應(yīng)答的DNA片段，這種培養(yǎng)基是用于帶有該片段的宿主所生長的；其中所說的片段是作為一種自主成分存在于所述宿主中；且所說片段至少由下列核苷酸序列及其功能等價(jià)物組成5′-GCTACTAACA CCATGACTTT ATTAGCCTGT CTATCCTGGCCCCCCTGGCG AGGTCATGTT TGTTTATTTC CGAATGCAACAAGCTCCGCA TTACACCCGA ACATCACTCC AGATGAGGGCTTTCTGAGTG TGGGGTCAAA TAGTTTCATG TTCCCAAATGGCCCAAAACT GACAGTTTAA ACGCTGTCTT GGAACCTAATATGACAAAAG CGTGATCTCA TCCAAGATGA ACTAAGTTTGGTTCGTTGAA ATGCTAACGG CCAGTTGGTC AAAAAGAAACTTCCAAAAGT CGCCATACCG TTTGTCTTGT TTGGTATTGATTGACGAATG CTCAAAAATA ATCTCATTAA TGCTTAGCGCAGTCTCTCTA TCGCTTCTGA ACCCGGTGGC ACCTGTGCCGAAACGCAAAT GGGGAAACAA CCCGCTTTTT GGATGATTATGCATTGTCCT CCACATTGTA TGCTTCCAAG ATTCTGGTGGGAATACTGCT GATAGCCTAA CGTTCATGAT CAAAATTTAACTGTTCTAAC CCCTACTTGG ACAGGCAATA TATAAACAGAAGGAAGCTGC CCTGTCTTAA ACCTTTTTTT TTATCATCATTATTAGCTTA CTTTCATAAT TGCGACTGGT TCCAATTGACAAGCTTTTGA TTTTAACGAC TTTTAACGAC AACTTGAGAAGATCAAAAAA CAACTAATTA TTCGAAACG-31
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的DNA片段，其進(jìn)一步包括一個(gè)多肽編碼區(qū)，其中上述的調(diào)節(jié)區(qū)位于該多肽編碼區(qū)的5′末端。
3.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的DNA片段，它進(jìn)一步包括多肽編碼區(qū)DNA下游的3′序列;其中所說的DNA的3′序列能夠控制所說多肽編碼區(qū)所編碼的mRNA的多聚腺苷酸化、轉(zhuǎn)錄終止和翻譯終止。
4.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的DNA片段，其中所說的DNA片段進(jìn)一步包括一個(gè)或多個(gè)附加DNA序列，這些DNA序列是從由細(xì)菌質(zhì)粒DNA、噬菌體DNA、酵母質(zhì)粒DNA和酵母染色體DNA組成的一組DNA中得到的。
5.依照權(quán)利要求
4所述的DNA片段，其中所說的酵母染色體DNA包括一個(gè)自主復(fù)制DNA序列和一個(gè)標(biāo)記基因。
6.依據(jù)權(quán)利要求
5所述的DNA片段，其中所說的片段是以閉合環(huán)狀雜種質(zhì)粒的形式存在。
7.一個(gè)被轉(zhuǎn)化了的酵母菌株，其中所說的酵母菌株是權(quán)利要求
2所述的DNA片段的宿主。
8.一個(gè)被轉(zhuǎn)化了的酵母菌株，其中所說的酵母菌株是權(quán)利要求
3所述的DNA片段的宿主。
9.一個(gè)被轉(zhuǎn)化了的酵母菌株，其中所說的酵母菌株是權(quán)利要求
6所述的DNA片段的宿主。
10.一個(gè)與培養(yǎng)基中的甲醇的存在相應(yīng)答的DNA片段，該培養(yǎng)基是用于帶有該片段的宿主所生長的;其中所說的片段被整合進(jìn)所說的宿主的基因組中，且其中所說的片段至少包括下列核苷酸序列及其功能等價(jià)物5′-ATA ATCTCATTAA TGCTTAGCGCAGTCTCTCTA TCGCTTCTGA ACCCGGTGGC ACCTGTGCCGAAACGCAAAT GGGGAAACAA CCCGCTTTTT GGATGATTATGCATTGTCCT CCACATTGTA TGCTTCCAAG ATTCTGGTGGGAATACTGCT GATAGCCTAA CGTTCATGAT CAAAATTTAACTGTTCTAAC CCCTACTTGG ACAGGCAATA TATAAACAGAAGGAAGCTGC CCTGTCTTAA ACCTTTTTTT TTATCATCATTATTAGCTTA CTTTCATAAT TGCGACTGGT TCCAATTGACAAGCTTTTGA TTTTAACGAC TTTTAACGAC AACTTGAGAAGATCAAAAAA CAACTAATTA TTCGAAACG-3′
11.根據(jù)權(quán)利要求
10所述的DNA片段，它進(jìn)一步包括一個(gè)多肽編碼區(qū);其中調(diào)節(jié)區(qū)位于該多肽編碼區(qū)的5′末端。
12.根據(jù)權(quán)利要求
11所述的DNA片段，它進(jìn)一步包括多肽編碼區(qū)的下游DNA的3′端序列;其中所說的DNA的3′序列能夠控制由所說多肽編碼區(qū)所編碼的mRNA的多聚腺苷酸化、轉(zhuǎn)錄終止及翻譯終止。
13.根據(jù)權(quán)利要求
11所述的DNA片段，其中所說的DNA片段進(jìn)一步包括一個(gè)或多個(gè)的附加DNA序列，這些DNA序列是從由細(xì)菌質(zhì)粒DNA、噬菌體DNA、酵母質(zhì)粒DNA和酵母染色體DNA組成的一組DNA中得到的。
14.根據(jù)權(quán)利要求
13所述的DNA片段，其中所說的酵母染色體DNA包括一個(gè)標(biāo)記基因。
15.根據(jù)權(quán)利要求
13如述的DNA片段，其中所述的酵母染色體DNA包括一個(gè)自主復(fù)制的DNA序列。
16.依照權(quán)利要求
13所述的DNA片段，其中所述片段在整合到宿主基因組上之前是以閉合環(huán)狀雜種質(zhì)粒的形式存在。
17.根據(jù)權(quán)利要求
13所述的DNA片段，其中所述片段是一線型片段。
18.一個(gè)被轉(zhuǎn)化了的酵母菌株，其中所說的酵母菌株是權(quán)利要求
11的DNA片段的宿主。
19.一個(gè)被轉(zhuǎn)化了的酵母菌株，其中所說的酵母菌株是權(quán)利要求
12的DNA片段的宿主。
20.一個(gè)被轉(zhuǎn)化了的酵母菌株，其中所說的酵母菌株是權(quán)利要求
17的DNA片段的宿主。
21.一個(gè)具有上游激活劑序列性質(zhì)的DNA片段，其中所述片段給位于下游的異源啟動(dòng)子核苷酸序列提供了這樣一種能力，即在甲醇存在的條件下被誘導(dǎo)而在分解代謝抑制碳源存在的條件下被抑制，且其中所述片段至少包括下列核苷酸序列及其功能等價(jià)物5′-ATA ATCTCATTAA TGCTTAGCGCAGTCTCTCTA TCGCTTCTGA ACCCGGTGGC ACCTGTGCCGAAACGCAAAT GGGGAAACAA CCCGCTTTTT GGATGATTATGCATTGTCCT CCACATTGTA TGCTTCCAAG ATTCTGGTGGGAATACTGCT GATAGCCTAA CGTTCATGAT CAA-3′
22.根據(jù)權(quán)利要求
21所述的DNA片段，它進(jìn)一步包括一多肽編碼區(qū);其中所指的調(diào)節(jié)區(qū)位于該多肽編碼區(qū)的5′末端。
23.根據(jù)權(quán)利要求
22所述的DNA片段，進(jìn)一步包括多肽編碼區(qū)的下游的DNA3′序列;其中所說的DNA3′序列能夠控制由所述多肽編碼區(qū)所編碼的mRNA的多聚腺苷酸代、轉(zhuǎn)錄終止及翻譯終止。
24.根據(jù)權(quán)利要求
22所述的DNA片段，其中所述的DNA片段進(jìn)一步包括一個(gè)或多個(gè)附加DNA序列，該序列是從由細(xì)菌質(zhì)粒DNA、噬菌體DNA，酵母質(zhì)粒DNA和酵母染色體DNA組成的一組DNA中得到的。
25.根據(jù)權(quán)利要求
24所述的DNA片段，其中所述的酵母染色體DNA包括一個(gè)標(biāo)記基因。
26.根據(jù)權(quán)利要求
24所述的DNA片段，其中所述的酵母染色體DNA包括一個(gè)自主復(fù)制的序列。
27.根據(jù)權(quán)利要求
24所述的DNA片段，其中所述片段在被整合進(jìn)宿主基因組之前是以閉合環(huán)狀雜種質(zhì)粒的形式存在。
28.根據(jù)權(quán)利要求
24所述的DNA片段，其中所述的片段是一線型片段。
29.一個(gè)被轉(zhuǎn)化了的酵母菌株，其中所說的酵母菌株是權(quán)利要求
22的DNA片段的宿主。
30.一個(gè)被轉(zhuǎn)化了的酵母菌株，其中所說的酵母菌株是權(quán)利要求
23的DNA片段的宿主。
31.一個(gè)被轉(zhuǎn)化了的酵母菌株，其中所說的酵母菌株是權(quán)利要求
28的DNA片段的宿主。
32.一種控制被整合了的調(diào)節(jié)區(qū)對于甲醇的存在作出應(yīng)答的方法，它包括使用至少下列核苷酸序列作為與甲醇相應(yīng)答的調(diào)節(jié)區(qū)，該調(diào)節(jié)區(qū)位于被表達(dá)的編碼序列的上游5′-AATTTAACTGTTCTAAC CCCTACTTGG ACAGGCAATA TATAAACAGAAGGAAGCTGC CCTGTCTTAA ACCTTTTTTT TTATCATCATTATTAGCTTA CTTTCATAAT TGCGACTGGT TCCAATTGACAAGCTTTTGA TTTTAACGAC TTTTAACGAC AACTTGAGAAGATCAAAAAA CAACTAATTA TTCGAAACG-3′以便得到微小甲醇應(yīng)答;且為了得到更高水平的甲醇應(yīng)答，增加包括下列的上游核苷酸5′-ATA ATCTCATTAA TGCTTAGCGCAGTCTCTCTA TCGCTTCTGA ACCCGGTGGC ACCTGTGCCGAAACGCAAAT GGGGAAACAA CCCGCTTTTT GGATGATTATGCATTGTCCT CCACATTGTA TGCTTCCAAG ATTCTGGTGGGAATACTGCT GATAGCCTAA CGTTCATGAT CAA-3′其中最大程度的甲醇應(yīng)答是通過使用上面所列舉的所有核苷酸而得到的，且按照下面的應(yīng)答表得到了不同程度的甲醇應(yīng)答，它使用的是得自后一序列的中間數(shù)目的核苷酸核苷酸序列 甲醇誘導(dǎo)0-197 50-197加347-372 50-197加264-372 250-372 100
33.一種控制自主調(diào)節(jié)區(qū)對于甲醇的存在作出應(yīng)答的方法，它包括使用至少下列核苷酸作為調(diào)節(jié)區(qū)以達(dá)到微小的甲醇應(yīng)答5′-AATTTAACTGTTCTAAC CCCTACTTGG ACAGGCAATA TATAAACAGAAGGAAGCTGC CCTGTCTTAA ACCTTTTTTT TTATCATCATTATTAGCTTA CTTTCATAAT TGCGACTGGT TCCAATTGACAAGCTTTTGA TTTTAACGAC TTTTAACGAC AACTTGAGAAGATCAAAAAA CAACTAATTA TTCGAAACG-3′為了獲得更高水平的甲醇應(yīng)答，增加包括下列上游核苷酸5′-AGATCTAA CATCCAAAGACGAAAGGTTG AATGAAACCT TTTTGCCATC CGACATCCACAGGTCCATTC TCACACATAA GTGCCAAACG CAACAGGAGGGGATACACTA GCAGCAGACG TTGCAAACGC AGGACTCATCCTCTTCTCTA ACACCATTTT GCATGAAAAC AGCCAGTATTGGGCTTGATG GAGCTCGCTC ATTCCAATTC CTTCTATTAGGCTACTAACA CCATGACTTT ATTAGCCTGT CTATCCTGGCCCCCCTGGCG AGGTCATGTT TGTTTATTTC CGAATGCAACAAGCTCCGCA TTACACCCGA ACATCACTCC AGATGAGGGCTTTCTGAGTG TGGGGTCAAA TAGTTTCATG TTCCCAAATGGCCCAAAACT GACAGTTTAA ACGCTGTCTT GGAACCTAATATGACAAAAG CGTGATCTCA TCCAAGATGA ACTAAGTTTGGTTCGTTGAA ATGCTAACGG CCAGTTGGTC AAAAAGAAACTTCCAAAAGT CGCCATACCG TTTGTCTTGT TTGGTATTGATTGACGAATG CTCAAAAATA ATCTCATTAA TGCTTAGCGCAGTCTCTCTA TCGCTTCTGA ACCCGGTGGC ACCTGTGCCGAAACGCAAAT GGGGAAACAA CCCGCTTTTT GGATGATTATGCATTGTCCT CCACATTGTA TGCTTCCAAG ATTCTGGTGGGAATACTGCT GATAGCCTAA CGTTCATGAT CAA-3′其中最大程度的甲醇應(yīng)答是通過使用上述所有列舉核苷酸而得到的，按照下列表格，通過使用得自后一序列的中間數(shù)目的核苷酸，得到了各種不同程度的甲醇應(yīng)答核苷酸序列 甲醇誘導(dǎo)0-197 40-216 130-372 500-499 500-709 100
專利摘要
本發(fā)明公開了一種新型的與甲醇和/或分解代謝產(chǎn)物抑制碳源的存在相應(yīng)答的DNA片段及其調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)表達(dá)的方法。
文檔編號(hào)C12R1/84GK87101797SQ87101797
公開日1987年10月21日 申請日期1987年3月10日
發(fā)明者理查德·哥爾登·布克霍爾茨 申請人:菲利普石油公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan