專利名稱:生物表面活性劑的制備方法
本發(fā)明是一種生物工程。
用微生物來生產(chǎn)表面活性劑是七十年代后期國際生物工程領(lǐng)域中發(fā)展起來的一個新課題。微生物在代謝過程中常分泌一些生化產(chǎn)物。其分子結(jié)構(gòu)具有親水和疏水兩種組分，如糖脂類，磷脂類及脂蛋白類等。生物表面活性劑具有乳化、破乳、潤濕、增溶、發(fā)泡、消泡、抗靜電、抗腐蝕等功能，因此應(yīng)用范圍甚廣，可應(yīng)用于石油三次開采，消除石油污染及日化、食品和紡織工業(yè)等方面。
根據(jù)現(xiàn)在研究情況來看，糖脂是最主要的一類生物表面活性劑。日本花王石堿株式會社用球擬酵母(Torulopsis SP)生產(chǎn)槐糖脂(特許公報昭57-92785，92786)，日本S.Itoh實驗室用假單孢菌(Pseudomonas SP)生產(chǎn)鼠李糖脂(J.Anti biotics 23，855，1971)，西德Wagner實驗室用紅球菌(Rhod-ococcus erythropolis)生產(chǎn)海藻糖單脂及海藻糖二脂(Ger Pat DE-2646505，DE-2646506.DE-2646507)，其中海藻糖脂有良好的表面活性性能，可用于石油三次開采等方面。但上述專利中糖脂的產(chǎn)量僅5-10克/升。
為了使糖脂達到工業(yè)化生產(chǎn)水平，必須改進培養(yǎng)方法，提高產(chǎn)量，降低成本。
本發(fā)明是一種微生物生產(chǎn)海藻糖脂類表面活劑的方法，具體地說是一種用節(jié)桿菌(Arthrobacter Simplex)生產(chǎn)海藻糖單脂和海藻糖四脂的方法。該方法包括用節(jié)桿菌在最佳培養(yǎng)條件下，進行代謝調(diào)節(jié)制備海藻糖脂類化合物或者用節(jié)桿菌休止細胞，制備海藻糖脂類化合物。
用本發(fā)明的節(jié)桿菌在培養(yǎng)條件下，進行代謝調(diào)節(jié)制備海藻糖脂類化合物的方法，即在節(jié)桿菌存在下的培養(yǎng)物中加入酸或堿，調(diào)PH至4-8，以0.5-1.5(體積比)/分鐘的空氣或富含氧氣的空氣通入培養(yǎng)物，培養(yǎng)溫度為20°-40℃，最佳為25°-30℃。在培養(yǎng)液中含有銨鹽或硝酸鹽作為氮源以及其它為繁殖細胞所必需的無機鹽類和生長因子。正烷烴、餾份油、原油、植物油和糖類可作為碳源。發(fā)酵終了，發(fā)酵液用1-3.5倍量的氯仿∶甲醇為1.5-3∶1(V/V)的溶劑或者用乙酸乙酯提取。
在上述方法中，本發(fā)明用節(jié)桿菌產(chǎn)糖脂的最佳培養(yǎng)條件是，可用玉米漿、旦白胨、牛肉汁、酵母膏作有機營養(yǎng)源，但用酵母膏最好。酵母膏用量控制在0.1-0.5%。另外該菌對微量元素也有特殊要求Zn++、Mn++、Ca++元素要控制一定量，培養(yǎng)液中含有ZnSO4·7H2O為0.001-0.005克/升。MnSO4·2H2O為0.01-0.05克/升。CaCl2·2H2O為0.01-0.05克/升。使菌體中蛋白質(zhì)合成控制在一定數(shù)量，體內(nèi)主要進行脂肪代謝。培養(yǎng)液中要控制一定比例的碳、氮源，氮源不能太高?？刂铺荚春偷幢壤秊?0-40∶1發(fā)酵過程中維持PH4-8。不用氨水，而用KOH或NaOH來調(diào)節(jié)。
用本發(fā)明的節(jié)桿菌休止細胞，生產(chǎn)表面活性劑的方法。首先將節(jié)桿菌培養(yǎng)休止細胞，再用休止細胞直接生產(chǎn)海藻糖脂類化合物先找出利用何種廉價碳源能生產(chǎn)菌體，節(jié)桿菌能長于葡萄糖、蔗糖、甘露糖、果糠、廢糖蜜、甘油、醋酸鹽等碳源，其中廢糖蜜和葡萄糖是較合適的碳源，菌體產(chǎn)量能達10克/升。將休止細胞懸浮于磷酸緩沖液、生理鹽水、蒸餾水或自來水都能產(chǎn)生糖脂，而以磷酸緩沖液作培養(yǎng)液產(chǎn)糖脂最多。磷酸緩沖液濃度可為0.1-0.5M，PH為4-7培養(yǎng)溫度為20°-40℃，最佳溫度是25°-30℃。節(jié)桿菌休止細胞產(chǎn)糖脂可用各種糖類、正烷烴、餾份油或植物油作碳源，其中正烷烴轉(zhuǎn)化率能達0.4-0.6。
利用本發(fā)明的方法，節(jié)桿菌休止細胞在地下適當條件下，如溫度15°-40℃，通空氣，PH控制在4-8，可直接用于石油的三次開采。采用本發(fā)明的方法，用節(jié)桿菌生產(chǎn)出的糖脂類化合物是海藻糖四脂和海藻糖單脂，二種糖脂間的比例也是隨著代謝調(diào)節(jié)改變的。當?shù)捶窍拗婆囵B(yǎng)時，產(chǎn)物主要是海藻糖單脂，而當?shù)聪拗茣r，產(chǎn)物則主要就是海藻糖四脂。用休止細胞培養(yǎng)時產(chǎn)物極大部分是海藻糖四脂。用本發(fā)明的方法生產(chǎn)所得的海藻糖脂可用石油三次開采及日化、紡織、食品等工業(yè)。
海藻糖四脂
海藻糖單脂
采用本發(fā)明代謝調(diào)節(jié)的方法，能使海藻糖脂類表面活性劑產(chǎn)量達到25克/升左右，對碳源基質(zhì)的轉(zhuǎn)化率也能提高一倍。而采用休止細胞生產(chǎn)表面活性物的方法是一種廉價，簡便的生產(chǎn)表面活性劑的方法。
本發(fā)明方法可用下面例子說明例一一個5升自控生物反應(yīng)器，裝2.0升營養(yǎng)鹽溶液，成份為Na2HPO4·2H2O 1克，MgSO4·7H2O 0.5克，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1克，ZnSO4·7H2O 0.005克，KH2PO41克，(NH4)2SO42.5克，MnSO4·H2O 0.01克，CaCl2·2H2O 0.05克，酵母膏1克，溶于1升水中，加200毫升正烷烴，溫度30℃，接入節(jié)桿菌(Arthrobacter.SP)種子250毫升，轉(zhuǎn)速500轉(zhuǎn)/分，通風2.5立升/分，培養(yǎng)過程中自動加入1N NaOH使PH值維持在6.50，發(fā)酵72小時，含表面活性物培養(yǎng)液2升，用二倍量三氯甲烷∶甲醇(V∶V＝2∶1)溶劑提取，得粗糖脂96克，經(jīng)硅膠柱層析得糖脂56克。
例二休止細胞生產(chǎn)糖脂1.休止細胞培養(yǎng)于把節(jié)桿菌培養(yǎng)下列培養(yǎng)液(5升三角瓶裝1升培養(yǎng)基)Na2HPO4·2H2O 1克/升，KH2PO41克/升，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.25克/升，MnSO4·2H2O 1克/升，KH2PO41克/升，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.25克/升，MnSO4·H2O 0.01克/升，CaCl2·2H2O 0.05克/升，葡萄糖30克/升，PH6.8，30℃，振蕩培養(yǎng)4天，離心菌體，用0.9% NaCl洗滌兩次，再放于0.1M磷酸緩沖液振蕩4小時，離心得休止細胞。
2.休止細胞在發(fā)酵罐中生產(chǎn)糖脂一個5升自控發(fā)酵罐，裝2.5升0.1M磷酸緩沖液(PH6.5)，接入相當于25克干重的休止細胞，加入正烷烴200ml，轉(zhuǎn)速500轉(zhuǎn)/分，通風2.5立升/分，培養(yǎng)94小時，終了即用二倍量的二氯甲烷∶甲醇體積比(2∶1)提取，蒸干得粗脂122克。
權(quán)利要求
1.一種表面活性劑海藻糖脂類化合物的微生物制備方法，其特征在于用節(jié)桿菌作菌種，可以分別通過下列二種方法。(1).節(jié)桿菌在最佳培養(yǎng)條件下，進行代謝調(diào)節(jié)制備海藻糖脂類化合物。(2).用節(jié)桿菌休止細胞制備海藻糖脂類化合物。
2.按權(quán)項1所述的方法中，其特征在于培養(yǎng)溫度為20°-40℃，最佳溫度是25°-30℃，PH＝4-8，以0.5-1.5(體積比)/分的空氣或富含氧氣的空氣通入培養(yǎng)物。
3.按權(quán)項1所述的方法中，其特征在于發(fā)酵后，發(fā)酵液用1-3.5倍量的甲醇-氯仿溶劑或乙酸乙酯提取，其中甲醇∶氯仿＝1∶1.5-3(V/V)。
4.按權(quán)項1、(1)所述的方法，其特征在于有機營養(yǎng)源可用玉米漿、蛋白胨、牛肉汁、酵母膏，最好用酵母膏，用量為0.1-0.5%。
5.按權(quán)項1、(1)所述的方法，其特征是培養(yǎng)液中含有ZnSO4·7H2O為0.001-0.005克/升，MnSO4·H2O為0.01-0.04克/升，CaCl2·2H2O為0.01-0.05克/升。
6.按權(quán)項1、(1)所述的方法，其特征是在發(fā)酵過程中用KOH或NaOH調(diào)節(jié)PH至4-8。
7.按權(quán)項1、(2)所述的方法，其特征是發(fā)酵碳源可以是葡萄糖、蔗糖、甘露糖、果糖、廢糖蜜、甘油或醋酸鹽，其中廢糖蜜、葡萄糖是合適的碳源。
8.按權(quán)項1、(2)所述的方法，其特征是休止細胞懸浮于磷酸緩沖液、生理鹽水、蒸餾水或自來水中，但最好采用濃度為0.1-0.5M的PH4-7的磷酸緩沖溶液。
9.按權(quán)項1、(2)所述的方法，其特征是各種糖類、正烷烴、餾份油或植物油可作為碳源，但最好用正烷烴。
10.按權(quán)項1、(2)所述的方法，其特征是節(jié)桿菌休止細胞可直接用于石油三次開采。
專利摘要
一種生物表面活性劑的制備方法，該法將節(jié)桿菌培養(yǎng)在一種最佳培養(yǎng)條件下，并進行代謝調(diào)節(jié)，控制適當碳氮比例，能獲高產(chǎn)海藻糖脂；另采用節(jié)桿菌的休止細胞也能廉價簡便地生產(chǎn)海藻糖脂。此海藻糖脂的主要成份是海藻糖四脂。
文檔編號C12P19/12GK85104026SQ85104026
公開日1986年11月19日 申請日期1985年5月21日
發(fā)明者李祖義 申請人:中國科學(xué)院上海有機化學(xué)研究所導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan