專利名稱:一種融合基因載體的構建表達及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬生物技術，涉及一種融合基因載體的構建表達及在制備腫瘤生物治療藥物中的應用。
背景技術：
白細胞介素18(IL-18)是1995年克隆的一種新型細胞因子，又稱γ干擾素誘導因子。能刺激γ干擾素的分泌，增強ThI型免疫反應。誘生IL-18的早期研究主要集中于肝臟，后來有研究者用體外培養(yǎng)的巨噬細胞經(jīng)適當誘導來獲得IL-18cDNA。本研究從健康人外周血單核細胞的RNA中，直接經(jīng)RT-PCR法擴增出IL-18基因，說明生理情況下，單核細胞就有IL-18 MRNA的表達。在功能上，IL-18更接近于IL-12，被認為是一種很有潛力的抗腫瘤，抗感染的細胞因子。近年的研究發(fā)現(xiàn)IL-18可以促進DC的成熟，顯著提高DC的抗原遞呈功能，并且能吸引II類DC和誘導ThI型免疫反應，國內(nèi)陳吉泉等報道以mIL-18基因修飾和3LL Lewis肺癌細胞提取物致敏的DC治療后，小鼠肺部轉(zhuǎn)移癌有明顯的抑制，肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)減少，而且CTL、NK殺傷活性顯著增強，但這種CTL效應只針對3LL Lewis肺癌細胞，而對其他腫瘤細胞株幾乎無殺傷作用。
目前研究表明，絕大多數(shù)人類惡性腫瘤均存在高水平的端粒酶活性，端粒酶活性被認為是腫瘤細胞持續(xù)生長所必需的。而構成端粒酶復合物的成分--人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)是端粒酶的催化亞單位，為端粒酶的限速因素，在端粒酶的激活和腫瘤的發(fā)生中起關鍵作用，也是抗細胞凋亡的主要因子。新近，Nair等在Natural Medicine上報道以小鼠為模型，將hTERT mRNA轉(zhuǎn)染DC后產(chǎn)生抗腫瘤作用，腫瘤明顯縮小，生存期延長。Zhen Su等在2002年CancerResearch上報道用人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)編碼的mRNA轉(zhuǎn)染DC具有潛在的誘導CTL與抗腫瘤免疫作用。Vonderheide等也有類似研究，并且針對TERT表達的腫瘤細胞均有殺傷作用。
隨著分子生物學、免疫學技術的不斷發(fā)展，加上計算機技術的引入，將功能類似或功能互補的2種細胞因子，通過人工接頭改造并構建出具有復合功能的細胞因子融合蛋白的研究取得令人矚目的成就。自構建出IL-3/GM-CSF融合蛋白(該融合蛋白的生物學活性是兩因子配合應用時的10～30倍，已經(jīng)進入III期臨床試驗。)以來，蛋白相繼產(chǎn)生。實驗表明，這些融合蛋白不僅保留了融合前各因子的功能，而且可能產(chǎn)生更強更新的生物學效應。
本發(fā)明構建的PCDNA3.1(+)/hTERT-hIL18經(jīng)限制性內(nèi)切酶驗證以及DNA測序和同源性對比分析該基因片段與NCBI基因庫hIL-18和hTERT基因CDS序列同源性均達到99.9％，近期xia等的研究也證實IL-18與腫瘤抗原共同結(jié)合能明顯增強DC的抗腫瘤作用，而不會有負向影響。本發(fā)明之所以將兩者構建在同個載體上形成融合基因轉(zhuǎn)染，是因為與兩個單個基因分別轉(zhuǎn)染比較，轉(zhuǎn)染的效率高。單個基因的共轉(zhuǎn)染，不能保證兩個基因均轉(zhuǎn)染入同個細胞，從而不能同時發(fā)揮TERT對DC的刺激作用和IL-18顯著增強抗原遞呈的作用。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)/人白細胞介素18(hIL18)融合蛋白載體，SEQ ID NO1為該融合蛋白的基因序列。
本發(fā)明的第二個目的是提供人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)/人白細胞介素18(hIL18)融合蛋白載體的構建，通過以下步驟實現(xiàn)1.PCR引物IL-18基因克隆的引物設計參照Genebank登錄序列，采用計算機輔助設計，由上海博亞公司合成， 序列如下引物1CTGGCTAGCATGGCTGCTGAACCAGTAGAAG(Nhe I位點)。
引物2GGGAAGCTTGTCTTCGTTTTGAACCAGTGA(Hind III位點)。
2.PCDNA3.1(+)/hTERT-hIL18質(zhì)粒的構建(1)標本的采取標本為正常人外周血10毫升，淋巴細胞分離液分離單個核細胞。
(2)RNA提取用Trizol試劑盒提取總RNA(步驟按其說明書進行)，檢測A260/A280＞1.8。
(3)hIL18 cDNA的合成及基因擴增hIL18 cDNA的合成采用Promega公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒。基因擴增采用PCR法，PCR產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳檢測有無目的基因。
(4)PCDNA3.1(+)/hTERT-hIL18質(zhì)粒的構建將IL-18 PCR擴增、電泳、回收和純化片段，通過T-A克隆，經(jīng)DNA測序鑒定后亞克隆到PCDNA 3.1(+)/hTERT質(zhì)粒中Nhe I和Hind III位點之間。在兩個基因連接區(qū)插入直鏈氨基酸，連接后，以氯化鈣沉淀法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，接種于含有氨芐抗性的瓊脂平皿，挑選陽性菌落，接種于2毫升含有氨芐的LB液體培養(yǎng)基中過夜，抽提質(zhì)粒。
3.PCDNA3.1(+)/hTERT-hIL18融合基因的鑒定(1)PCDNA 3.1(+)/hTERT+hIL-18的酶切鑒定提取的少量質(zhì)粒分別經(jīng)Nhe I、Not I雙酶切；Nhe I、Hind III雙酶切和EcoR I、Not I雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳后，根據(jù)分子量的大小判斷是否有hIL-18，hTERT及hTERT+hIL-18片段，(2)PCDNA 3.1(+)/hTERT+hIL-18的DNA序列分析陽性的hTERT+hIL-18融合基因克隆，DNA序列的分析委托上海博亞生物技術有限公司完成。
本發(fā)明的另一個目的是提供人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)/人白細胞介素18(hIL18)融合蛋白載體的表達，通過一下步驟實現(xiàn)1.轉(zhuǎn)染真核細胞將培養(yǎng)的3T3細胞按1×105/孔接種24孔板，培養(yǎng)24h至細胞達80％-85％，然后按試劑說明書步驟用lipofectamineTM2000分別包裹需要轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒到Opti-MEM I培養(yǎng)基(Invitrogen公司)并混勻，逐滴加入已換無血清培養(yǎng)基的3T3細胞中，轉(zhuǎn)染后6小時換上20％胎牛血清的DMEM。
2.免疫熒光染色轉(zhuǎn)染48h后1孔細胞免疫熒光染色∶無水乙醇固定后加入1∶50的hTERT一抗，室溫90m，PBS洗滌后加入熒光標記的1∶200的二抗(FITC)30m，PBS洗滌后在倒置熒光顯微鏡下觀察。
3.Western-blot檢測融合蛋白的表達收集5×106個細胞，用全細胞蛋白抽提試劑盒。40μg蛋白樣品加上樣緩沖液煮沸變性后，進行10％SDS-PAGE，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5％的脫脂奶粉封閉1小時，分別加入抗人IL-18(1∶1000，Santa Cruz)、抗人TERT(1∶1000，Santa Cruz)，于4℃冰箱過夜，洗膜3次，加HRP標記的二抗(1∶2000，SantaCruz)，室溫反應2小時，洗膜后作ECL化學發(fā)光，X片曝光顯影。結(jié)果與MARKER(Novagen 71047-3)比較TERT/IL-18的分子量大小。
本發(fā)明的又一個目的是提供這種融合基因載體在制備腫瘤生物治療藥物中的應用。
發(fā)明的有益之處是1.利用基因工程技術，將功能類似或功能互補的2種細胞因子，通過人工接頭改造并構建出具有復合功能的細胞因子融合蛋白。
2.IL-18與TERT融合蛋白表達，使其有可能既具有對腫瘤細胞殺傷靶向性強的特點，有能明顯提高樹突狀細胞介導的免疫效應。
3.為制備理想的樹突狀細胞疫苗奠定了實驗基礎，進一步研究的疫苗用于消滅微小殘留病，在惡性血液病患者達到異基因骨髓移植相當?shù)寞熜?。預計每例病人費用比異基因骨髓移植減少20萬元以上，可明顯降低醫(yī)療費用。
4.本發(fā)明構建的融合基因經(jīng)免疫熒光染色和Western bloting證實，能在真核細胞內(nèi)高效表達融合蛋白。同時，該融合基因的IL-18能刺激KG-1細胞分泌γ干擾素，而TERT蛋白能發(fā)揮抗MTX誘導凋亡的能力，說明融合蛋白中的IL-18和TERT各自都能發(fā)揮生物學功能，而且互不干擾。
5.本發(fā)明融合蛋白的表達和生物學功能測定，為以后轉(zhuǎn)染DC奠定實驗基礎，即既能增強樹突狀細胞介導的免疫反應，同時擴大樹突狀細胞介導的抗腫瘤范圍，為發(fā)揮樹突狀細胞誘導的免疫反應，研制腫瘤的治療性疫苗提供基礎。
圖1為IL-18 cDNA的RT-PCR產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳圖；圖2為融合基因酶切后產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳圖；圖3為融合基因載體PCDNA 3.1(+)/hTERT+hIL-18 CDNA的序列測定圖；圖4為轉(zhuǎn)染hIL-18，hTERT和hTERT+hIL-18的DC誘導的CTL對K562和A549殺傷效應的比較；圖5為3T3細胞表達hTERT/IL-18融合蛋白(綠色熒光)右側(cè)為同一視野對照圖；圖6為3T3細胞表達hTERT/IL-18融合蛋白Western bloting檢測圖；圖7為hTERT/IL-18融合蛋白刺激KG-1細胞分泌γ-干擾素圖；圖8為hTERT/IL-18融合蛋白轉(zhuǎn)染細胞抗MTX誘導凋亡的能力圖。
具體實施方式本發(fā)明結(jié)合附圖和實施例作進一步的說明。
實施例一1.材料1.1.1菌株及質(zhì)粒 大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α；真核表達質(zhì)粒PCDNA3.1(+)/hTERT和PCDNA3.1(+)。
1.1.2試劑 限制性內(nèi)切酶Hind III、Nhe I、EcoR I、Not I，T4DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、dNTPs、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，質(zhì)粒抽提試劑盒等均購自美國Promega公司；IL-18和TERT抗體和γ-干擾素ELISA試劑盒購自R&D公司，總RNA提取試劑盒為Invitrogene公司產(chǎn)品；凋亡檢測試劑盒購自Bender公司；MTX購自Sigma公司；酵母提取物、胰蛋白胨等細菌培養(yǎng)試劑為英國Oxford產(chǎn)品；瓊脂糖、RNA酶、膠回收試劑盒為Sangon公司產(chǎn)品；氯化鈣、SDS、淋巴細胞分離液、醋酸鈉為國產(chǎn)試劑。
1.1.3PCR引物 IL-18基因克隆的引物設計參照Genebank登錄序列，采用計算機輔助設計，由上海博亞公司合成，序列如下引物1CTGGCTAGCATGGCTGCTGAACCAGTAGAAG(Nhe I位點)。
引物2GGGAAGCTTGTCTTCGTTTTGAACCAGTGA(Hind III位點)。
2.方法2.1人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)/人白細胞介素18(hIL18)載體的構建2.1.1PCDNA3.1(+)/hTERT-hIL18質(zhì)粒的構建(1)標本的采取 標本為正常人外周血10毫升，淋巴細胞分離液分離單個核細胞。
(2)RNA提取 用Trizol試劑盒提取總RNA(步驟按其說明書進行)，檢測A260/A280＞1.8。
(3)hIL18 cDNA的合成及基因擴增hIL18 cDNA的合成采用Promega公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒?；驍U增采用PCR法，PCR產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳檢測有無目的基因。
(4)PCDNA3.1(+)/hTERT-hIL18質(zhì)粒的構建將IL-18 PCR擴增、電泳、回收和純化片段，通過T-A克隆，經(jīng)DNA測序鑒定后亞克隆到PCDNA 3.1(+)/hTERT質(zhì)粒中Nhe I和Hind III位點之間。在兩個基因連接區(qū)插入直鏈氨基酸，連接后，以氯化鈣沉淀法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，接種于含有氨芐抗性的瓊脂平皿，挑選陽性菌落，接種于2毫升含有氨芐的LB液體培養(yǎng)基中過夜，抽提質(zhì)粒。
2.2PCDNA3.1(+)/hTERT-hIL18融合基因的鑒定2.2.1PCDNA 3.1(+)/hTERT+hIL-18的酶切鑒定提取的少量質(zhì)粒分別經(jīng)Nhe I、Not I雙酶切；Nhe I、Hind III雙酶切和EcoR I、Not I雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳后，根據(jù)分子量的大小判斷是否有hIL-18，hTERT及hTERT+hIL-18片段，2.2.2PCDNA 3.1(+)/hTERT+hIL-18的DNA序列分析陽性的hTERT+hIL-18融合基因克隆，DNA序列的分析委托上海博亞生物技術有限公司完成。
2.2.3人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)/人白細胞介素18(hIL18)載體的表達(1)轉(zhuǎn)染真核細胞將培養(yǎng)的3T3細胞按1×105/孔接種24孔板，培養(yǎng)24h至細胞達80％-85％，然后按試劑說明書步驟用lipofectamineTM2000分別包裹需要轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒到Opti-MEM I培養(yǎng)基(Invitrogen公司)并混勻，逐滴加入已換無血清培養(yǎng)基的3T3細胞中，轉(zhuǎn)染后6小時換上20％胎牛血清的DMEM。
(2)免疫熒光染色轉(zhuǎn)染48h后1孔細胞免疫熒光染色∶無水乙醇固定后加入1∶50的hTERT一抗，室溫90m，PBS洗滌后加入熒光標記的1∶200的二抗(FITC)30m，PBS洗滌后在倒置熒光顯微鏡下觀察。
(3)Western-b1ot檢測融合蛋白的表達收集5×106個細胞，用全細胞蛋白抽提試劑盒。40μg蛋白樣品加上樣緩沖液煮沸變性后，進行10％SDS-PAGE，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5％的脫脂奶粉封閉1小時，分別加入抗人IL-18(1∶1000，Santa Cruz)、抗人TERT(1∶1000，Santa Cruz)，于4℃冰箱過夜，洗膜3次，加HRP標記的二抗(1∶2000，SantaCruz)，室溫反應2小時，洗膜后作ECL化學發(fā)光，X片曝光顯影。結(jié)果與MARKER(Novagen 71047-3)比較TERT/IL-18的分子量大小。
實施例二 人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)/人白細胞介素18(hIL18)融合基因的生物學功能檢測1.融合基因刺激KG-1細胞分泌γ-干擾素的生物學功能檢測細胞培養(yǎng)上清液γ-干擾素含量的檢測取出轉(zhuǎn)染融合基因的3T3細胞培養(yǎng)上清液0.1ml，從1×106/ml的KG-1細胞中取0.1ml至96孔板，分別以原液，1∶2稀釋，1∶5稀釋，1∶10稀釋，1∶20稀釋，正常3T3細胞培養(yǎng)上清液(陰性對照)，以及標準IL-18刺激液(陽性對照)和空白對照(PBS)。每個濃度設3個復孔。采用定量酶聯(lián)免疫技術(ELISA法)，按試劑盒說明書操作步驟進行。在酶標儀490nm波長處測吸光度(A值)。根據(jù)CurveExpert軟件分析計算。
2.融合基因抗凋亡的功能檢測用已知的凋亡誘導劑甲氨蝶聆(MTX)，分別以不同濃度0nm，1nm，10nm，50nm，100nm作用于轉(zhuǎn)染的5×105/ml 3T3細胞和正常的3T3細胞24小時。參照Annexin V細胞凋亡檢測試劑盒說明書操作。收集細胞，冷PBS洗滌2次，1000rpm/min離心，4℃7min，棄上清。將細胞重懸于1ml 1×Bindingbuffer，取100μl細胞置于流式細胞儀專用試管中，加5μl Aannexin V FITC和5μlPI，輕輕混勻，避光室溫反應15min，加入300μl 1×Binding buffer，立即用流式細胞儀檢測，Cellquest 1.2分析軟件分析結(jié)果。
實施例三1.融合基因電轉(zhuǎn)染樹突狀細胞(1)取2×106個細胞，用無血清無抗生素的培養(yǎng)基洗滌2次后，混懸于400微升的hypo-osmolarbuffer(Eppendorf公司產(chǎn)品)電轉(zhuǎn)緩沖液。
(2)取10微克無菌無熱源的融合基因質(zhì)粒加于上述細胞懸液中，輕柔混勻后，轉(zhuǎn)移至400微升的電轉(zhuǎn)杯中(Electroporation cuvette)2mm間距，400ul容積。
(3)將電轉(zhuǎn)杯置于電轉(zhuǎn)儀(Multiporator Eppendorf)中，300V/20us電流沖擊2次，期間間隔1分鐘。
(4)吸出電轉(zhuǎn)后的細胞，用10ml含血清的培養(yǎng)基洗滌細胞2次(800rpm×5min)；并培養(yǎng)于15％FCS的RPMI1640培養(yǎng)基中。
2.細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的體外誘導及殺傷活性的檢測分離正常人外周血的T淋巴細胞，與融合基因轉(zhuǎn)染后的DC在含IL-250U/ml 15％FCS的RPMI1640完全培養(yǎng)基中共同孵育5天，比例為T∶DC為30∶1，第5天收集活細胞作為效應細胞，51Cr標記1h的hTERT高表達的K562細胞作為靶細胞，以100∶1、50∶1、25∶1不同的效靶比，用51Cr 4h釋放法檢測CTL的活性，同時設最大釋放組和自然釋放組，同時以取自正常人的滑膜細胞作為對照細胞(無hTERT表達)。以下式計算殺傷率∶殺傷率＝(實驗組cpm-自然釋放組cpm)/(最大釋放組cpm-自然釋放組cpm)×100％。
結(jié)果1.重組IL-18cDNA RT-PCR產(chǎn)物的初步鑒定根據(jù)所設計的引物，預計擴增片段的大小為510BP左右，2％瓊脂凝膠電泳顯示的條帶基本符合預期的DNA片段，參見圖1，其中1 IL-18 cDNA(510bp)；2陰性對照。說明擴增產(chǎn)物為IL-18 CDNA片段。說明擴增產(chǎn)物為IL-18 CDNA片段。
2.質(zhì)粒PCDNA3.1(+)/hTERT+hIL-18的酶切鑒定將挑選出的陽性克隆擴增后取菌液初步抽提質(zhì)粒，分別經(jīng)Nhe I/Not I、Nhe I/Hind III和EcoR I/Not I三對內(nèi)切酶酶切后，1％瓊脂凝膠電泳顯示三條分子量大小不同的條帶，參見圖2，圖中1PCDNA3.1(+)/hTERT+IL-18經(jīng)Nhe I/Hind III酶切，2PCDNA3.1(+)/hTERT+IL-18經(jīng)EcoR I/NotI酶切，3PCDNA3.1(+)/hTERT+IL-18經(jīng)Nhe I/Not I酶切，4PCDNA3.1(+)(5428bp)。Nhe I/Hind III雙酶切，見到分子量510bp大小的條帶(hIL-18)，證實插入的片段與PCR擴增產(chǎn)物的大小一致，所篩選的克隆含IL-18cDNA片段。EcoR I/Not I雙酶切后，見到分子量3.4Kb大小的條帶(hTERT)，Nhe I/Not I雙酶切后，可以見到分子量約3.9Kb左右的條帶(hTERT+hIL-18)，證實了PCDNA3.1(+)/hTERT+IL-18的融合基因。
3.PCDNA3.1(+)/hTERT+IL-18 CDNA的序列測定將質(zhì)粒PCDNA3.1(+)/hTERT+IL-18DNA測序(參見圖3)和同源性對比分析該基因片段與http://ncbi.nlm.nih.gov的基因數(shù)據(jù)庫(AllGenBank+EMBL+DDBJ+PDB sequences(but no EST，STS，GSS，or phase 0，1 or2 HTGS sequences)比較融合基因的前面部分與hIL-18基因的符合率為570/574(99％)，融合基因的前面部分與hTERT基因的符合率為395/406(97％)，而與hTERT啟動子基因的符合率為221/222(99％)。結(jié)果表明，所構建的cDNA片段即為人TERT和IL-18融合的編碼基因。圖3中融合基因載體PCDNA 3.1(+)/hTERT+hIL-18連接部分的DNA序列AAGCTTIL-18 Hind III的酶切點；GAATTC TERT EcoR I的酶切點。
實施例四 疫苗誘導的CTL細胞對白血病和肺癌細胞的殺傷1.對表達hTERT的白血病和肺癌細胞株的殺傷分別以融合基因(hTERT+hIL-18)以及hTERT，hIL-18轉(zhuǎn)染后的DC，刺激誘導形成CTL細胞，作為效應細胞，51Cr標記1h的hTERT高表達的白血病細胞K562和肺癌細胞A549細胞株作為靶細胞，以上述不同的效靶比，檢測CTL的活性，按照上述計算公式。
2.體外實驗表明，融合基因轉(zhuǎn)染的DC，誘導刺激形成的CTL細胞對高表達hTERT的白血病細胞和肺癌細胞均有較強的殺傷作用。25∶1、50∶1、100∶1不同的效靶比下，轉(zhuǎn)染融合基因(hTERT+hIL-18)的DC激的CTL細胞對K562的殺傷率分別為(18.1％；32.7％；47.6％)，對A549的殺傷率為(16.2％；29.8％；45.3％)。轉(zhuǎn)染hTERT的DC刺激的CTL細胞對K562的殺傷率分別為(17.3％；28.6％；40.9％)，對A549的殺傷率分別為(14.4％；23.5％；40.1％)轉(zhuǎn)染hIL-18的DC刺激的CTL細胞對K562的殺傷率分別為(12.8％；18.8％；26.7％)，對A549的殺傷率分別為(12.2％；18.7％；25.9％)，參見圖4，在同樣實驗條件下，對hTERT無表達的正?；ぜ毎麩o殺傷作用(殺傷率分別為9.7％；15.6％；18.4％)。由此可見，轉(zhuǎn)染融合基因的DC刺激誘導的CTL對高表達hTERT的白血病和肺癌細胞都有殺傷作用，雖然hTERT與hTERT+hIL-18轉(zhuǎn)染的DC誘導的CTL效應沒有明顯差異(p＞0.05)，但是其殺傷效應還是有提高的。而僅轉(zhuǎn)染hIL-18的DC誘導的CTL效應，由于沒有腫瘤抗原的刺激，其CTL效應是比較低的(p＜0.05)。所以，體外實驗驗證了我們的設想，這樣也為制備理想的樹突狀細胞疫苗奠定了實驗基礎。圖4A為K562的CTL殺傷效應，圖4B為A549的CTL殺傷效應。
實施例五 融合蛋白的表達鑒定1.表達產(chǎn)物的免疫熒光鑒定48h后免疫熒光染色顯示融合蛋白彌散表達于胞漿，參見圖5，為3T3細胞表達hTERT/IL-18融合蛋白(綠色熒光)右側(cè)為同一視野對照。
2.表達產(chǎn)物的Western bloting鑒定收集轉(zhuǎn)染后的細胞提取全蛋白，分別加入抗人IL-18(參見圖6)、抗人TERT抗體(圖未顯示)，目的基因表達產(chǎn)物可以分別與hTERT抗體及hIL-18抗體特異性結(jié)合。X片曝光顯影后可見到融合蛋白分子量約127KD左右，與預期一致。證實了hTERT/hIL-18融合基因在3T3細胞內(nèi)成功表達。圖6為3T3細胞表達hTERT/IL-18融合蛋白Western bloting檢測。
實施例六 hTERT/IL-18融合蛋白的生物學功能檢測1.融合蛋白能明顯刺激KG-1細胞分泌γ-干擾素。正常3T3細胞上清與空白對照組刺激KG-1細胞分泌γ-干擾素的能力明顯較弱，與原液組有明顯統(tǒng)計學差異(p＜0.05)。原液刺激KG-1細胞分泌γ-干擾素的能力與標準品相似(p＞0.05)。隨著上清的稀釋倍數(shù)增加，刺激KG-1細胞分泌γ-干擾素的能力逐步下降(見圖7)。
2.融合蛋白抗MTX誘導凋亡的生物學功能檢測Annexin VFITC及PIPE雙標記細胞后流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，MTX 0-100nm作用24h，正常3T3細胞凋亡(AnnexinVFITC陽性LR+UR象限)百分數(shù)分別為0.71％；2.46％；4.19％；6.68％；10.81％，轉(zhuǎn)染融合基因的細胞組分別為0.82％；1.90％；2.13％；2.72％；2.94％(圖8)；從以上數(shù)據(jù)可知，隨著藥物濃度上升，正常細胞組細胞凋亡數(shù)增加；而轉(zhuǎn)染融合基因的細胞組凋亡不明顯(在10nm濃度以上正常組與轉(zhuǎn)染組之間有統(tǒng)計學差異)。
3.用途初步的實驗表明，體外誘導的CTL細胞對高表達hTERT的細胞有較強的殺傷作用，而對hTERT無表達的正常滑膜細胞無殺傷作用，驗證了本實驗的設想，為制備理想的樹突狀細胞疫苗奠定了實驗基礎。
無需進一步詳細闡述，相信采用前面所公開的內(nèi)容，本領域技術人員可最大限度地應用本發(fā)明。因此，前面的實施方案應理解為僅是舉例說明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
本發(fā)明涉及的序列<110>浙江大學<120>一種融合基因載體的構建表達及用途<160>3<170>PatentIn Version 2.1<210>1<211>1033<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1)…(583)(619)…(624)(629)…(1033)<223>n＝a或g或c或t<400>1ATGgGCTGAC CAGTAGAAGA CAATTGCATC AACTTTGTGG CAATGAAATT TATTGACAAT 60aCGTTtTact TTATAGCTGA AGATGATGAA AACCTGGAAT CaGATTActT TGGCAAGCTT 120GAATCTAAAT TATCAGTCAT AAGAAATTTG AATGACCAAG TTCTCTTCAT TGACCAAGGA 180AATCGGCCTC TATTTGAAGA TATGACTGAT TCTGACTGTA GAGATAATGC ACCCCGGACC 240ATATTTATTA TAAGTATGTA TAAAGATAGC CAGCCTAGAG GTATGGCTGT AACTATCTCT 300GTGAAGTGTG AGAAAATTTC AACTCTCTCC TGTGAGAACA AAATTATTTC CTTTAAGGAA 360ATGAATCCTC CTGATAACAT CAAGGATACA AAAAGTGACA TCATATTCTT TCAGAGAAGT 420GTCCCAGGAC ATGATAATAG GATGCAATTT GAATCTTCAT CATACGAAGG ATACTTTCTA 480GCTTGTGAAA AAGAGAGAGA CCTTTTTAAA CTCATTTTGA AAAAAGAGGA TGAATTGGGG 540GATAGATCTA TAATGTTCAC TGGTTCAAAA CGAAGACAAG CTTGGTACCG AGCTCGGATC 600CACTAGTCCA GTGTGGTGGA ATTCCACCAT GCCGCGCGCT CCCCGCTGCC GAGCCGTGCG 660
CTCCCTGCTG CGCAGCCACT ACCGCGAGGT GCTGCCGCTG GCCACGTTCG TGCGGCGCCT 720GGGGCCCCAG GGCTGGCGGC TGGTGCAGCG CGGGGACCCG GCGGCTTTCC GCGCGCTGGT 780GGCCCAGTGC CTGGTGTGCG TGCCCTGgGA CGCACGGCCG CCCCCCGCCG CCCCTCCTTC 840CGCCAGGTGT CCTGCCTGAA GGAGCTGGTG GCCCGAGTGC TGCAGAGGCT GTGCGAGCGC 900GGCGCGARAC GTGCTGGCCT TCGGCTTCSC GCTGCTGGAC GGGGCCGCGG GGCCCCCCGA 960GGTCTTCACC ACAGCGTGCG CAGCTACCTG CCCAACACGG TGACCGACGC ACTGSCGGGG 1020GAGCGGGCGT GGG 1033<210>2<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(4)…(9)<223>n＝a或g或c或t<400>1CTGGCTAGCATGGCTGCTGAACCAGTAGAAG 31<210>3<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(4)…(9)<223>n＝a或g或c或t<400>1GGGAAGCTTGTCTTCGTTTTGAACCAGTGA 30
權利要求
1.一種人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶/人白細胞介素18融合蛋白載體，SEQ ID NO1為該融合蛋白的基因序列。
2.根據(jù)權利要求
1所述的人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶/人白細胞介素18融合蛋白載體的構建，其特征是通過以下步驟實現(xiàn)PCDNA3.1(+)/hTERT-hIL18質(zhì)粒的構建標本為正常人外周血10毫升，淋巴細胞分離液分離單個核細胞，用Trizol試劑盒提取總RNA，檢測A260/A280＞1.8，hIL18 cDNA的合成采用Promega公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，基因擴增采用PCR法，PCR產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳檢測有無目的基因，將IL-18PCR擴增、電泳、回收和純化片段，通過T-A克隆，經(jīng)DNA測序鑒定后亞克隆到PCDNA 3.1(+)/hTERT質(zhì)粒中Nhe I和Hind III位點之間，在兩個基因連接區(qū)插入直鏈氨基酸，連接后，以氯化鈣沉淀法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，接種于含有氨芐抗性的瓊脂平皿，挑選陽性菌落，接種于2毫升含有氨芐的LB液體培養(yǎng)基中過夜，抽提質(zhì)粒。
3.根據(jù)權利要求
2所述的人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶/人白細胞介素18融合蛋白載體的構建，其特征是PCR引物1CTGGCTAGCATGGCTGCTGAACCAGTAGAAG，Nhe I位點，引物2GGGAAGCTTGTCTTCGTTTTGAACCAGTGA，Hind III位點。
4.根據(jù)權利要求
2所述的人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶/人白細胞介素18融合蛋白載體的表達，其特征是通過以下步驟實現(xiàn)(1)轉(zhuǎn)染真核細胞將培養(yǎng)的3T3細胞按1×105/孔接種24孔板，培養(yǎng)24h至細胞達80％-85％，然后按試劑說明書步驟用lipofectamineTM2000分別包裹需要轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒到Opti-MEM I培養(yǎng)基并混勻，逐滴加入已換無血清培養(yǎng)基的3T3細胞中，轉(zhuǎn)染后6小時換上20％胎牛血清的DMEM；(2)免疫熒光染色轉(zhuǎn)染48h后1孔細胞免疫熒光染色無水乙醇固定后加入1∶50的hTERT一抗，室溫90m，PBS洗滌后加入熒光標記的1∶200的二抗FITC 30m，PBS洗滌后在倒置熒光顯微鏡下觀察；(3)Western-blot檢測融合蛋白的表達收集5×106個細胞，用全細胞蛋白抽提試劑盒，40μg蛋白樣品加上樣緩沖液煮沸變性后，進行10％SDS-PAGE，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5％的脫脂奶粉封閉1小時，分別加入1∶1000，Santa Cruz的抗人IL-18和1∶1000，Santa Cruz的抗人TERT，于4℃冰箱過夜，洗膜3次，加HRP標記的1∶2000，Santa Cruz的二抗，室溫反應2小時，洗膜后作ECL化學發(fā)光，X片曝光顯影，結(jié)果與MARKER比較TERT/IL-18的分子量大小。
5.根據(jù)權利要求
1所述的人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶/人白細胞介素18融合蛋白載體在制備腫瘤生物治療藥物中的應用。
專利摘要
本發(fā)明利用基因工程技術，將功能類似或功能互補的2種細胞因子，通過人工接頭改造并構建出具有復合功能的細胞因子融合蛋白人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)/人白細胞介素18(hIL18)融合蛋白。并建立人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)/人白細胞介素18(hIL18)融合蛋白載體的表達，使其有可能既具有對腫瘤細胞殺傷靶向性強的特點，又能明顯提高樹突狀細胞介導的免疫效應，擴大其抗腫瘤范圍，為制備理想的樹突狀細胞疫苗奠定了實驗基礎，研究表明在惡性血液病患者達到異基因骨髓移植相當?shù)寞熜?，可明顯降低醫(yī)療費用，為研制腫瘤的治療性疫苗提供基礎。
文檔編號C12N15/79GK1995356SQ200610155201
公開日2007年7月11日 申請日期2006年12月14日
發(fā)明者童向民, 金潔, 姚航平 申請人:浙江大學導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan