專利名稱:一種大黃魚精子遺傳物質(zhì)完全失活的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及海水魚類染色體操作技術，具體地說是一種我國重要海水養(yǎng)殖對象-大黃魚精子遺傳物質(zhì)完全滅活的方法。
背景技術：
精子遺傳物質(zhì)的完全滅活是與受精卵第二極體和第一次卵裂抑制技術結合產(chǎn)生同質(zhì)和異質(zhì)雌核發(fā)育二倍體的關鍵技術。雖然目前已經(jīng)具有海水魚類精子紫外遺傳失活的方法，但主要是針對牙鲆魚的，而大黃魚精子的特點與牙鲆魚精子的完全不同，其精液濃度、pH適合范圍以及精子內(nèi)部超微結構與后者的有較大差別，使得大黃魚精子對紫外照射的敏感性和耐受力也存在很大差異。將牙鲆等鲆鰈魚類精子遺傳失活條件直接應用于大黃魚精子的遺傳失活中一直未獲得成功，其遺傳失活率只有88-92％；而有關于大黃魚精子完全遺傳失活的方法實驗的報道也尚未見到。

發(fā)明內(nèi)容為了克服現(xiàn)有技術對大黃魚精子遺傳物質(zhì)滅活中存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種滅活效果完全的適用于大黃魚精子遺傳物質(zhì)失活的紫外照射方法和優(yōu)化參數(shù)、以避免大黃魚雌核發(fā)育二倍體誘導可能帶來分析結果混亂情形的大黃魚精子遺傳物質(zhì)失活的方法。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術方案如下滅活步驟為①精液保存將人工擠出的未激活的大黃魚成熟情液避光保存于2～4℃低溫條件下備用。
②精液稀釋采用預冷的稀釋液稀釋所述大黃魚成熟精液，稀釋倍數(shù)為20～100倍，然后將稀釋后的大黃魚成熟精液放入到已預冷到0～5℃的培養(yǎng)皿中，其培養(yǎng)皿中稀釋后的大黃魚成熟精液液體厚度為0.1～0.3cm；其中按重量體積百分比計所述預冷的稀釋液成份為NaCl 0.60～0.80％，KCl 0.03～0.05％，CaCl20.01～0.03％，葡萄糖0.05～0.10％；pH7.0～7.3；預冷溫度為0～5℃。
③精子遺傳物質(zhì)失活紫外光源預熱5～10min后，將帶有稀釋后的大黃魚成熟精液的培養(yǎng)皿置于紫外光源下，照射1.5～5min，使得大黃魚遺傳物質(zhì)失活；其中紫外光源與培養(yǎng)皿底部距離恒定為15cm，紫外光源的照射劑量為1800～6000erg/mm2；所述紫外光源的照射劑量用Cole-Parmer Instrument Company的VLX-3W數(shù)字紫外輻射照度計測定。
④失活效果檢測將照射后的精子與正常大黃魚卵子受精，根據(jù)受精后6h胚胎存活率、孵化率和單倍率獲得率，對遺傳物質(zhì)失活效果進行檢測。
各步驟中的優(yōu)選參數(shù)為采用預冷的稀釋液稀釋所述大黃魚成熟精液，其稀釋倍數(shù)為40～80倍；培養(yǎng)皿中稀釋后的大黃魚成熟精液液體厚度為0.1～0.25cm；稀釋液與培養(yǎng)皿都預冷到0～2℃；紫外照射強度劑量為3000～4200erg/mm2；照射時間為2.5～3.5min。
本發(fā)明原理是當紫外照射強度達到一定劑量時，不僅將精子的遺傳物質(zhì)完全滅活，也同時保證精子的受精能力，并可以使卵子正常啟動。
本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果在于1.本發(fā)明方法簡單，所需設備少，便于操作，解決了大黃魚雌核發(fā)育誘導過程中最關鍵的精子遺傳物質(zhì)滅活不徹底的問題。
2.利用本發(fā)明不僅可使大黃魚精子遺傳物質(zhì)失活率達到100％，且精子仍具有活力可以正常啟動卵子發(fā)育，同時還保證了滅活后精子對卵子較高的啟動率(80～90％)及其受精后較高的6h胚胎存活率(75～85％)和孵化率(60～70％)。
3.本發(fā)明用于大黃魚異質(zhì)雌核發(fā)育誘導實驗中已獲得了良好的實驗結果，保證了誘導后的個體全部為雌核發(fā)育的后代。對于進行大規(guī)模大黃魚異質(zhì)雌核發(fā)育和全雌大黃魚誘導及其應用于實際養(yǎng)殖生產(chǎn)提供了技術基礎。
4.適用范圍較廣，本發(fā)明不僅適用于大黃魚異質(zhì)雌核發(fā)育的誘導，也適用于大黃魚同質(zhì)雌核發(fā)育的誘導，這也將為大黃魚純系的建立提供基本參數(shù)和基礎。其技術方案和其中的一些處理參數(shù)也適用于其它非鲆鰈類的海水魚的雌核發(fā)育誘導。
圖1(a)為本發(fā)明實施例1獲得的大黃魚雌核發(fā)育單倍體的初孵仔魚圖。
圖1(b)為本發(fā)明實施例1大黃魚二倍體的初孵仔魚圖。
圖2(a)為本發(fā)明實施例2獲得的大黃魚雌核發(fā)育單倍體初孵仔魚的細胞流儀檢測圖。
圖2(b)為本發(fā)明實施例2大黃魚二倍體初孵仔魚的細胞流儀檢測圖。
具體實施方式下面結合附圖和實施例詳述本發(fā)明。
實施例1滅活步驟為1.精液保存將人工擠出的未激活的大黃魚成熟精液避光保存于2℃低溫條件下備用。
2.精液稀釋采用預冷的稀釋液稀釋所述的大黃魚成熟精液，其稀釋倍數(shù)為40倍，然后將稀釋后的大黃魚成熟精液放入到已預冷到0℃的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿中稀釋后的大黃魚成熟精液液體厚度為0.1cm。
其中預冷的稀釋液為按重量體積百分比計NaCl 0.60％；KCl 0.03％；CaCl20.01％；葡萄糖0.05％；pH7.0；稀釋液預冷到0℃。
3.精子遺傳物質(zhì)失活打開紫外光源預熱5min后，將帶有稀釋后的大黃魚成熟精液的培養(yǎng)皿置于紫外光源下，保持紫外光源與培養(yǎng)皿底部距離為15cm，照射2.5min，其紫外光源照射劑量為3000erg/mm2，所述紫外照射劑量用Cole-Parmer InstrumentCompany的VLX-3W數(shù)字紫外輻射照度計測定。
4.失活效果檢測將照射后的大黃魚精子與正常大黃魚卵子受精，采用外部形態(tài)觀察和流式細胞儀檢測細胞中DNA相對含量對遺傳物質(zhì)失活效果進行鑒定。從形態(tài)學上觀察，遺傳物質(zhì)完全失活的精子與卵子受精孵化后全部為單倍體，表現(xiàn)出單倍體綜合癥(參見圖1)。
實施例2與實施例1不同之處在于1.精液保存將人工擠出的未激活的大黃魚成熟精液避光保存于3℃低溫條件下備用。
2.精液稀釋采用預冷的稀釋液稀釋所述的大黃魚成熟精液，其稀釋倍數(shù)為50倍，然后將稀釋后的大黃魚成熟精液放入到已預冷到1℃的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿中稀釋后的大黃魚成熟精液液體厚度為0.2cm；其中預冷的稀釋液為按重量體積百分比計NaCl 0.75％，KCl 0.04％，CaCl20.02％，葡萄糖0.08％；pH7.2；稀釋液預冷到1℃。
3.精子遺傳物質(zhì)失活打開紫外光源預熱8min后，將帶有稀釋后的大黃魚成熟精液的培養(yǎng)皿置于紫外光源下，保持紫外光源與培養(yǎng)皿底部距離為15cm，照射3min，其紫外光源照射劑量為3600erg/mm2。
4.失活效果檢測將照射后的大黃魚精子與正常大黃魚卵子受精，采用外部形態(tài)觀察和流式細胞儀檢測DNA相對含量對遺傳物質(zhì)失活效果進行鑒定。遺傳物質(zhì)完全失活的精子與卵子受精孵化后全部為單倍體，其細胞內(nèi)DNA含量也只有正常二倍體的一半(參見圖2)。
實施例3與實施例1不同之處在于1.精液保存將人工擠出的未激活的大黃魚成熟精液避光保存于4℃低溫條件下備用。
2.精液稀釋采用預冷的稀釋液稀釋所述的大黃魚成熟精液，其稀釋倍數(shù)為80倍，然后將稀釋后的大黃魚成熟精液放入到已預冷到2℃的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿中稀釋后的大黃魚成熟精液液體厚度為0.25cm；其中預冷的稀釋液為按重量體積百分比計，NaCl 0.80％，KCl 0.05％，CaCl20.03％，葡萄糖0.10％；pH7.3；稀釋液預冷到2℃。
3.精子遺傳物質(zhì)失活打開紫外光源預熱10min后，將帶有稀釋后的大黃魚成熟精液的培養(yǎng)皿置于紫外光源下，保持紫外光源與培養(yǎng)皿底部距離為15cm，照射3.5min，其紫外光源照射劑量為4200erg/mm2。
4.失活效果檢測將照射后的大黃魚精子與正常大黃魚卵子受精，采用外部形態(tài)觀察和流式細胞儀檢測DNA相對含量對遺傳物質(zhì)失活效果進行鑒定。遺傳物質(zhì)完全失活的精子與卵子受精孵化后全部為單倍體，表現(xiàn)出單倍體綜合癥，其DNA含量也只有正常二倍體的一半。
權利要求
1.一種大黃魚精子遺傳物質(zhì)完全滅活的方法，包括精液保存、精液稀釋、精子遺傳物質(zhì)失活，其特征在于①精液保存將人工擠出的未激活的大黃魚成熟精液避光保存于2～4℃低溫條件下備用；②精液稀釋采用預冷的稀釋液稀釋所述大黃魚成熟精液，稀釋倍數(shù)為20～100倍，然后將稀釋后的大黃魚成熟精液放入已預冷到0～5℃的培養(yǎng)皿中，其培養(yǎng)皿中稀釋后的大黃魚成熟精液液體厚度為0.1～0.3cm；其中按重量體積百分比計所述預冷的稀釋液成份為NaCl 0.60～0.80％，KCl 0.03～0.05％，CaCl2，0.01～0.03％，葡萄糖0.05～0.10％；pH，7.0～7.3；稀釋液預冷到0～5℃；③精子遺傳物質(zhì)失活紫外光源預熱5～10min后，將帶有稀釋后的大黃魚成熟精液的培養(yǎng)皿置于紫外光源下，照射1.5～5min，使得大黃魚遺傳物質(zhì)失活；其中紫外光源的照射劑量為1800～6000erg/mm2。
2.按照權利要求
1所述大黃魚精子遺傳物質(zhì)滅活的方法，其特征在于精子遺傳物質(zhì)失活時所述紫外光源與培養(yǎng)皿底部距離恒定為15cm。
3.按照權利要求
1所述大黃魚精子遺傳物質(zhì)滅活的方法，其特征在于采用預冷的稀釋液稀釋所述大黃魚成熟精液，其稀釋倍數(shù)為40～80倍；培養(yǎng)皿中稀釋的大黃魚成熟精液液體厚度為0.1～0.25cm；稀釋液與培養(yǎng)皿都預冷到0～2℃；紫外照射強度劑量為3000～4200erg/mm2；照射時間為2.5～3.5min。
專利摘要
本發(fā)明公開一種適用于大黃魚精子遺傳物質(zhì)完全失活的方法，可以用于大黃魚雌核發(fā)育和其全雌苗種誘導的研究和生產(chǎn)。方法為采用預冷的含有營養(yǎng)成分的稀釋液將大黃魚成熟精液稀釋20～100倍后放于平底培養(yǎng)皿中，用紫外光源照射后，與大黃魚卵子受精并孵育，而后對精子遺傳滅活的效果進行鑒定。本發(fā)明具有方法簡單，所需設備少，便于操作，精子遺傳物質(zhì)滅活率能夠達到100％，且精子仍具有活力可以正常啟動卵子發(fā)育等優(yōu)點。為實現(xiàn)大規(guī)模雌核發(fā)育和全雌大黃魚誘導奠定了基礎。
文檔編號C12N15/01GK1990857SQ200510136709
公開日2007年7月4日 申請日期2005年12月27日
發(fā)明者許建和, 尤鋒, 張培軍, 吳雄飛, 徐永立, 蔣宏雷 申請人:中國科學院海洋研究所導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan