專利名稱：普通小麥背景中外源遺傳物質(zhì)的鑒定的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
普通小麥背景中外源遺傳物質(zhì)的鑒定，屬于作物遺傳育種學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
對(duì)轉(zhuǎn)移進(jìn)普通小麥背景中的外源遺傳物質(zhì)進(jìn)行鑒定，可以對(duì)其跟蹤、評(píng)價(jià)其遺傳 效應(yīng)，提高對(duì)其選擇的準(zhǔn)確性和利用效率。近年來，已經(jīng)建立了形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、分 子生物學(xué)標(biāo)記和生化標(biāo)記等多種鑒定外源遺傳物質(zhì)的方法和技術(shù)，特別是分子標(biāo)記和分子 細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，使外源遺傳物質(zhì)的鑒定及外源基因的定位和識(shí)別變得更為方 便可靠。

發(fā)明內(nèi)容
(1)形態(tài)學(xué)鑒定 建立在特定表型性狀基礎(chǔ)上的形態(tài)標(biāo)記是檢測(cè)外源遺傳物質(zhì)最簡便、最基礎(chǔ)的方 法。 一般參照雙親的形態(tài)特征，根據(jù)后代的表型特點(diǎn)確定是否存在外源基因。目前已在部 分小麥近緣物種山羊草、黑麥、簇毛麥、彭梯卡偃麥草等中找到了其特定染色體的形態(tài)標(biāo)記 性狀。但真正可以應(yīng)用的表型性狀較少。
(2)細(xì)胞學(xué)鑒定 細(xì)胞學(xué)鑒定是利用小麥與其近緣種在染色體數(shù)目、形態(tài)、大小和聯(lián)會(huì)行為等方面 的差異進(jìn)行比較分析。在染色體數(shù)目鑒定的基礎(chǔ)上，將普通小麥與被測(cè)系雜交，觀察F1花 粉母細(xì)胞減數(shù)分裂中期I(PMC MI)染色體構(gòu)型，可對(duì)被測(cè)系的細(xì)胞學(xué)特點(diǎn)作出初步判斷。
染色體核型分析主要是對(duì)有絲分裂中期細(xì)胞的染色體數(shù)目、大小、形狀、著絲點(diǎn)位 置、臂比和隨體有無等進(jìn)行分析，通過與標(biāo)準(zhǔn)的核型對(duì)比，鑒定外源染色體或染色體片段的 存在情況。 一些染色體特殊結(jié)構(gòu)如隨體等可作為重要細(xì)胞學(xué)標(biāo)記。核型分析對(duì)研究生物的 遺傳變異、生物的系統(tǒng)演化、物種之間的親緣關(guān)系、某些生物的起源、基因定位等都有重要 的意義，已在許多作物上得到廣泛的應(yīng)用。
(3)生化方法鑒定 隨著生化技術(shù)的不斷改進(jìn)和完善以及生化遺傳學(xué)的建立，大量控制蛋白質(zhì)合成的 基因已被準(zhǔn)確地定位在小麥及其近緣物種的染色體和染色體臂上。種子貯藏蛋白和同工酶 是檢測(cè)小麥中外源物質(zhì)常用的生化標(biāo)記。 小麥種子貯藏蛋白主要分為醇溶蛋白(Gliadin)和谷蛋白(Glutenin)兩類，它們 能比較準(zhǔn)確地反映小麥的基因類型。貯藏蛋白電泳特別是反向高效液相色譜技術(shù)和高效毛 細(xì)管電泳技術(shù)能有效地檢測(cè)小麥中的外源染色體。 同功酶表達(dá)譜是鑒定普通小麥中外源染色體的常用和有效的方法。小麥的7個(gè)部 分同源群染色體長、短臂都有特異性同功酶位點(diǎn)被確定，利用不同物種或染色體組在同功 酶位點(diǎn)上的差異以及多態(tài)性，可檢測(cè)不同異源染色體的附加、代換或易位，并初步確定外源 染色體與小麥的部分同源關(guān)系。
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(4)原位雜交鑒定 近年來迅速發(fā)展的原位雜交技術(shù)使精確識(shí)別小麥背景中的外源染色體成為可能。
根據(jù)所用探針的不同可將原位雜交分為5類。第一類是用外源種屬特異的彌散重復(fù)序列作
探針；第二類是用非種屬特異的重復(fù)序列作探針，在原位雜交中不同物種產(chǎn)生不同的帶型，
根據(jù)帶型的改變檢測(cè)外源染色體。第三類是用單拷貝或寡拷貝DNA序列作探針，在麥類作
物上的應(yīng)用才剛剛開始。第四類是基因組DNA作探針的基因組原位雜交(GISH)，它已成為
鑒定異源染色質(zhì)的主要手段之一。目前已成功地用于鑒定轉(zhuǎn)入小麥背景中的大麥、黑麥、披
堿草、大賴草、偃麥草染色體和染色體片段；第五類是多色原位雜交，它可以同時(shí)區(qū)分和鑒
別添加到小麥遺傳背景中的不同外源染色體，使結(jié)果更為簡捷直觀，它的建立大大推動(dòng)了
染色體物理圖譜的構(gòu)建，而且也是兩個(gè)或兩個(gè)以上物種雜交后代的鑒定及多倍體物種起源
和進(jìn)化研究的一種重要手段。 (5)分子標(biāo)記鑒定 近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)不斷得到完善和成熟，相繼出 現(xiàn)了限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)、簡單序列重復(fù)(SSR)和擴(kuò) 增片段長度多態(tài)性(AFLP)等多種分子標(biāo)記技術(shù)。這些技術(shù)方法可以更加精確可靠地檢測(cè) 鑒定小麥中滲入的少量外源遺傳物質(zhì)，彌補(bǔ)了染色體顯帶技術(shù)和原位雜交技術(shù)只能鑒定較 大片段的外源染色體的缺點(diǎn)。 植物基因組研究進(jìn)程的不斷加快以及小麥分子標(biāo)記遺傳圖譜的日趨飽和，使更多 的簡單快捷的分子標(biāo)記不斷被開發(fā)出來，這將為精確鑒定小麥背景下的外源染色體特別是 小片段易位提供了極大的便利。
具體實(shí)施例方式(1)形態(tài)學(xué)鑒定 建立在特定表型性狀基礎(chǔ)上的形態(tài)標(biāo)記是檢測(cè)外源遺傳物質(zhì)最簡便、最基礎(chǔ)的方 法。 一般參照雙親的形態(tài)特征，根據(jù)后代的表型特點(diǎn)確定是否存在外源基因。目前已在部 分小麥近緣物種山羊草、黑麥、簇毛麥、彭梯卡偃麥草等中找到了其特定染色體的形態(tài)標(biāo)記 性狀。但真正可以應(yīng)用的表型性狀較少。
(2)細(xì)胞學(xué)鑒定 細(xì)胞學(xué)鑒定是利用小麥與其近緣種在染色體數(shù)目、形態(tài)、大小和聯(lián)會(huì)行為等方面 的差異進(jìn)行比較分析。在染色體數(shù)目鑒定的基礎(chǔ)上，將普通小麥與被測(cè)系雜交，觀察F工花 粉母細(xì)胞減數(shù)分裂中期I(PMC MI)染色體構(gòu)型，可對(duì)被測(cè)系的細(xì)胞學(xué)特點(diǎn)作出初步判斷。
染色體核型分析主要是對(duì)有絲分裂中期細(xì)胞的染色體數(shù)目、大小、形狀、著絲點(diǎn)位 置、臂比和隨體有無等進(jìn)行分析，通過與標(biāo)準(zhǔn)的核型對(duì)比，鑒定外源染色體或染色體片段的 存在情況。 一些染色體特殊結(jié)構(gòu)如隨體等可作為重要細(xì)胞學(xué)標(biāo)記。核型分析對(duì)研究生物的 遺傳變異、生物的系統(tǒng)演化、物種之間的親緣關(guān)系、某些生物的起源、基因定位等都有重要 的意義，已在許多作物上得到廣泛的應(yīng)用。 染色體顯帶技術(shù)的發(fā)展為鑒定外源染色體或染色體片段提供了行之有效的手段。 自從Caspersson等創(chuàng)造熒光分帶技術(shù)以來，現(xiàn)已發(fā)展了多種染色體分帶技術(shù)，如C-帶、 G-帶、9_帶、R-帶等。C-分帶技術(shù)在小麥及其親緣物種的核型分析、染色體組鑒別、外源染
5色質(zhì)鑒定等方面有著廣泛的應(yīng)用。目前利用c-分帶技術(shù)已建立起了普通小麥、黑麥、大麥、 簇毛麥、大賴草、鵝觀草及披堿草等物種的c-分帶核型，并在鑒定小麥的異附加系、代換系
和易位系等方面發(fā)揮了重要作用。
(3)生化方法鑒定 隨著生化技術(shù)的不斷改進(jìn)和完善以及生化遺傳學(xué)的建立，大量控制蛋白質(zhì)合成 的基因已被準(zhǔn)確地定位在小麥及其近緣物種的染色體和染色體臂上(Payne， 1982， 1984 ; Gale， 1988)。種子貯藏蛋白和同工酶是檢測(cè)小麥中外源物質(zhì)常用的生化標(biāo)記。
小麥種子貯藏蛋白主要分為醇溶蛋白(Gliadin)和谷蛋白(Glutenin)兩 類，它們能比較準(zhǔn)確地反映小麥的基因類型。貯藏蛋白電泳特別是反向高效液相色譜 (Reversed-phaseHigh-performance Liquid Chromatography簡禾爾RP-HP1X)技術(shù)禾口高效毛 細(xì)管電泳(High-performance C即illary Electrophoresis簡稱HPCE)技術(shù)能有效地檢測(cè) 小麥中的外源染色體(Tao，1991 ;丁斌等，2003 ;王黎明等，2005)。 同功酶表達(dá)譜是鑒定普通小麥中外源染色體的常用和有效的方法(Hart， 1983)。
小麥的7個(gè)部分同源群染色體長、短臂都有特異性同功酶位點(diǎn)被確定(Gale， 1988)，利用不
同物種或染色體組在同功酶位點(diǎn)上的差異以及多態(tài)性，可檢測(cè)不同異源染色體的附加、代
換或易位，并初步確定外源染色體與小麥的部分同源關(guān)系(高明君，1992 ;滕曉月，1995 ;李
平路等，2003)。 (4)原位雜交鑒定 近年來迅速發(fā)展的原位雜交技術(shù)使精確識(shí)別小麥背景中的外源染色體成為可 能。根據(jù)所用探針的不同可將原位雜交分為5類。第一類是用外源種屬特異的彌散重復(fù) 序列作探針，目前已從黑麥屬(Secale) (Bedbrook et al 1980 ;A卯els et al 1981,1986 ; Mcintyre et al 1990 ;Guidet etal 1991)、簇毛麥屬(Haynaldia) (Pace et al 1992)、薄 冰草屬(Thinopyrum) (Zhang and Dvorakl990)、披減草屬(Elymus) (Tsujimoto and Gill 1991)等種屬中分離出物種?；腄NA重復(fù)序列，并成功地用于導(dǎo)入的外源遺傳物質(zhì)的檢 測(cè)(L即itan et al，1986;Kim et al，1993;Li etal，1995)。第二類是用非種屬特異的重 復(fù)序列作探針，在原位雜交中不同物種產(chǎn)生不同的帶型，根據(jù)帶型的改變檢測(cè)外源染色體 (Biagetti et al， 1999)。第三類是用單拷貝或寡拷貝DNA序列作探針，在麥類作物上的應(yīng) 用才剛剛開始。第四類是基因組DNA作探針的基因組原位雜交(GISH)，它已成為鑒定異源 染色質(zhì)的主要手段之一。
(5)分子標(biāo)記鑒定 近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)不斷得到完善和成熟，相繼出
現(xiàn)了限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)、簡單序列重復(fù)(SSR)和
擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFLP)等多種分子標(biāo)記技術(shù)。這些技術(shù)方法可以更加精確可靠地檢
測(cè)鑒定小麥中滲入的少量外源遺傳物質(zhì)(魯玉柱，2002 ;毛龍，1994 ;王新望，2001 ;王秀娥，
2001 ;IqbalM. J. ， 1995 ;Sharp et al，1989;Peil et al， 1997 ;萬平，2002 ;周兗晨，2001)，
彌補(bǔ)了染色體顯帶技術(shù)和原位雜交技術(shù)只能鑒定較大片段的外源染色體的缺點(diǎn)。 植物基因組研究進(jìn)程的不斷加快以及小麥分子標(biāo)記遺傳圖譜的日趨飽和，使更多
的簡單快捷的分子標(biāo)記不斷被開發(fā)出來，這將為精確鑒定小麥背景下的外源染色體特別是
小片段易位提供了極大的便利。
權(quán)利要求
普通小麥背景中外源遺傳物質(zhì)的鑒定主要包括(1)形態(tài)學(xué)鑒定建立在特定表型性狀基礎(chǔ)上的形態(tài)標(biāo)記是檢測(cè)外源遺傳物質(zhì)最簡便、最基礎(chǔ)的方法。一般參照雙親的形態(tài)特征，根據(jù)后代的表型特點(diǎn)確定是否存在外源基因。目前已在部分小麥近緣物種山羊草、黑麥、簇毛麥、彭梯卡偃麥草等中找到了其特定染色體的形態(tài)標(biāo)記性狀。但真正可以應(yīng)用的表型性狀較少。(2)細(xì)胞學(xué)鑒定細(xì)胞學(xué)鑒定是利用小麥與其近緣種在染色體數(shù)目、形態(tài)、大小和聯(lián)會(huì)行為等方面的差異進(jìn)行比較分析。在染色體數(shù)目鑒定的基礎(chǔ)上，將普通小麥與被測(cè)系雜交，觀察F1花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂中期I(PMC MI)染色體構(gòu)型，可對(duì)被測(cè)系的細(xì)胞學(xué)特點(diǎn)作出初步判斷。染色體核型分析主要是對(duì)有絲分裂中期細(xì)胞的染色體數(shù)目、大小、形狀、著絲點(diǎn)位置、臂比和隨體有無等進(jìn)行分析，通過與標(biāo)準(zhǔn)的核型對(duì)比，鑒定外源染色體或染色體片段的存在情況。一些染色體特殊結(jié)構(gòu)如隨體等可作為重要細(xì)胞學(xué)標(biāo)記。核型分析對(duì)研究生物的遺傳變異、生物的系統(tǒng)演化、物種之間的親緣關(guān)系、某些生物的起源、基因定位等都有重要的意義，已在許多作物上得到廣泛的應(yīng)用。(3)生化方法鑒定隨著生化技術(shù)的不斷改進(jìn)和完善以及生化遺傳學(xué)的建立，大量控制蛋白質(zhì)合成的基因已被準(zhǔn)確地定位在小麥及其近緣物種的染色體和染色體臂上。種子貯藏蛋白和同工酶是檢測(cè)小麥中外源物質(zhì)常用的生化標(biāo)記。小麥種子貯藏蛋白主要分為醇溶蛋白(Gliadin)和谷蛋白(Glutenin)兩類，它們能比較準(zhǔn)確地反映小麥的基因類型。貯藏蛋白電泳特別是反向高效液相色譜技術(shù)和高效毛細(xì)管電泳技術(shù)能有效地檢測(cè)小麥中的外源染色體。同功酶表達(dá)譜是鑒定普通小麥中外源染色體的常用和有效的方法。小麥的7個(gè)部分同源群染色體長、短臂都有特異性同功酶位點(diǎn)被確定，利用不同物種或染色體組在同功酶位點(diǎn)上的差異以及多態(tài)性，可檢測(cè)不同異源染色體的附加、代換或易位，并初步確定外源染色體與小麥的部分同源關(guān)系。(4)原位雜交鑒定近年來迅速發(fā)展的原位雜交技術(shù)使精確識(shí)別小麥背景中的外源染色體成為可能。根據(jù)所用探針的不同可將原位雜交分為5類。第一類是用外源種屬特異的彌散重復(fù)序列作探針；第二類是用非種屬特異的重復(fù)序列作探針，在原位雜交中不同物種產(chǎn)生不同的帶型，根據(jù)帶型的改變檢測(cè)外源染色體。第三類是用單拷貝或寡拷貝DNA序列作探針，在麥類作物上的應(yīng)用才剛剛開始。第四類是基因組DNA作探針的基因組原位雜交(GISH)，它已成為鑒定異源染色質(zhì)的主要手段之一。目前已成功地用于鑒定轉(zhuǎn)入小麥背景中的大麥、黑麥、披堿草、大賴草、偃麥草染色體和染色體片段；第五類是多色原位雜交，它可以同時(shí)區(qū)分和鑒別添加到小麥遺傳背景中的不同外源染色體，使結(jié)果更為簡捷直觀，它的建立大大推動(dòng)了染色體物理圖譜的構(gòu)建，而且也是兩個(gè)或兩個(gè)以上物種雜交后代的鑒定及多倍體物種起源和進(jìn)化研究的一種重要手段。(5)分子標(biāo)記鑒定近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)不斷得到完善和成熟，相繼出現(xiàn)了限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)、簡單序列重復(fù)(SSR)和擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFLP)等多種分子標(biāo)記技術(shù)。這些技術(shù)方法可以更加精確可靠地檢測(cè)鑒定小麥中滲入的少量外源遺傳物質(zhì)，彌補(bǔ)了染色體顯帶技術(shù)和原位雜交技術(shù)只能鑒定較大片段的外源染色體的缺點(diǎn)。植物基因組研究進(jìn)程的不斷加快以及小麥分子標(biāo)記遺傳圖譜的日趨飽和，使更多的簡單快捷的分子標(biāo)記不斷被開發(fā)出來，這將為精確鑒定小麥背景下的外源染色體特別是小片段易位提供了極大的便利。
全文摘要
對(duì)轉(zhuǎn)移進(jìn)普通小麥背景中的外源遺傳物質(zhì)進(jìn)行鑒定，可以對(duì)其跟蹤、評(píng)價(jià)其遺傳效應(yīng)，提高對(duì)其選擇的準(zhǔn)確性和利用效率。近年來，已經(jīng)建立了形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、分子生物學(xué)標(biāo)記和生化標(biāo)記等多種鑒定外源遺傳物質(zhì)的方法和技術(shù)，特別是分子標(biāo)記和分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，使外源遺傳物質(zhì)的鑒定及外源基因的定位和識(shí)別變得更為方便可靠。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK101760545SQ200810238640
公開日2010年6月30日 申請(qǐng)日期2008年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月19日
發(fā)明者李祥 申請(qǐng)人:李祥