專利名稱:雙羰基還原酶突變體及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域：
，具體涉及一種可用作手性醇合成催化劑的雙羰基還原酶(diketoreductase, DKR)的突變體。
背景技術：
生物催化是迄今為止人類所知的最高效和最具有選擇性的催化體系。生物體中的酶能以超出人們想象的高速度催化各種生化反應。酶不僅在生物體內，也能在生物體外促進天然和人工合成的化學分子的諸多轉換反應，并且顯示出優(yōu)良的化學選擇性、區(qū)域選擇性和立體選擇性。與傳統(tǒng)的化學合成相比，生物催化反應所要求的的反應條件一般比較溫和常溫、常壓、中性或者接近中性pH。因此，生物催化是最有發(fā)展前景的“綠色”合成手段之一。
對134種工業(yè)的生物轉化進行分析，發(fā)現水解酶(44% )和生物催化的氧化還原 (30% )是最常見的工業(yè)應用，其中有89%是生物合成手性化合物(參見Curr Org Chem, 2010，14 :1447-1460)。在大量的手性化合物中，具有光學活性的手性醇是一類重要的中間化合物，廣泛應用于手性藥物、農藥以及其他手性化學品的合成。現在獲得這些手性醇化合物的一個重要的方法，就是通過脫氫酶和還原酶生物催化還原相應的手性前體酮而得到。 不過，現在人們所掌握并能應用的酶的數量還很有限，使得很多手性醇的合成反應還沒有找到合適的生物催化劑。例如，2-氯-1-苯乙醇是一種重要的手性β-鹵代仲醇，其取代基團上的鹵素易于脫去，可作為手性藥物前體參與構成手性環(huán)氧化物以及氨基醇類(參見 Chiral chemistry (2004) 24)。在工業(yè)生產中，一般利用Baker，s Yeast由α-氯乙酰苯還原生成(R) -2-氯-1-苯乙醇(參見=Tetrahedron (1991) 47 :2073-2080)。(S) -2-氯-1-苯乙醇則可以由海洋真菌催化α-氯乙酰苯的還原反應而得到。然而，這類海洋真菌的催化條件比較苛刻，只有在類似海水的環(huán)境中才能產生活性，且產率和立體選擇性都較差(參見=Biotechnol Lett (2009) 31 :1559-1563)。目前，可用于催化α-氯乙酰苯生成高光學純度2-氯-1-苯乙醇的酶鮮有報道。
公開號為CN 1014^514Α的中國發(fā)明專利申請公開說明書公開了一種可用于制備3R，5S-雙羥基化合物的雙羰基還原酶。所述雙羰基還原酶能夠催化雙羰基化合物的還原反應，例如使3，5_ 二羰基-6-芐氧基-己酸乙酯生成3R，5S- 二羥基-6-芐氧基-己酸乙酯，同時該生物催化反應具有高度立體選擇性(參見=Nature Precedings. http://hdl. handle. net/10101/npre. 2008. 1697. 1 Acta Biochim Biophys Sin. (Shanghai) (2009)41 :163-170)。隨后，而et al.也對雙羰基還原酶的底物譜進行了研究，發(fā)現該酶在催化單羰基底物還原的反應中也是良好的催化劑(Sl=Tetrahedr0n: Asymmetry (2009) 20 =2504-2509) 不過，在催化α -氯乙酰苯生成2-氯-1-苯乙醇的反應中，表現出來的立體選擇性較差，僅能獲得ee為3. 91%的R構型產物。
酶的催化功能可通過改變其特定的結構而改善。酶的催化活力只集中表現在酶的活性中心內的少數特異氨基酸殘基，這些是酶發(fā)揮催化作用與底物直接作用的有效基團。雙羰基還原酶是羰基還原酶中的一種。這類酶在結構上主要由兩個結構域組成，分別是與 NADH或NADPH結合的輔酶結合結構域，以及與底物結合的結構域。與底物結合的結構域由不同理化性質的氨基酸組成，決定了酶催化的底物的特異性。
因此，需要尋找和發(fā)現可提高酶立體選擇性和催化效率的雙羰基還原酶突變體。
發(fā)明內容
本發(fā)明的發(fā)明目的是提供一種雙羰基還原酶突變體，提高其立體選擇性和活性。
為達到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術方案是一種雙羰基還原酶突變體，所述雙羰基還原酶突變體的氨基酸序列與SEQ ID NO. 1 SEQ ID NO. 20所示任一氨基酸序列具有80%以上的同源性。
一種雙羰基還原酶突變體，所述雙羰基還原酶突變體的核苷酸序列與SEQID NO. 21 SEQ ID NO. 40所示任一核苷酸序列具有80%以上的同源性。
優(yōu)選的技術方案中，所述雙羰基還原酶突變體對應野生型雙羰基還原酶中的氨基酸的突變情況選自以下任意一種
(1)雙羰基還原酶的氨基酸序列中第122位的絲氨酸突變?yōu)楸彼?、半光氨酸?br>(2)雙羰基還原酶的氨基酸序列中第143位的組氨酸突變?yōu)楸彼帷①嚢彼幔?br>(3)雙羰基還原酶的氨基酸序列中第146位的天冬酰胺突變?yōu)楸彼?、絲氨酸、蘇氨酸以及谷氨酰胺；
(4)雙羰基還原酶的氨基酸序列中第147位的組氨酸突變?yōu)楸彼?、賴氨酸?br>(5)雙羰基還原酶的氨基酸序列中第149位的色氨酸突變?yōu)楸彼?、苯丙氨酸?br>(6)雙羰基還原酶的氨基酸序列中第151位的天冬酰胺突變?yōu)楸彼幔?br>(7)雙羰基還原酶的氨基酸序列中第155位的谷氨酸突變?yōu)楣劝滨０罚?br>(8)雙羰基還原酶的氨基酸序列中第194位的天冬酰胺突變?yōu)楸彼幔?br>(9)雙羰基還原酶的氨基酸序列中第222位的色氨酸突變?yōu)楸奖彼帷⒘涟彼?、蛋氨酸、酪氨酸?br>(10)雙羰基還原酶的氨基酸序列中第149位的色氨酸和第222位的色氨酸突變?yōu)?br>苯丙氨酸。
本發(fā)明同時要求保護一種重組質粒，所述重組質粒含有上述任一雙羰基還原酶突變體的編碼序列，進一步的技術方案中，將重組質粒轉化入宿主細胞而制備得到一種基因工程菌；優(yōu)選的技術方案中，所述重組質粒是pET22b(+)；所述宿主細胞是大腸桿菌Ε. coli BL21(DE3)。
上雙羰基還原酶突變體，在催化羰基化合物生成羥基產物的反應中，與野生型的雙羰基還原酶相比，具有不同的催化性質，催化活性、催化效率以及立體選擇性等發(fā)生了改變。
優(yōu)選的技術方案中，所述的222位雙羰基還原酶突變體可以作為催化劑，催化雙羰基化合物生成雙羥基產物的反應，突變體與野生型的雙羰基還原酶相比，具有更高的催化效率。
因此，本發(fā)明要求保護一種雙羰基還原酶突變體作為催化雙羰基化合物制備雙羥基產物反應的催化劑的應用，其中，所述雙羰基還原酶突變體對應野生型雙羰基還原酶中的第222位的色氨酸突變?yōu)楸奖彼?、亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸?br>上述技術方案中，所述雙羰基化合物的化學通式如下所示
權利要求
1.一種雙羰基還原酶突變體，其特征在于，所述雙羰基還原酶突變體的氨基酸序列與 SEQ ID NO. 1 SEQ ID NO. 20所示任一氨基酸序列具有80%以上的同源性。
2.一種雙羰基還原酶突變體，其特征在于，所述雙羰基還原酶突變體的核苷酸序列與 SEQ ID NO. 21 SEQ ID NO. 40所示任一核苷酸序列具有80%以上的同源性。
3.一種雙羰基還原酶突變體，其特征在于，所述雙羰基還原酶突變體對應野生型雙羰基還原酶中的氨基酸的突變情況選自以下任意一種(1)雙羰基還原酶的氨基酸序列中第122位的絲氨酸突變?yōu)楸彼?、半光氨酸?2)雙羰基還原酶的氨基酸序列中第143位的組氨酸突變?yōu)楸彼?、賴氨酸?3)雙羰基還原酶的氨基酸序列中第146位的天冬酰胺突變?yōu)楸彼?、絲氨酸、蘇氨酸以及谷氨酰胺；(4)雙羰基還原酶的氨基酸序列中第147位的組氨酸突變?yōu)楸彼?、賴氨酸?5)雙羰基還原酶的氨基酸序列中第149位的色氨酸突變?yōu)楸彼帷⒈奖彼幔?6)雙羰基還原酶的氨基酸序列中第151位的天冬酰胺突變?yōu)楸彼幔?7)雙羰基還原酶的氨基酸序列中第155位的谷氨酸突變?yōu)楣劝滨０罚?8)雙羰基還原酶的氨基酸序列中第194位的天冬酰胺突變?yōu)楸彼幔?9)雙羰基還原酶的氨基酸序列中第222位的色氨酸突變?yōu)楸奖彼?、亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸?10)雙羰基還原酶的氨基酸序列中第149位的色氨酸和第222位的色氨酸突變?yōu)楸奖彼帷?br>4.一種重組質粒，其特征在于，所述重組質粒含有權利要求
1 3中任一雙羰基還原酶突變體的編碼序列。
5.一種基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌含有權利要求
4所述重組質粒。
6.一種雙羰基還原酶突變體作為催化雙羰基化合物制備雙羥基產物反應的催化劑的應用，其特征在于，所述雙羰基還原酶突變體對應野生型雙羰基還原酶中的第222位的色氨酸突變?yōu)楸奖彼?、亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸?br>7.根據權利要求
6所述雙羰基還原酶突變體作為催化雙羰基化合物制備雙羥基產物反應的催化劑的應用，其特征在于，所述雙羰基化合物的化學通式如下所示
8.一種雙羰基還原酶突變體作為催化α-鹵代苯乙酮還原成手性醇的催化劑的應用， 其特征在于，所述雙羰基還原酶突變體對應野生型雙羰基還原酶中的第222位的色氨酸突變?yōu)楸奖彼?、亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸?br>9.根據權利要求
8所述雙羰基還原酶突變體作為催化α-鹵代苯乙酮還原成手性醇的催化劑的應用，其特征在于，所述α -鹵代苯乙酮的化學通式如下所示
專利摘要
本發(fā)明屬于生物技術領域：
，具體涉及一種可用作手性醇合成催化劑的雙羰基還原酶(diketoreductase,DKR)的突變體；本發(fā)明公開了一種雙羰基還原酶突變體，所述雙羰基還原酶突變體的氨基酸序列與SEQIDNO.1~SEQIDNO.20所示任一氨基酸序列具有80%以上的同源性。和野生型雙羰基還原酶相比本發(fā)明所述雙羰基還原酶突變體具有更高的轉化效率，更高的立體選擇性。
文檔編號C12N1/21GKCN102277338SQ201110220127
公開日2011年12月14日 申請日期2011年8月2日
發(fā)明者祁建洲, 陸卓, 陳依軍, 黃彥 申請人:中國藥科大學導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan