專(zhuān)利名稱:一種載有人胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅰ基因的重組轉(zhuǎn)基因載體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種能表達(dá)人胰島素樣生長(zhǎng)因子-1的重組轉(zhuǎn)基因載體，以及利用轉(zhuǎn)基因家蠶絲腺生物工廠表達(dá)人胰島素樣生長(zhǎng)因子-1的方法。
背景技術(shù)：
人胰島素樣生長(zhǎng)因子-1 (IGF-1)是一種受GH調(diào)節(jié)的單鏈多肽，由70個(gè)氨基酸組成，分子量為7 649 Da，其結(jié)構(gòu)有45%與胰島素相似。IGF-1有種系穩(wěn)定性，所有哺乳類(lèi)動(dòng)物的IGF-1結(jié)構(gòu)及組成基本相同。IGF-1具有多種生理功能，有促生長(zhǎng)、促物質(zhì)代謝、促細(xì)胞分裂增殖等作用。臨床上可用于糖尿病、胰島素抵抗、肥胖癥、分解代謝亢進(jìn)性疾病、株儒癥、腎功能不全和神經(jīng)系統(tǒng)疾病等治療。
目前，對(duì)于IGF-1的基因藥物的開(kāi)發(fā)研究，主要采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)或者酵母菌表達(dá)系統(tǒng)或昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)或人工提取(參見(jiàn):[1]吳嵐曉，李明，王萍，陳白虹，人胰島素樣生長(zhǎng)因子-1在大腸桿菌中的表達(dá)，藥物生物技術(shù)，2001，4:8-11 ; [2]Fischer B， Sumner Lj Goodenough P， et al; Isolation,renaturation and formationof disulfide bonds of eukaryotic proteins expressed in Escherichia coli asinclusion bodies ;Biotechnology and Bioengineering; 1993 年；[3]賴心田，周鵬，洪葵；人胰島素樣生長(zhǎng)因子I在畢赤氏酵母中的表達(dá)研究，藥物生物技術(shù)；2002年03期；[4]趙紅，汪承亞，昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)重組人胰島素樣生長(zhǎng)因子I的研究，南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)-2000，20 (4)243-245)ο
上述方法各有特點(diǎn):
(I)酵母菌表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)量低，且存在酵母特異的碳水化合物分枝；而大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)對(duì)表達(dá)產(chǎn)物無(wú) 后加工修飾作用，表達(dá)產(chǎn)物的天然性差，工藝復(fù)雜，成本高；一般的昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)物可能有桿狀病毒的污染，大規(guī)模培養(yǎng)昆蟲(chóng)細(xì)胞的工藝還不成熟，且培養(yǎng)成本高；
(2)人工提取法:公開(kāi)號(hào)為CN1603344、CN1757650的中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公布說(shuō)明書(shū)公開(kāi)了一種從鮮鹿茸提取胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-1)的方法，該方法的受到鮮鹿茸資源的限制；
(3)公開(kāi)號(hào)為CN1384201的中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公布說(shuō)明書(shū)公開(kāi)了一種利用重組桿狀病毒在昆蟲(chóng)體內(nèi)特別在家蠶內(nèi)表達(dá)、生產(chǎn)重組人類(lèi)胰島素生長(zhǎng)因子一 I (IGF — I)，并用所生產(chǎn)的人類(lèi)胰島素生長(zhǎng)因子制備口服降血糖的方法，該方法需構(gòu)建帶有IGF -1基因的重組桿狀病毒，將該重組病毒通過(guò)人工接種方式感染家蠶從而實(shí)現(xiàn)IGF -1的表達(dá)。這種方式可以制備口服藥物，但其工藝復(fù)雜，重組病毒需要通過(guò)人工皮下接種方式感染家蠶，處理工作量大，同時(shí)，獲得的產(chǎn)物中存在殘留重組桿狀病毒的可能性，具有難以預(yù)測(cè)的風(fēng)險(xiǎn)性；
(4)公開(kāi)號(hào)為CN101023778的中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公布說(shuō)明書(shū)公開(kāi)了一種制備富含IGF-1的柞蠶粉，并作為仔豬飼料添加劑的方法。公開(kāi)號(hào)為CN101270367的中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公布說(shuō)明書(shū)公開(kāi)了一種家蠶絲腺生物工廠的建立方法，并用轉(zhuǎn)基因絲腺凍干粉制作口服降糖藥物的方法，但選用絲蛋白啟動(dòng)子不帶有信號(hào)肽相應(yīng)的DNA序列，外源基因在絲腺組織中的表達(dá)水平較低，用絲腺組織制成的凍干粉含有外源重組DNA的污染，具有難以預(yù)測(cè)的風(fēng)險(xiǎn)性。
因此，需要研發(fā)一種能提高外源基因IGF -1在家蠶絲腺中表達(dá)量的方法，同時(shí)能較少其他外源重組基因的污染，避免桿狀病毒帶來(lái)危險(xiǎn)，提高安全性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明目的是提供一種能表達(dá)人胰島素樣生長(zhǎng)因子-1的重組轉(zhuǎn)基因載體。
為達(dá)到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種載有人胰島素樣生長(zhǎng)因子-1基因的重組轉(zhuǎn)基因載體，所述重組轉(zhuǎn)基因載體包括:外源基因人胰島素樣生長(zhǎng)因子-1 (IGF-1)、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子元件；其特征在于:構(gòu)建所述重組轉(zhuǎn)基因載體的轉(zhuǎn)座子為piggyBAC轉(zhuǎn)座子；所述啟動(dòng)子為絲素重鏈/從-H蛋白啟動(dòng)子，并且該啟動(dòng)子帶有下游信號(hào)肽相應(yīng)的DNA序列；所述的增強(qiáng)子為絲素輕鏈/i6-L基因第I內(nèi)含子的部分序列；重組轉(zhuǎn)基因載體還包括:絲素重鏈蛋白啟動(dòng)子下游信號(hào)肽相應(yīng)的DNA序列、家蠶絲素輕鏈/^-LpolyA信號(hào)位點(diǎn)的序列。
上述技術(shù)方案中，所述重組轉(zhuǎn)基因載體還包括:新霉素抗性基因。
上述技術(shù)方案中, 所述piggyBAC轉(zhuǎn)座子載體優(yōu)選為pigA3GFP轉(zhuǎn)座子載體,因?yàn)樗鰌igA3GFP轉(zhuǎn)座子載體帶有熒光蛋白報(bào)告基因，方便篩選。
上述技術(shù)方案中，所述載有人胰島素樣生長(zhǎng)因子-1基因的重組轉(zhuǎn)基因載體的制備方法為:通過(guò)基因工程操作將家蠶絲素重鏈蛋白啟動(dòng)子及其下游信號(hào)肽相應(yīng)的DNA序列控制的人類(lèi)胰島素生長(zhǎng)因子-1基因的表達(dá)盒、增強(qiáng)子元件和新霉素抗性基因表達(dá)盒克隆進(jìn)piggyBAC轉(zhuǎn)座子載體pigA3GFP構(gòu)建重組轉(zhuǎn)基因載體；具體包括以下步驟:
(I)制備 I 基因；
(2)將IGF-1基因克隆進(jìn)過(guò)渡空質(zhì)粒，制備載有IGF-1基因的過(guò)渡載體A ；
(3)制備絲素輕鏈基因的polyA信號(hào)序列，并克隆到過(guò)渡載體A中，得到過(guò)渡載體B ；
(4)制備絲重鏈基因啟動(dòng)子及其下游信號(hào)肽相應(yīng)的DNA序列Fib-HS，并克隆進(jìn)過(guò)渡空質(zhì)粒，制備得到載有Fib-HS基因的過(guò)渡載體C ；
(5)以過(guò)渡載體B為模板，PCR擴(kuò)增含有IGF-1基因和polyA信號(hào)序列的基因片段，然后克隆到過(guò)渡載體C中，得到過(guò)渡載體D ;
(6) PCR擴(kuò)增得到絲素輕鏈基因第I內(nèi)含子中具有增強(qiáng)子功能的的序列，構(gòu)建帶有增強(qiáng)子元件的基于piggyBAC轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)基因載體pigA3GFP-en ；
(7)酶切過(guò)渡載體D，回收絲素重鏈蛋白啟動(dòng)子及其下游信號(hào)肽相應(yīng)的DNA序列控制IGF-1基因片段，克隆進(jìn)同樣酶切的pigA3GFP-en獲pigA3GFP-en-[FibHS-1GF-p0lyA]，即得到帶有增強(qiáng)子元件和絲素重鏈蛋白啟動(dòng)子及其下游信號(hào)肽相應(yīng)的DNA序列控制IGF-1基因的轉(zhuǎn)基因載體；
(8)制備家蠶核型多角體病毒見(jiàn)-2基因啟動(dòng)子，克隆進(jìn)過(guò)渡空質(zhì)粒，制得含家蠶核型多角體病毒見(jiàn)-7基因啟動(dòng)子的過(guò)渡載體E ;制備N(xiāo)eo基因的編碼序列及其下游的PolyA信號(hào)序列，雙酶切后克隆進(jìn)同樣雙酶切的過(guò)渡載體E，制得帶有家蠶核型多角體病毒IE-1基因啟動(dòng)子控制新霉素抗性基因neo的重組載體，即過(guò)渡載體F ；
(9)過(guò)渡載體F酶切后回收帶有IE啟動(dòng)子控制新霉素抗性基因的片段IE-Neo，克隆進(jìn)同樣酶切的pigA3GFP-en-[FibHS-1GF-polyA]質(zhì)粒，即制得有絲素重鏈蛋白啟動(dòng)子及其下游信號(hào)肽相應(yīng)的DNA序列控制IGF-1基因表達(dá)盒、增強(qiáng)子元件、新霉素抗性基因和熒光蛋白報(bào)告基因的重組轉(zhuǎn)基因載體，命名為pigA3-FibHS-1GF-en-ne0。
上述技術(shù)方案中，步驟(I)制備I基因的方法為:根據(jù)公開(kāi)的人胰島素樣生長(zhǎng)因子-1基因的CDNA序列，按常規(guī)人工合成人胰島素樣生長(zhǎng)因子-1活性肽對(duì)應(yīng)的DNA序列；優(yōu)選地的技術(shù)方案中，為了便于克隆表達(dá)，在5'端引入起始密碼子ATG和EcoR V的酶切位點(diǎn)，3'端引入終止密碼子TAA和沿ο 1、III的酶切位點(diǎn)；
上述技術(shù)方案中，步驟(2)制備載有I基因的過(guò)渡載體A的方法為:將步驟⑴人工合成的I基因序列用V和通ο I雙酶切，常規(guī)法回收酶切片段，與用
V和沿ο I雙酶切的pBluescript II SK(+)質(zhì)粒連接，得到連接產(chǎn)物；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TGl菌株中，通過(guò)藍(lán)白斑培養(yǎng)篩選獲得重組轉(zhuǎn)化子，從陽(yáng)性菌斑中提取質(zhì)粒DNA,即得已成功克隆了 IGF-1基因的過(guò)渡載體A，過(guò)渡載體A又命名為pSK_IGF。
上述技術(shù)方案中，步驟(3)具體包括以下步驟:以家蠶菁松品種的基因組DNA為模板，以TPFib-L-3，TPFib-L-4為引物，擴(kuò)增出絲素輕鏈基因的polyA信號(hào)序列，該片段經(jīng)通ο I和命I雙酶切后，與同樣雙酶切的pSK-1GF載體連接，獲得重組載體pSK-1GF-polyA,即為過(guò)渡載體B ；
其中，引物TPFib-L-3 的序列如 SEQ ID N0.1 所示:ggc tcg age aaa ttg tgtttg cgt tag g ;弓丨物 TPFib-L-4 的序列如 SEQ ID N0.2 所不:gcg gta ccc act gtc caatcc acc gtc。
上述技術(shù)方案中，步驟⑷具體包括以下步驟:以家蠶皓月品種的基因組DNA為模板，以TS-Fib-H-1和Fib-HS-2為引物，通過(guò)常規(guī)PCR擴(kuò)增絲重鏈基因啟動(dòng)子及其下游信號(hào)肽相應(yīng)的DNA序列Fib-HS，F(xiàn)ib-HS用油a I和歷./ (! III雙酶切后定向克隆進(jìn)用同樣雙酶切WpBluescriptII SK (+)載體，獲得重組質(zhì)粒pSK-FibHS，即為過(guò)渡載體C ;
其中，弓丨物TS-Fib-H-1 的序列如 SEQ ID N0.3 所示:gcTCTAGAgaattcgagaatgtctggacag (下劃線示I位點(diǎn)，斜體部分示AF226688序列的61950至61965 位的核苷酸)；引物 Fib-HS-2 的序列如 SEQ ID N0.4 所示:CGAAGCTTGGATCCGACATkCTGCAGAGCGCAGCACAAGATCAC (下劃線示歷/ d III /Βαιπ I 位點(diǎn)，斜體部分為 AF226688 序列的62456至62479位的核苷酸的互補(bǔ)序列，下劃線部分與斜體部分中間的“GACATA”為/YA-H基因的第二外顯子5’端起始核苷酸的互補(bǔ)序列)。
上述技術(shù)方案中，步驟(5)具體包括以下步驟:以重組載體pSK-1GF-polyA為模板，以TS-1GF-1-2和TPFib-L-4為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)奴111和命/ 1雙酶切后，克隆進(jìn)PSK-FibHS的位點(diǎn)獲pSK-HS-1GF-polyA重組質(zhì)粒；
其中，引物TS-1GF-1 -2 的序列如 SEQ ID N0.5 所示:TTAGATCTATGGGA CCGGAGACGCTC (下劃線示奴7II酶切位點(diǎn))，引物TPFib-L-4的序列如 SEQ ID N0.6 所示:5’-GCGGTACC CACTGTCCAATCCACCGTC-3’ (下劃線元、KpnI位點(diǎn))。
上述技術(shù)方案中，步驟(6)具體為:以家蠶菁松品種的基因組DNA為模板，以TPFib-L-5和TPFib-L-6為引物，常規(guī)PCR擴(kuò)增得到絲素輕鏈基因第I內(nèi)含子中具有增強(qiáng)子功能的的序列，經(jīng)I和V雙酶切后，克隆進(jìn)經(jīng)I和5)胳I雙酶切的pigA3GFP質(zhì)粒，獲得帶有增強(qiáng)子元件的基于PiggyBAC轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)基因載體，命名為pigA3GFP-en ；
其中，引物TPFib-L-5 的序列如 SEQ ID N0.7 所示:cgc tcg ag a tat cta tggget cca gta acc ;34ljTPFib-L-6 的序列如 SEQ ID N0.8所不:gcg tcg acg gtc agg ttagat taa egg g。
上述技術(shù)方案中，步驟(7)具體為:pSK-HS-1GF-polyA用&oRI和命/ 1酶切，回收絲素重鏈蛋白啟動(dòng)子及其下游信號(hào)肽相應(yīng)的DNA序列控制IGF-1基因片段，克隆進(jìn)同樣酶切的 pigA3GFP-en 獲 pigA3GFP-en-[FibHS_IGF-polyA]；
上述技術(shù)方案中，步驟⑶具體為:以家蠶核型多角體病毒的DNA為模板，用TiW基因啟動(dòng)子的特異性引物對(duì)IE-1-1和IE-1-2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物用I ,EcoR V雙酶切后，克隆在pBluescript II SK(+)載體，獲得帶有家蠶核型多角體病毒TiW基因啟動(dòng)子的載體pSK-1E，即過(guò)渡載體E ；
以pCDNA3.1載體(Invitron公司產(chǎn)品)為模板，以Neol和Neo3為引物，PCR擴(kuò)增出Neo基因的編碼序列及其下游的polyA信號(hào)序列(約IlOObp),備Xho 1、EcoR V酶切消化后，克隆進(jìn)經(jīng)過(guò)同樣處理的PSK-1E載體中，獲得pSK-1E-Neo載體，即過(guò)渡載體F ；
其中，用TiW基因啟動(dòng)子的特異性引物IE-1-1序列如SEQ ID N0.9:5’TTCGAATTCGATTTGCAGTTCGGGAC3’，引物 IE-1-2 序列如 SEQ ID N0.10:5’ GCGGATATCAGTCGTTTGGTTGTTCA3’ ；
引物Neol 如 SEQ ID N0.11 所示:5' CTGATATCATGATTGAACAAGA TGG3/ ;引物Neo3 如 SEQ ID N0.12 所示:5' AGCTCGAGAATTCTAGCTAGAG GTC GAC3'。
上述技術(shù)方案中，步驟(9)具體為:pSK-1E-Neo載體用I酶切，回收帶有IE啟動(dòng)子控制新霉素抗性基因的片段IE-Neo，克隆進(jìn)同樣酶切的pigA3GFP-en-[FibHS-1GF-polyA]質(zhì)粒，即制得帶有絲素重鏈蛋白啟動(dòng)子及其下游信號(hào)肽相應(yīng)的DNA序列控制IGF-1基因表達(dá)盒、增強(qiáng)子元件、新霉素抗性基因和熒光蛋白報(bào)告基因的重組轉(zhuǎn)基因載體，命名為pigA3-FibHS-1GF-en-neo。
上述的技術(shù)方案中所述的熒光蛋白報(bào)告基因可以為綠色熒光蛋白基因，也可以是紅色熒光蛋白基因。
進(jìn)一步的技術(shù)方案中，將上述載有人胰島素樣生長(zhǎng)因子-1基因的重組轉(zhuǎn)基因載體與輔助質(zhì)粒作混合，導(dǎo)入初產(chǎn)卵，孵化，篩選獲得帶有新霉素抗性基因、熒光蛋白報(bào)告基因的家蠶，檢測(cè)到I基因，育種制成轉(zhuǎn)基因家蠶，得到一種家蠶絲腺生物反應(yīng)器；優(yōu)選地，所述載有人胰島素樣生長(zhǎng)因子-1基因的重組轉(zhuǎn)基因載體為pigA3-FibHS-1GF-en_neo0
因此，本發(fā)明同時(shí)要求保護(hù)一種可以表達(dá)外源基因I的家蠶絲腺生物反應(yīng)器，所述家蠶絲腺生物反應(yīng)器以家蠶為載 體，反應(yīng)器通過(guò)上述載有人胰島素樣生長(zhǎng)因子-1基因的重組轉(zhuǎn)基因載體介導(dǎo)獲得；所述載有人胰島素樣生長(zhǎng)因子-1基因的重組轉(zhuǎn)基因載體優(yōu)選為 pigA3-FibHS-1GF-en_neo。[0043]本發(fā)明的另一目的是提供一種制備口服降糖藥物的方法。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是，一種采用上述家蠶絲腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)口服降糖藥物的方法，采用上述技術(shù)方案獲得的轉(zhuǎn)基因家蠶的絲腺組織經(jīng)冷凍干燥后制成藥物。
或者，一種采用上述家蠶絲腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)口服降糖藥物的方法，收集上述技術(shù)方案獲得的轉(zhuǎn)基因家蠶的蠶繭，粉碎后制成藥物。
因此，本發(fā)明同時(shí)要求保護(hù)采用上述技術(shù)方案獲得的轉(zhuǎn)基因家蠶的絲腺組織的冷凍干燥物；采用上述技術(shù)方案獲得的轉(zhuǎn)基因家蠶的蠶繭。
本發(fā)明同時(shí)要求保護(hù)采用上述技術(shù)方案獲得的轉(zhuǎn)基因家蠶的絲腺組織的冷凍干燥物在制備降糖藥物的應(yīng)用；采用上述技術(shù)方案獲得的轉(zhuǎn)基因家蠶的蠶繭在制備降糖藥物的應(yīng)用。
由于上述技術(shù)方案運(yùn)用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn):
1.本發(fā)明通過(guò)采用piggyBAC轉(zhuǎn)座子可以獲得絲素蛋白基因啟動(dòng)子及其下游信號(hào)肽相應(yīng)的DNA序列控制的IGF-1基因，并在后部絲腺組織特異性分泌表達(dá)的轉(zhuǎn)基因家蠶，表達(dá)的重組IGF-1通過(guò)腺腔隨著吐絲進(jìn)入繭層。不僅用轉(zhuǎn)基因家蠶絲腺組織制備的口服制劑有明確的藥效，而且用轉(zhuǎn)基因家蠶的蠶繭制成的口服制劑也有明確的藥效。有關(guān)家蠶絲腺工廠分泌表達(dá)、生產(chǎn)I的轉(zhuǎn)基因家蠶及轉(zhuǎn)基因家蠶絲腺組織、蠶繭制備成口服制劑的方法是首創(chuàng)。
2.本發(fā)明由于采用轉(zhuǎn)基因家蠶制備藥物，獲得的藥物中不會(huì)有桿狀病毒殘留，生物安全性高。
3.本發(fā)明通過(guò)分泌表達(dá)可提高外源基因的表達(dá)水平。
`[0052]4.本發(fā)明通過(guò)分泌表達(dá)可簡(jiǎn)化轉(zhuǎn)基因家蠶絲腺組織制藥工藝。
5.本發(fā)明利用轉(zhuǎn)基因家蠶蠶繭制藥，可以避免外源重組DNA的污染，安全性更高，且蠶繭中的絲蛋白有輔助治療作用。


圖1為實(shí)施例一步驟7中的pigA3-FibHS-1GF-en_neo質(zhì)粒的酶切鑒定；其中，M: DNA Marker; 1: pigA3-FibHS-1GF-en_neo 質(zhì)粒用酶切；2:pigA3-FibHS-1GF-en_neo 質(zhì)粒用酶切；用酶切可檢測(cè)到 IE-Neo 片段(1.7kb)，用 EcoRl/Kpnl 酶切可檢測(cè)到 IE-Neo 片段(1.7kb)和 FibHS-1GF-polyA 片段(1.1kb)；
圖2為實(shí)施例一步驟8中篩選出的抗G418、帶有熒光蛋白報(bào)告基因的家蠶；
圖3為實(shí)施例一步驟9中G9、GlO和Gll代轉(zhuǎn)基因蠶的IGF-1基因PCR檢測(cè)；其中，M:DNA Marker ;泳道1、2和3分別為G9、GlO和Gll代的IGF-1基因PCR檢測(cè)。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述:
實(shí)施例一:絲素重鏈蛋白基因啟動(dòng)子及其下游信號(hào)肽相應(yīng)的DNA序列控制的IGF-1基因的轉(zhuǎn)基因家蠶的制備[0059]技術(shù)操作過(guò)程如下:
1.1GF-1基因的制備
根據(jù)業(yè)已公開(kāi)的人胰島素樣生長(zhǎng)因子-1基因的cDNA序列，按常規(guī)人工合成人胰島素樣生長(zhǎng)因子-1活性肽對(duì)應(yīng)的DNA序列(SEQ ID N0.15)，為了便于克隆表達(dá)，在5'端弓I入起始密碼子ATG和&oR V的酶切位點(diǎn)，3'端引入終止密碼子TAA和Xho 1、Hiη III的酶切位點(diǎn)。
SEQ ID N0.15:TGGATATCATGggaccggagacgctctgcggggctgagctggtg gatgctcttagttcgtgtgtggagacaggggcttttatttcaacaagcccacagggtatggctccagcagtcggagggcgcctcagacaggcatcgtggatgagtgctgcttccggagctgtgatctaaggaggctggagatgtattgcgcacccctcaagcctgccaagtcagctTAAGCTT CTCGAGAT
2.構(gòu)建帶有cDNA基因的pBluescript II SK⑴重組質(zhì)粒
將人工合成的DNA序列用V和通ο I雙酶切，常規(guī)法回收酶切片段，與用EcoR V 和 Xho I 雙酶切的 pBluescript II SK (+)質(zhì)粒(Stratagene 公司產(chǎn)品)連接。T4 DNA連接酶為GIBCO BRL公司產(chǎn)品，連接條件為16°C，12小時(shí)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TGl菌株，通過(guò)藍(lán)白斑培養(yǎng)篩選獲得重組轉(zhuǎn)化子，小批量提取質(zhì)粒DNA (參見(jiàn)《分子克隆》，1989，科學(xué)出版社)，用&01 V和Xho I酶切鑒定,有一條約230bp的片段被克隆,經(jīng)測(cè)序證明已成功克隆了 IGF-1基因，所獲得的重組質(zhì)粒稱之為pSK-1GF。
3.絲素重鏈蛋白啟動(dòng)子及其下游信號(hào)肽相應(yīng)的DNA序列控制IGF-1基因的載體構(gòu)建
以家蠶菁松品種的基因組DNA為模板，以TPFib-L-3 (SEQ ID N0.1 ggc tcgage aaa ttg tgt ttg cgt tag g), TPFib-L-4 (SEQ ID N0.2 gcg gta ccc act gtccaa tcc acc gtc)為引物,擴(kuò)增出290bp的片段,測(cè)序證明為絲素輕鏈基因的polyA信號(hào)序列，該片段經(jīng)通ο I和命/7 I雙酶切后，與同樣酶切的pSK-1GF載體連接，獲得重組載體pSK-1GF-polyA。
參照GenBank中已公開(kāi)的家蠶絲素重鏈基因/ifH (登錄號(hào):AF226688)的啟動(dòng)子及其下游序列設(shè)計(jì)引物 TS-Fib-H-1:SEQ ID N0.3:gcTCTAGAgaattccagaatstctsmcas:(下劃線示油al/^boR I位點(diǎn)，斜體部分示AF226688序列的61950至61965位的核苷酸)和 Fib-HS-2: SEQ ID N0.4:CQkkQCTTQQkTCCQkCkTkCTGCAGAGCGCAGCACAAGATCAC(下劃線元、HinA III /BamW I位點(diǎn)，下劃線和斜體部分之間的部分表示fibi基因的第二外顯子5’端起始核苷酸的互補(bǔ)序列，斜體部分為AF226688序列的62456至62479位的核苷酸的互補(bǔ)序列。
以家蠶皓月品種的基因組DNA為模板，以TS-Fib-H-1和Fib_HS_2為引物，通過(guò)常規(guī)PCR擴(kuò)增獲得550bp左右的片段(Fib-HS)，經(jīng)序列測(cè)定證實(shí)為絲重鏈基因啟動(dòng)子及其下游序列；Fib-HS用I和"i/ d III雙酶切后定向克隆進(jìn)用同樣的雙酶切pBluescriptllSK (+)載體，獲得重組質(zhì)粒pSK-FibHS。
根據(jù)合成的IGF序列設(shè)計(jì)引物TS-1GF-1 _2:SEQ ID N0.5:TTAGATCTATGGGACCGGAGACGCTC (下劃線示Bsl 11酶切位點(diǎn))，參照GenBank中已公開(kāi)的家蠶絲素輕鏈fib-L全序列(登錄號(hào):M76430)設(shè)計(jì)克隆/^-LpolyA加尾信號(hào)序列的PCR引物 TPFib-L-4:SEQ ID N0.6:5’ -GCGGTACCCACTGTCCAATCCACCGTC-3’ (下劃線示 Kpn I 位點(diǎn))，以重組載體pSK-1GF-polyA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)|111和治雙酶切后，克隆進(jìn)pSK-FibHS的位點(diǎn)獲pSK-HS-1GF-polyA重組質(zhì)粒。
4.帶有增強(qiáng)子元件的基于piggyBAC轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建
以家蠶菁松品種的基因組DNA為模板，以TPFib-L-5 (SEQ ID N0.7:cgc tcg aga tat cta tgg get cca gta acc)和 TPFib-L-6 (SEQ ID N0.8:gcg tcg acg gtc aggtta gat taa egg g)為引物，常規(guī)PCR擴(kuò)增，獲得絲素輕鏈基因第I內(nèi)含子中具有增強(qiáng)子功能的400bp左右的序列，Sal I和V雙酶切后，克隆進(jìn)經(jīng)Sal I和Sma I雙酶切的PigA3GFP 質(zhì)粒(參見(jiàn) Cary, L.C.et al.Transposon mutagenesis of baculoviruses:analysis of Trichoplusia ni transposon IFP2 insertions within the FP-1ocus ofnuclear polyhedrosis viruses.Virology, 1989, 172:1565.帶有增強(qiáng)子元件和絲素重鏈蛋白啟動(dòng)子及其下游信號(hào)肽相應(yīng)的DNA序列控制IGF-1基因的轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建
pSK-HS-1GF-polyA用&0RI和命I酶切，回收絲素重鏈蛋白啟動(dòng)子及其下游信號(hào)肽相應(yīng)的DNA序列控制IGF-1基因片段，克隆進(jìn)同樣酶切的pigA3GFP-en獲pigA3GFP-en-[FibHS-1GF-polyA]
6.構(gòu)建帶有家蠶核型多角體病毒I·E-1基因啟動(dòng)子控制新霉素抗性基因neo的重組載體
以家蠶核型多角體病毒的DNA為模板，用TiW基因啟動(dòng)子的特異性引物對(duì)IE-1-1 (SEQ ID N0.9:5’TTCGAATTCGATTTGCAGTTCGGGAC3’)和 IE-1-2 (SEQ ID N0.10:5’ GCGGATATCAGTCGTTTGGTTGTTCA3’ )進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物用 &oR I ,BcoR V 雙酶切后，克隆在pBluescript II SK(+)載體，獲得帶有家蠶核型多角體病毒見(jiàn)-2基因啟動(dòng)子的載體pSK-1E
以pcDNA3.1 載體(Invitron 公司產(chǎn)品)為模板，以 Neol (SEQ ID N0.11:5' CTGATATCATGATTGAACAAGATGG3')和 Neo3 (SEQ ID N0.12:5' AGCTCGAGAATTCTAGCTAGAGGTCGAC3 / )為引物，PCR擴(kuò)增出Neo基因的編碼序列及其下游的polyA信號(hào)序列(約IIOObp)，經(jīng)通ο 1、FcoR V酶切消化后，克隆進(jìn)經(jīng)過(guò)同樣處理的pSK-1E載體中，獲得pSK-1E-Neo 載體。
7.構(gòu)建帶有絲素重鏈蛋白啟動(dòng)子及其下游信號(hào)肽相應(yīng)的DNA序列控制IGF-1基因表達(dá)盒、增強(qiáng)子元件、新霉素抗性基因和熒光蛋白報(bào)告基因的重組轉(zhuǎn)基因載體
pSK-1E-Neo載體用I酶切，回收帶有IE啟動(dòng)子控制新霉素抗性基因的片段IE-Neo，克隆進(jìn)同樣酶切的pigA3GFP-en-[FibHS-1GF-p0lyA]質(zhì)粒，獲的重質(zhì)粒命名為pigA3-FibHS-1GF-en_neo0
8.精子介導(dǎo)法獲得帶有熒光報(bào)告基因GFP和新霉素抗性的轉(zhuǎn)基因家蠶
家蠶品種為菁松品種，正常飼養(yǎng)至化蛾。
將pigA3-FibHS-1GF-en_neo 及輔助質(zhì)粒(參見(jiàn) Tamura Toshik1.et al.Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L.using a piggyBactransposon-derived vector.Nature Biotechnology, 2000，18:81-84)按 1:1 混合(混合濃度2 μ g/μ L)，用毛細(xì)管玻璃針以1.5^2.0 μ 7只注入處女蛾交尾囊，正常交配，產(chǎn)卵，孵化后的蟻蠶(Gtl)連續(xù)添食10000 μ g/mL的G418至4齡眠，結(jié)合熒光倒置顯微鏡檢測(cè)，篩選出抗G418、帶有熒光蛋白報(bào)告基因的家蠶，保留具有明顯熒光顯示的家蠶(轉(zhuǎn)基因家蠶)，進(jìn)后IGF-1基因檢測(cè)和常規(guī)家蠶育種。
9.轉(zhuǎn)基因家蠶的I基因PCR檢測(cè)
針刺取少量熒光家蠶的血淋巴(約20 μ L血淋巴/每頭)，加500 μ L TE緩沖液(ρΗ8.0)，加500 μ L過(guò)飽和苯酚(ρΗ8.0)作用10分鐘，12 OOOrpm離心10分鐘，取上清，再用過(guò)飽和酚提取一次，加氯仿:異戊醇(24:1)作用10分鐘，12 OOOrpm離心10分鐘，取上清加2倍體積無(wú)水冷乙醇，混合均勻，置_20°C，2小時(shí)后再用12 OOOrpm離心10分鐘，棄上清，用70%乙醇洗沉淀，12 OOOrpm離心I分鐘，棄上清，自然干燥，沉淀用10 μ L TE緩沖液溶解，獲家蠶基因組總DNA。
以提取蠶血淋巴總DNA作為模板，用IGF-1基因的特異性引物T-1GFl(SEQ ID N0.13:TGGATATCATGGGACCGGAG ACGCTCTGC)和 T-1GF2 (SEQ ID N0.14:ATCTCGAGAAGCTTAAGCTGACTTGGCAGGCTTG)進(jìn)行PCR檢測(cè)，同時(shí)設(shè)正常家蠶為陰性對(duì)照，
pigA3-FibHS-1GF-en-neo 質(zhì)粒 DNA 為陽(yáng)性對(duì)照。PCR 檢測(cè)顯示，在 G。、G1' G2, G3、......Gll
等代均可擴(kuò)增出230bp左右的I特異片段，陰性對(duì)照無(wú)該片段產(chǎn)生，表明I基因已進(jìn)入家蠶基因組，并穩(wěn)定遺傳。
10.轉(zhuǎn)基因 家蠶絲腺I(mǎi)表達(dá)產(chǎn)物檢測(cè)
解剖取轉(zhuǎn)基因家蠶，取新鮮后部絲腺組織，制成凍干粉。取適量的凍干粉組織裂解液(10 % 甘油，2.5% SDS，巰基乙醇 5%，625mmol/L Tris-Cl pH6.8)中，4°C 過(guò)夜。12000rpm，4°C離心lOmin，取上清，用ELISA法，按檢測(cè)試劑盒(博士德，武漢博士德生物工程有限公司)說(shuō)明書(shū)測(cè)定IGF-1的表達(dá)水平，同設(shè)正常家蠶后部絲腺對(duì)照，結(jié)果表明，家蠶后部絲腺凍干粉中hIGF-1的含量為19.18 μ g/g凍干粉。
取轉(zhuǎn)基因家蠶蠶繭適量，采用堿性水脫膠法[張雨青.蠶絲脫膠方法的比較分析.蠶業(yè)科學(xué)，2002，28 (I): 75-79]，將蠶繭置于ρΗΙΟ.5的ddH20, IOO0C煮沸1-1.5h，脫膠，脫膠后的絲素，米用 Ajisawa’s 法溶解[Ajisawa A.Dissolution of silk fibroin withcalciumchloride/ethanol aqueous solution [J].Seric Sci >/ ，1998，67:91-94]。收集溶解液，透析48 h后，定容至100ml，稀釋100倍后進(jìn)行ELISA檢測(cè)。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因蠶繭中hIGF-Ι的水平為1.84 μ g/g蠶繭。
實(shí)施例二: 口服型絲腺凍干粉囊膠制備及生物活性試驗(yàn)
收集轉(zhuǎn)I基因的家蠶的后部絲腺，經(jīng)勻漿后，用紗布過(guò)濾去除粗雜質(zhì)，冷凍干燥成粉劑原料，將原料粉按每kg加水IL的比例溶解，經(jīng)18 000 rpm離心I小時(shí)，取上清，再經(jīng)冷凍干燥后成精原料粉，原料粉裝入膠囊，制成口服型絲腺凍干粉膠囊?？诜徒z腺凍干粉膠囊經(jīng)小鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，口服家蠶后部絲腺凍干粉I周后可顯著降低鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的血糖水平，下降幅度在13.43%-34.76%。且下降幅度呈現(xiàn)口服劑量依賴。
實(shí)施例三:口服型蠶繭粉囊膠制備及生物活性試驗(yàn)
轉(zhuǎn)基因家蠶蠶繭削繭去蛹后，剪碎繭殼，磨碎成粉后裝入膠囊，制成口服型蠶繭粉膠囊，口服型蠶繭粉膠囊經(jīng)小鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，口服蠶繭粉10天后可顯著降低鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的血糖水平，下降幅度在49.66%左右。且下降幅度呈現(xiàn)口服劑量依賴。核苷酸和/或氨基酸序列表<110>蘇州大學(xué)
〈120〉一種載有人胰島素樣生長(zhǎng)因子-1基因的重組轉(zhuǎn)基因載體及其應(yīng)用〈160〉 15
<170> PatentIn version 3.5
〈210〉 I〈211〉 28〈212〉 DNA〈213〉人工合成
〈400〉 I
ggctcgagca aattgtgttt gcgttagg28
〈210〉 2〈211〉 27〈212〉 DNA〈213〉人工合成
〈400〉 2
gcggtaccca ctgtccaatc caccgtc27
〈210〉 3〈211〉 30〈212〉 DNA〈213〉人工合成
〈400〉 3
gctctagaga attcgagaat gtctggacag30
〈210〉 4〈211〉 44〈212〉 DNA〈213〉人工合成
〈400〉 4
cgaagcttgg atccgacata ctgcagagcg cagcacaaga tcac44
權(quán)利要求
1.一種載有人胰島素樣生長(zhǎng)因子-1基因的重組轉(zhuǎn)基因載體，所述重組轉(zhuǎn)基因載體包括:外源基因人胰島素樣生長(zhǎng)因子-1、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子元件；其特征在于:構(gòu)建所述重組轉(zhuǎn)基因載體的轉(zhuǎn)座子為PiggyBAC轉(zhuǎn)座子；所述啟動(dòng)子為絲素重鏈fib-w蛋白啟動(dòng)子，并且該啟動(dòng)子帶有下游信號(hào)肽相應(yīng)的DNA序列，絲素重鏈fib-H蛋白啟動(dòng)子及其下游信號(hào)肽相應(yīng)的DNA序列是以家蠶皓月品種的基因組DNA為模板，以TS-Fib-H-1和Fib_HS_2為引物，通過(guò)常規(guī)PCR擴(kuò)增獲得，TS-Fib-H-1的序列如SEQ ID N0.3所示，F(xiàn)ib-HS-2的序列如SEQID N0.4所示；所述的增強(qiáng)子為絲素輕鏈/從-L基因第I內(nèi)含子的部分序列，是以家蠶菁松品種的基因組DNA為模板，以TPFib-L-5和TPFib_L_6為引物，通過(guò)常規(guī)PCR擴(kuò)增獲得，TPFib-L-5的序列如SEQ ID N0.7所示，TPFib-L-6的序列如SEQ ID N0.8所示；家蠶絲素輕鏈/從-LpolyA信號(hào)位點(diǎn)的序列、新霉素抗性基因；重組轉(zhuǎn)基因載體帶有家蠶核型多角體病毒IE-1基因啟動(dòng)子控制新霉素抗性基因。
2.權(quán)利要求
1所述載有人胰島素樣生長(zhǎng)因子-1基因的重組轉(zhuǎn)基因載體的制備方法，其特征在于:通過(guò)基因工程操作將家蠶絲素重鏈蛋白啟動(dòng)子及其下游信號(hào)肽相應(yīng)的DNA序列控制的人類(lèi)胰島素生長(zhǎng)因子-1基因的表達(dá)盒、增強(qiáng)子元件和帶有家蠶核型多角體病毒IE-1基因啟動(dòng)子控制的新霉素抗性基因表達(dá)盒克隆進(jìn)PiggyBAC轉(zhuǎn)座子載體構(gòu)建得到重組轉(zhuǎn)基因載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求
2所述制備載有人胰島素樣生長(zhǎng)因子-1基因的重組轉(zhuǎn)基因載體的方法，其特征在于:具體包括以下步驟: (1)制備I基因； (2)將I基因克隆進(jìn)過(guò)渡空質(zhì)粒，制備載有I基因的過(guò)渡載體A; (3)制備絲素輕鏈基因的polyA信號(hào)序列，并克隆到過(guò)渡載體A中，得到過(guò)渡載體B； (4)制備絲素重鏈基因啟·動(dòng)子及其下游信號(hào)肽相應(yīng)的DNA序列Fib-HS，并克隆進(jìn)過(guò)渡空質(zhì)粒，制備得到載有Fib-HS基因的過(guò)渡載體C，所述Fib-HS是以家蠶皓月品種的基因組DNA為模板，以TS-Fib-H-1和Fib-HS-2為引物，通過(guò)常規(guī)PCR擴(kuò)增獲得，TS-Fib-H-1的序列如SEQ ID N0.3所示，F(xiàn)ib-HS-2的序列如SEQ ID N0.4所示； (5)以過(guò)渡載體B為模板，PCR擴(kuò)增含有IGF-1基因和polyA信號(hào)序列的基因片段，然后克隆到過(guò)渡載體C中，得到過(guò)渡載體D ； (6)PCR擴(kuò)增得到絲素輕鏈基因第I內(nèi)含子中具有增強(qiáng)子功能的的序列，構(gòu)建帶有增強(qiáng)子元件的基于piggyBAC轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)基因載體pigA3GFP-en,所述序列是以家蠶菁松品種的基因組DNA為模板，以TPFib-L-5和TPFib_L_6為引物，通過(guò)常規(guī)PCR擴(kuò)增獲得，TPFib-L-5 的序列如 SEQ ID N0.7 所示，TPFib-L-6 的序列如 SEQ ID N0.8 所示； (7)酶切過(guò)渡載體D，回收絲素重鏈蛋白啟動(dòng)子及其下游信號(hào)肽相應(yīng)的DNA序列控制的 IGF-1 基因片段，克隆進(jìn)同樣酶切的pigA3GFP-en獲pigA3GFP-en-[FibHS-1GF-polyA]，即得到帶有增強(qiáng)子元件和絲素重鏈蛋白啟動(dòng)子及其下游信號(hào)肽相應(yīng)的DNA序列控制IGF-1基因的轉(zhuǎn)基因載體； (8)制備家蠶核型多角體病毒見(jiàn)-2基因啟動(dòng)子，克隆進(jìn)過(guò)渡空質(zhì)粒，制得含家蠶核型多角體病毒IE-1基因啟動(dòng)子的過(guò)渡載體E ;制備N(xiāo)eo基因的編碼序列及其下游的polyA信號(hào)序列，雙酶切后克隆進(jìn)同樣雙酶切的過(guò)渡載體E，制得帶有家蠶核型多角體病毒見(jiàn)-1基因啟動(dòng)子控制新霉素抗性基因neo的重組載體，即過(guò)渡載體F ；(9)過(guò)渡載體F酶切后回收帶有IE-1啟動(dòng)子控制新霉素抗性基因的片段IE-Neo，克隆進(jìn)同樣酶切的pigA3GFP-en-[FibHS-1GF-p0lyA]質(zhì)粒，即制得有絲素重鏈蛋白啟動(dòng)子及其下游信號(hào)肽相應(yīng)的DNA序列控制IGF-1基因表達(dá)盒、增強(qiáng)子元件、新霉素抗性基因和熒光蛋白報(bào)告基因的重組轉(zhuǎn)基因載體，命名為pigA3-FibHS-1GF-en-ne0。
4.應(yīng)用權(quán)利要求
1所述載有人胰島素樣生長(zhǎng)因子-1基因的重組轉(zhuǎn)基因載體制備家蠶絲腺生物反應(yīng)器的方法，其特征在于:將權(quán)利要求
1所述載有人胰島素樣生長(zhǎng)因子-1基因的重組轉(zhuǎn)基因載體與輔助質(zhì)粒作混合，導(dǎo)入初產(chǎn)卵，孵化，篩選獲得帶有新霉素抗性基因、熒光蛋白報(bào)告基因的家蠶，檢測(cè)到I基因，育種制成轉(zhuǎn)基因家蠶，得到一種家蠶絲腺生物反應(yīng)器。
5.一種生產(chǎn)口服降糖藥物的方法，其特征在于，采用權(quán)利要求
4獲得的轉(zhuǎn)基因家蠶的絲腺組織經(jīng)冷凍干燥后制成藥物。
6.—種生產(chǎn)口服降糖藥物的方法，其特征在于，收集權(quán)利要求
4獲得的轉(zhuǎn)基因家蠶的蠶繭，粉碎后制成藥物?！?br>專(zhuān)利摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種載有人胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅰ基因的重組轉(zhuǎn)基因載體，所述重組轉(zhuǎn)基因載體包括外源基因人胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅰ、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子元件；構(gòu)建所述重組轉(zhuǎn)基因載體的轉(zhuǎn)座子為piggyBAC轉(zhuǎn)座子；所述啟動(dòng)子為絲素重鏈蛋白啟動(dòng)子；所述重組轉(zhuǎn)基因載體還包括絲素重鏈蛋白啟動(dòng)子下游信號(hào)肽相應(yīng)的DNA序列、家蠶絲素輕鏈fib-LpolyA信號(hào)位點(diǎn)的序列。應(yīng)用該重組轉(zhuǎn)基因載體制備得到生產(chǎn)IGF-Ⅰ的轉(zhuǎn)基因家蠶，可以提高IGF-Ⅰ的表達(dá)水平，并且避免外源基因和桿狀病毒的不安全性。
文檔編號(hào)A61P3/10GKCN102250935 B發(fā)布類(lèi)型授權(quán) 專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)朇N 201110142537
公開(kāi)日2013年9月4日 申請(qǐng)日期2011年5月30日
發(fā)明者貢成良, 曹廣力, 薛仁宇, 鄭小堅(jiān), 潘中華 申請(qǐng)人:蘇州大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專(zhuān)利引用 (2), 非專(zhuān)利引用 (2),