專利名稱：:一種芳香烴羥化酶系統(tǒng)及應用的制作方法一種芳香烴羥化酶系統(tǒng)及應用
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種酶系統(tǒng)及應用，尤其涉及一種芳香烴羥化酶系統(tǒng)及應用。
背景技術(shù)：
：芳香烴類化合物是一類重要的環(huán)境污染物，它們廣泛來源于石油冶煉、農(nóng)藥生產(chǎn)、印染化工、汽車尾氣等工農(nóng)業(yè)的生產(chǎn)、運輸?shù)雀鱾€過程。芳香烴類化合物對環(huán)境的污染是人們關(guān)注的重點,不僅因為它具有較強的毒性和抗降解能力,而且一些芳烴具有致畸、致癌、致突變的作用,并可在生物體內(nèi)富積。環(huán)境中常見的芳香烴化合物根據(jù)其化學結(jié)構(gòu)來分，主要有苯、甲苯、二甲苯等結(jié)構(gòu)簡單的單環(huán)芳烴化合物、硝基取代芳香烴化合物、鹵化硝基取代芳香經(jīng)化合物、多環(huán)芳香烴化合物(PAH)及重質(zhì)多環(huán)化合物(HMWPAH)及其衍生物等。目前主要采用物理、化學和生物方法對環(huán)境污染進行處理，其中生物法因具有處理成本低、操作簡便、污染物降解效果好、不易引起二次污染等特點而得到廣泛應用。利用微生物的降解作用來消除芳香烴類化合物對環(huán)境的影響是環(huán)境治理的一條有效途徑。長久以來，人們從各個角度研究微生物對芳香烴類化合物的降解，包括高效降解微生物的篩選和分離、芳香烴化合物的降解途徑、微生物降解的遺傳學研究，芳香族化合物的定量結(jié)構(gòu)與生物降解相關(guān)性等等。但是，芳香烴化合物來源廣泛，種類多樣，另一方面，自然界中能夠降解芳香烴類化合物的微生物種屬也是多種多樣，每種微生物的降解機理都是千差萬別，要全面而詳細地闡明芳香烴類化合物的微生物降解是相當困難的。從目前分離的微生物種類來看，絕大部分屬于細菌。微生物降解芳香烴類化合物的分子機制和基因水平的研究是目前的熱點之一，歐美、日本等多個國家已經(jīng)在這方面取得一些的進展，但對于整個降解途徑的系統(tǒng)的闡述還有待于進一步的研究。國內(nèi)在這個領(lǐng)域的研究還基本處于宏觀層面，對于基因功能的研究較少報道。普遍認為，微生物對芳香烴的降解因其作用環(huán)境而分為有氧降解和厭氧降解。有氧降解以分子氧作為最終電子受體,而厭氧降解以除氧以外的物質(zhì)如硝酸鹽、硫酸鹽、二氧化碳或鐵等作為最終電子受體。對于單環(huán)芳香類化合物的降解研究表明，常規(guī)培養(yǎng)的好氧微生物能產(chǎn)生混合功能的氧化酶或雙氧化酶,這些酶在分子氧的參與下,使苯環(huán)羥基化,并進一步引發(fā)芳環(huán)裂解，所以能有效地降解芳香烴化合物。土壤中石油芳香烴降解速率因化學結(jié)構(gòu)的不同而不同。苯、酚、萘、甲苯、鄰胺基苯酸、扁桃酸等經(jīng)微生物氧化分解，生成兒茶酚；而苯甲酸、m-甲酚、m-硝基苯酸、p-硝基苯酸、p-甲氧基苯酸、奎尼酸、莽草酸、香草酸等，經(jīng)微生物氧化降解為原兒茶酚，有少量m-甲酚可通過另一途徑降解為龍膽酸。微生物對芳香烴降解的起始途徑是多樣的，但關(guān)鍵性的中間產(chǎn)物具有一致性。鄰苯二羥基類化合物兒茶酚和原兒茶酚就是大多數(shù)芳香化合物在微生物代謝過程中的中間產(chǎn)物，又是環(huán)開裂前共同的先導性中間產(chǎn)物(ChaudhryGR，ChakrabartyAM，Biodegradationofhalogenatedorganiccompounds.Microbiol.Rev.1991.55:59-79，Gibson,D.T"andV.Subramanian.1984,Microbialdegradationofaromatichydrocarbons,p.181-252.InD.T.Gibson(ed)，Microbialdegradationoforganiccompounds.MarcelDekker，Inc.,NewYork.)。關(guān)鍵性中間產(chǎn)物進一步的生物降解途徑也是多樣的，兒苯酚和原兒茶酚的環(huán)若按鄰位斷開，生成(3-酮己二酸，然后進一步代謝；兒茶酚和原兒茶酚的環(huán)若按間位斷開,則生成丙酮酸和乙醛。目前已報道的單環(huán)芳香烴羥化酶主要有以下三大類單一組分的黃素羥化酶、二蛋白或多蛋白單加氧酶催化。這些酶系統(tǒng)大多由還原酶和單加氧酶組成。還原酶使黃素還原，單加氧酶利用還原的黃素使芳香底物羥基化。這種羥基化作用常見于有氧降解途徑的起始步驟。第一種被純化的羥化酶來源于尸"^/omo"os.，&fe，較小的蛋白與FAD緊密結(jié)合，較大的蛋白是羥基化作用偶聯(lián)蛋白。已報道與NADH的反應和與氧、底物的反應發(fā)生在黃素蛋白組分上。戶/w^fe中HPAH的機制似乎與單組分的芳香黃素蛋白羥化酶機制類似，只是前者需要兩個蛋白。第二種羥化酶系統(tǒng)分離于五.co//『，它包含一個黃素還原酶，其催化產(chǎn)生還原性FAD被轉(zhuǎn)移到大的羥化酶上使其芳香組分羥基化。在這一反應中，黃素還原酶可被不同的黃素還原酶替換。第三種羥化酶系統(tǒng)分離于尸"wdowo"oswe"(io"'"a，它除了包含一個較小的還原酶組分和一個較大的加氧酶組分之外，還包含一個在電子傳遞鏈中連接還原酶和加氧酶的鐵氧化還原蛋白。該羥化酶系統(tǒng)通過還原酶催化生成的NADH使鐵氧化還原蛋白酶被還原傳遞電子到終端加氧酶催化底物發(fā)生雙加氧作用。目前關(guān)于單環(huán)芳香烴羥化酶基因的專利報道主要有徐玉泉等人報道了一種苯酚羥化酶基因及其用途(專利公開號CN1500802A)，公開了一種可將苯酚轉(zhuǎn)化為鄰苯二酚的代謝編碼基因；陳國強等人報道了一種表達苯環(huán)雙加氧酶的工程菌及其應用(專利公開號CN1869200A)，公開了一種苯環(huán)雙加氧酶的專用表達工程菌與該工程菌在生產(chǎn)順-1，2-二羥基-3，5-環(huán)己二烯中的應用。鑒定過的芳香烴羥化酶基因相關(guān)文章主要有尸sewt/固o"as/7wf油、￡^c/ze"'c/z/aco/z,禾口v4"'weto6a"erZa簡朋m7中p-輕基苯乙酸3-羥化酶(HPAH)(Arunachalam,U.，Massey,V.,andVaidyanathan,C.S.1992.J.Biol.Chem.267，25848—25855;Galan，B.,Diaz，E.，Prieto,M.A.，andGarcia,J.L.2000.J.Bacteriol.182，627—636;Chaiyen,P.,Suadee,C.,andWilairat，P.2001.Eur.J.Biochem.268，5550—5561),Wearaf/zermc^/zz'/z^BR219禾口5acz'〃wsAermog/Mcow'fias/wA7中苯酚夢5"(七酶(PheA)(Kim,I.C.,andOriel，RJ.1995.Appl.Environ.Microbiol.61,1252—1256;Kirchner,U.,Westphal，A.H.，Muller,R.,andvanBerkel,W.J.H.2003.J.Biol.Chem.278，47545~47553)，5w狄o/^W(3ce/ac/aAC1100中氯酚畫4-單加氧酶(Gisi，M.R.，andXun，L.2003.J.Bacteriol.185,2786—2792),Aa&to"/fle^ra//zaJMP134中2，4，6-三氯苯酚單加氧酶(Louie,T.M.，Webste,C.M.,andXun，L.2002.J.Bacteriol.184,3492—3500),iWococ，中吡咯-2-羧酸酯單加氧酶(Becker,D.，Schrader,T.,andAndreesen,J.R.1997.Eur.J.Biochem.249,739—747)，尸^wfifowo"osVLB120中苯乙烯單加氧酶(Otto，K.，Hofstetter，K.,Rothlisberger,M.，Witholt，B,，andSchmid,A.2004.J.Bacteriol.186,5292—5302;Kantz,A.，Chin,R,Nallamothu,N,，Nguyen，T.,andGassner，G.T.2005.Arch.Biochem.Biophys.442，102—116),5ac/〃z^/zaen'cws中p-石肖基苯酚羥化酶(Kadiyala,V.，andSpain,J.C.1998.Appl.Environ.Microbiol.64，2479—2484)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個目的是提供一種芳香烴羥化酶系統(tǒng)，其包括NADH依賴的FMN還原酶，F(xiàn)AD合成酶和芳香族化合物羥化酶。其中上述的NADH依賴的FMN還原酶、FAD合成酶和芳香族化合物羥化酶的編碼基因依次分別具有a)SEQIDNO:1、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示的核苷酸序列；或b)不同于SEQIDNO:1、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3但編碼的氨基酸序列與SEQIDNO:1、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所編碼的氨基酸序列相同的核苷酸序列；或c)在嚴格雜交條件下與所述的a)或b)中的序列雜交，并且編碼具有活性的所述的芳香烴羥化酶系統(tǒng)的核苷酸序列。上述的NADH依賴的FMN還原酶、FAD合成酶和芳香族化合物羥化酶具有d)上述a)、b)或c)所述的核苷酸序列編碼的氨基酸序列；或e)SEQIDNO:4、SEQIDNO:5和或f)上述e)中缺失、替換或插入一個或多個氨基酸后、并且具有所述的NADH依賴的FMN還原酶、FAD合成酶和芳香族化合物羥化酶的活性的氨基酸序列。本發(fā)明的較佳實施例中，上述的芳香烴羥化酶系統(tǒng)于嗜熱脫氮芽孢桿菌NG80-2中分離得到。本發(fā)明的較佳實施例中，上述的芳香烴羥化酶系統(tǒng)的底物包括鄰氨基苯甲酸、2-羥基苯乙酸、4-羥基苯乙酸、水楊酸中的至少一種，其中最適底物是鄰氨基苯甲酸。本發(fā)明的較佳實施例中，上述的芳香烴羥化酶系統(tǒng)的反應溫度為25°C-100°C，其中最適反應溫度為6(TC。本發(fā)明的較佳實施例中，上述的芳香烴羥化酶系統(tǒng)的反應pH值為3.2-11.0，其中最適反應pH值為9.0。本發(fā)明的另一目的是提供一種表達芳香烴羥化酶系統(tǒng)的重組質(zhì)粒，其至少包括上述的NADH依賴的FMN還原酶、FAD合成酶和芳香族化合物羥化酶的編碼基因。本發(fā)明的較佳實施例中，上述的重組質(zhì)粒的載體為pET-28a(+)。本發(fā)明的另一目的是提供一種產(chǎn)生芳香烴羥化酶系統(tǒng)的重組菌，其中導入了上述的NADH依賴的FMN還原酶、FAD合成酶和芳香族化合物羥化酶的編碼基因。本發(fā)明的較佳實施例中，上述的重組菌為大腸桿菌，優(yōu)選為大腸桿菌BL21菌株。本發(fā)明的另一目的是提供上述的芳香烴羥化酶系統(tǒng)的應用，其可用于降解單環(huán)芳香烴化合物或氨基取代芳香烴或其衍生物中的至少一種。應當指出的是，上述提到的術(shù)語"嚴格條件"在本說明書中的含義是指在該條件下形成了所謂特異雜交而沒有形成非特異的雜交。例如，該嚴格條件可以是，相互之間的同源性不小于70%的DNA之間可以雜交而低于上述數(shù)值的DNA之間不能雜交，優(yōu)選的是同源性不少于90%的DNA之間可以雜交。相對于Southern雜交中普通洗漆條件而言，可以例如為如下的雜交條件將雜交膜置于預雜交液(0.25mol/L磷酸鈉緩沖液，pH7.0,7%SDS)中，50。C預雜交30分鐘；棄預雜交液，加入雜交液(0.25mol/L磷酸鈉緩沖液，pH7.0，7%SDS，同位素標記的核苷酸片段)，5(TC雜交12小時后；棄雜交液，加入洗膜液I(2xSSC和0.1。/。SDS)，50。C洗膜2次，每次30分鐘；加入洗膜液II(0.5xSSC和0.1。/。SDS)，5CTC洗膜30分鐘。所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
：的技術(shù)人員應該知道，本發(fā)明的編碼芳香烴羥化酶系統(tǒng)的DNA序列，還包括編碼對SEQIDNO:1、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示核苷酸序列所表達的酶分子的氨基酸序列進行一個或多個氨基酸替換、插入或缺失并仍具有該酶活性的蛋白質(zhì)的核苷酸序列。另外，對本發(fā)明的芳香烴羥化酶系統(tǒng)基因所表達的酶分子的氨基酸進行一個或多個氨基酸替換、插入或缺失所得到的蛋白質(zhì)，也能達到本發(fā)明的目的。因而本發(fā)明還包括與SEQIDNO:4、SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示的氨基酸序列具有至少70%的同源性，優(yōu)選具有至少90%的同源性，但同時具有芳香烴羥化酶系統(tǒng)活性的蛋白質(zhì)。上面使用的術(shù)語"多個"可以是小于100的數(shù)目，優(yōu)選為小于10的數(shù)目。本發(fā)明的嗜熱脫氮芽孢桿菌(Geo^"7/usAwwocfew/^/cara)NG80-2中分離的羥化酶系統(tǒng)與類似的羥化酶系統(tǒng)有很大不同。NG80-2的羥化酶系統(tǒng)是一個三蛋白酶系統(tǒng)，它包括一個NADH依賴的FMN還原酶(GT3158基因編碼)，一個FAD合成酶(GT3159基因編碼)和一個芳香族化合物羥化酶(GT3160基因編碼)(如圖1)。FAD合成酶催化FMN合成FAD。NADH依賴的FMN還原酶是具有FAD結(jié)合域的黃素蛋白酶，可以還原FAD。底物再通過還原性FAD被芳香化合物羥化酶所催化(如圖2)。和己知的芳香烴羥化酶系統(tǒng)相比，本發(fā)明提出的芳香烴羥化酶系統(tǒng)是一種新型的芳香烴羥化酶系統(tǒng)，是目前唯一已純化蛋白并鑒定基因功能的耐高溫芳香烴羥化酶系統(tǒng)，該酶系統(tǒng)由三個具有單獨功能的蛋白組分組成，能在高溫堿性條件下降解單環(huán)芳香烴化合物。通過對本發(fā)明提出的芳香烴羥化酶系統(tǒng)基因推導的氨基酸序列比較分析，本發(fā)明的芳香烴羥化酶系統(tǒng)與其它已報道的酶的氨基酸序列相比，絕大多數(shù)相似性均小于41%。相似性高于41%的芳香烴羥化酶系統(tǒng)都未做功能鑒定。其中，與GT3158相似性最高的已知蛋白為來源于尸"w^wwwospwWaS-313的SsuE(085762)(氨基酸序列一致性為41%)，與GT3159相似性最高的已知蛋白為來源于C。o^e6acfen'Mwam附om'agewas的RibF(Q59263)(氨基酸序歹U—致性為32%)，與GT3160相似性最高的已知蛋白為來源于Geo&c〃/w^ze濯og/wcoy油57'w51A7白勺phenol2-hydroxylasecomponentA(AAF66546)禾口尸yoveni/"c/zrawop/zo/-ebiosyntheticproteinPvcCfromi^ei^omowas(030372)(氨基酸序列一致性均為34%)。由此可見，本發(fā)明的芳香烴羥化酶系統(tǒng)與其它已報道的芳香烴羥化酶的氨基酸序列相比后，相似性大于41%的已發(fā)現(xiàn)菌株中，基本上都進行了序列比對的研究，沒有發(fā)現(xiàn)對相應菌株的芳香烴羥化酶基因的功能進行鑒定的相關(guān)文獻。本發(fā)明的芳香烴羥化酶系統(tǒng)具有耐高溫降解單環(huán)芳香化合物的能力，該酶系統(tǒng)的鑒定對于研究微生物的降解作用來消除芳香類化合物對環(huán)境的影響及環(huán)境治理具有重要的應用價值。該芳香烴羥化酶系統(tǒng)的酶資源的開發(fā)和應用具有處理成本低、操作簡便、污染物降解效果好、不易引起二次污染等優(yōu)點，并且其具備的耐高溫穩(wěn)定酶活性，可廣泛應用于酶制劑工業(yè)生產(chǎn)和高溫環(huán)境中環(huán)境污染物芳香烴的降解。同時也為深入研究嗜熱脫氮芽孢桿菌NG80-2降解芳香化合物代謝途徑的機制提供了更有力的證據(jù)。該芳香烴羥化酶系統(tǒng)的嗜熱性及降解芳香化合物的能力具有重要的工業(yè)應用價值。為讓本發(fā)明的上述和其它目的、特征和優(yōu)點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例，并配合附圖，作詳細說明如下。圖l是本發(fā)明的芳香烴羥化酶系統(tǒng)基因結(jié)構(gòu)示意圖；圖2是本發(fā)明的芳香烴羥化酶系統(tǒng)降解鄰氨基苯甲酸作用示意圖；圖3是插入本發(fā)明的芳香烴羥化酶系統(tǒng)中NADH依賴的FMN還原酶基因的重組質(zhì)粒pLW1318的圖譜；圖4是插入本發(fā)明的芳香烴羥化酶系統(tǒng)中FAD合成酶基因的重組質(zhì)粒pLW1279的圖譜；圖5是插入本發(fā)明的芳香烴羥化酶系統(tǒng)中芳香族化合物羥化酶基因的重組質(zhì)粒pLW1259的圖譜；圖6是本發(fā)明的芳香烴羥化酶系統(tǒng)三組分蛋白的SDS-PAGE圖；圖7是本發(fā)明芳香烴羥化酶系統(tǒng)中FAD合成酶酶活毛細管電泳檢測圖；圖8是本發(fā)明芳香烴羥化酶系統(tǒng)降解鄰氨基苯甲酸酶活毛細管電泳檢測圖；圖9表示本發(fā)明芳香烴羥化酶系統(tǒng)在不同溫度下的比活力；圖10表示本發(fā)明芳香烴羥化酶系統(tǒng)在不同pH值下的比活力。具體實施方式下面通過具體實施例并結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步的詳細說明。以下各實施例僅僅是用于說明而不是限制本發(fā)明。實施例一芳香烴羥化酶系統(tǒng)基因的克隆1.NG80-2總DNA的提取嗜熱脫氮芽孢桿菌(Geo6ac/〃MAwmc^emYnycara)NG80-2(其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMCCNo.1228，保藏日期為2004年10月09日，已申請國內(nèi)發(fā)明專利并獲得授權(quán)，發(fā)明名稱嗜熱脫氮芽孢桿菌及其篩選和應用，專利號ZL200410072759.7)總DNA的提取研究證明，由嗜熱脫氮芽孢桿菌NG80-2基因組能夠分離出編碼芳香烴羥化酶系統(tǒng)的基因。因此，在本實施例中，采用從中國天津大港油田官69-8區(qū)塊油井地層水分離獲得的嗜熱脫氮芽孢桿菌NG80-2，取其過夜培養(yǎng)的新鮮培養(yǎng)物3ml，離心收集菌體，菌體懸于250微升50mMTris緩沖液中(pH8.0)，加入10微升0.4MEDTA(pH8.0)，混勻后37。C保溫20分鐘，之后加入30微升20mg/ml溶菌酶，混勻后37"C再保溫20分鐘，再加入5微升20mg/ml蛋白酶K，溫柔混勻后，再加入20微升10%SDS，5(TC保溫至溶液澄清，分別用等體積酚氯仿異戊醇抽提兩次，氯仿異戊醇抽提一次，最后一次的上清溶液，加入2.5倍體積預冷的無水乙醇，回收DNA，用70%乙醇洗，沉淀溶于100微升TE緩沖液(pH8.0，10mMTris，lmMEDTA)，加入10mg/mlRNase2微升，65。C保溫30分鐘，分別用酚氯仿異戊醇、氯仿異戊醇各抽提一次，上清液加入2.5倍體積預冷的無水乙醇，回收DNA，用70%乙醇洗，真空干燥，沉淀溶于50微升TE緩沖液。DNA溶液的紫外分光光度計測定結(jié)果為A260/A280=1.95，A260=0.73。2.本發(fā)明芳香烴羥化酶系統(tǒng)基因的克隆和篩選取前面所述的總DNA溶液0.5微升(約10ng)作為模板，以下列寡核苷酸序列作為引物(SEQIDNO:7-SEQIDNO:12)，并按下述設(shè)定的PCR循環(huán)參數(shù)進行20個循環(huán)PCR。設(shè)定的PCR循環(huán)參數(shù)如下95°C，5分鐘；95°C，30秒；50°C，45秒；72°C，2分鐘；72°C，5分鐘；4°C，2小時引物序列如表l:表1構(gòu)建克隆所需引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>上述PCR產(chǎn)物用表1中對應的限制性內(nèi)切酶雙酶切，經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收酶切產(chǎn)物片斷。與經(jīng)同樣限制型內(nèi)切酶酶解并切膠回收的質(zhì)粒pET-28a(+)連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5(x后，涂于含50嗎/mlKan(卡那霉素)的LB固體培養(yǎng)基上。37。C培養(yǎng)12小時，挑取單克隆轉(zhuǎn)接到20mlLB培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)(50(ig/mlKan)，37t:培養(yǎng)12小時后，提取質(zhì)粒鑒定，插入有SEQIDNO:1、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3的DNA序列的pET-28a(+)質(zhì)粒分別為重組質(zhì)粒pLW1318(見圖3)，pLW1279(見圖4)和pLW1259(見圖5)，將重組質(zhì)粒pLW1318、pLW1279和pLW1259，分別轉(zhuǎn)入表達宿主大腸桿菌BL21(該菌株可向天津開發(fā)區(qū)厚普生物技術(shù)開發(fā)有限公司訂購,貨號為69387-3)中，得到含有三種重組質(zhì)粒的重組菌株分別為H1623、H1456和H1506,重組質(zhì)粒pLW1318、pLW1279和pLW1259可高頻轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21表達芳香烴羥化酶系統(tǒng)所需三組分蛋白活性和抗卡那霉素性能。采用Sanger法對此DNA片段進行了測序，測序結(jié)果顯示pLW1318、pLW1279和pLW1259中的插入片段分別含有長558bp(SEQIDNO:1)、540bp(SEQIDNO:2)和1485bp(SEQIDNO:3)的開放閱讀框架，分別編碼由185(SEQIDNO:4)、179(SEQIDNO:5)和494(SEQIDNO:6)個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。實施例二芳香烴羥化酶系統(tǒng)三組分蛋白的純化和特性將上述重組菌H1623、H1456和H1506單克隆分別接入20ml含50^ig/mlKan的LB培養(yǎng)基中，37°C，180rpm/min培養(yǎng)12小時，然后將培養(yǎng)物按1%(v/v)接種量分別接入200ml含50pg/mlKan的LB培養(yǎng)基(共IO個搖瓶)，37°C，220rpm/min培養(yǎng)OD600為0.6時，分別加入IPTG至終濃度為O.lmM，45°C，180rpm/min誘導2.5小時。分別離心收集菌體，懸于含50mMTris-HCl(pH8.0)緩沖液中，利用超聲波破碎細胞，離心上清液分別為芳香烴羥化酶系統(tǒng)三個組分的粗提液。將上述三個組分的上清液經(jīng)螯合瓊脂糖凝膠(ChelatingSepharose)鎳親合柱層析純化，得到的酶制劑在SDS-PAGE上均顯示一條帶(見圖6)。利用已知的蛋白質(zhì)化學標準方法測定此芳香烴羥化酶系統(tǒng)的基本特性。用SDS-PAGE測得的重組酶的分子量分別為21000、20000和56000道爾頓，分別與理論上推算的分子量(20725、20167和56164道爾頓)相似；等電點沉淀法測得的重組酶的等電點pl分別為6.04、9.40和5.96。實施例三芳香烴羥化酶系統(tǒng)的活性測定1.測定本發(fā)明芳香烴羥化酶系統(tǒng)中NADH依賴的FMN還原酶活性對上述實施例二中制得的芳香烴羥化酶系統(tǒng)中NADH依賴的FMN還原酶活性進行測定，具體方法為配制lml反應體系，MgCb的終濃度為5mM，NADH的終濃度為100pM，F(xiàn)MN或FAD的終濃度為100(xM，一定濃度的NADH依賴的FMN還原酶，用20mMpH7.6的磷酸鉀緩沖液補至50pl?；靹?，在60。C水浴中反應IO分鐘，反應結(jié)束后，冰浴5分鐘，終止反應。然后在340nm處測定光吸收。以每分鐘消耗生成lpmol底物NADH(s34Qnm=6,220M—1cm—1)所需酶量定義為1個酶活力單位。2.測定本發(fā)明芳香烴羥化酶系統(tǒng)中FAD合成酶活性對上述實施例二中制得的芳香烴羥化酶系統(tǒng)中FAD合成酶活性進行測定，具體方法為配制50^d反應體系，MgCl2的終濃度為5mM，NADH的終濃度為2mM，F(xiàn)MN的終濃度為lmM，ATP的終濃度為3mM，一定濃度的FAD合成酶，用20mMpH7.6的磷酸鉀緩沖液補至50pl?；靹?，在6(TC水浴中反應IO分鐘，反應結(jié)束后，冰浴5分鐘，終止反應。然后用CE檢測產(chǎn)物FAD的生成(見圖7)。以每分鐘生成lnmol產(chǎn)物所需酶量定義為1個酶活力單位。3.測定本發(fā)明芳香烴羥化酶系統(tǒng)不同底物時的比活力對上述實施例二中制得的芳香烴羥化酶系統(tǒng)進行不同底物的測定，具體方法為配制50(il反應體系，MgCl2的終濃度為5mM，NADH的終濃度為2mM，F(xiàn)MN的終濃度為lmM，ATP的終濃度為3mM，分別加入2mM鄰氨基苯甲酸，一定濃度的三組分芳香烴羥化酶系統(tǒng)，用20mMpH7.6的磷酸鉀緩沖液補至50pl?；靹?，在6(TC水浴中反應IO分鐘，反應結(jié)束后，冰浴5分鐘，終止反應。然后用CE檢測3-羥基化產(chǎn)物的生成(見圖8)。以每分鐘生成lnmol產(chǎn)物所需酶量定義為1個酶活力單位。以鄰氨基苯甲酸、2-羥基苯乙酸、4-羥基苯乙酸或水楊酸分別作為底物測定酶活，結(jié)果參見表2，從該表中可以看出，該芳香烴羥化酶系統(tǒng)的最適底物是鄰氨基苯甲酸。表2芳香烴羥化酶系統(tǒng)不同底物時的比活力<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>4.測定本發(fā)明芳香烴羥化酶系統(tǒng)在不同溫度下的比活力對上述實施例二中制得的芳香烴羥化酶系統(tǒng)進行最適反應溫度的測定，具體方法為配制50ial反應體系，MgCl2的終濃度為5mM，NADH的終濃度為2mM，F(xiàn)MN的終濃度為lmM，ATP的終濃度為3mM，分別加入2mM鄰氨基苯甲酸，一定濃度的三組分芳香烴羥化酶系統(tǒng)，用20mMpH7.6的磷酸鉀緩沖液補至50^1。混勻，分別于25。C至IO(TC水浴中反應IO分鐘，反應結(jié)束后，冰浴5分鐘，終止反應。然后用CE檢測3-羥基化產(chǎn)物的生成。測定結(jié)果參見圖9。從該圖中可以看出，該芳香烴羥化酶系統(tǒng)的最適反應溫度約為60°C。5.測定本發(fā)明芳香烴羥化酶系統(tǒng)在不同pH下的比活力對上述實施例二中制得的芳香烴羥化酶系統(tǒng)進行最適pH值的測定，具體方法為配制50^d反應體系，MgCl2的終濃度為5mM，NADH的終濃度為2mM，F(xiàn)MN的終濃度為lmM，ATP的終濃度為3mM，分別加入2mM鄰氨基苯甲酸，一定濃度的三組分芳香烴羥化酶系統(tǒng)，分別用pH3.2至pH11.0的緩沖液(配方見表3)補至50pl?；靹?，在6(TC水浴中反應IO分鐘，反應結(jié)束后，冰浴5分鐘，終止反應。然后用CE檢測3-羥基化產(chǎn)物的生成。測定結(jié)果參見圖10，從該圖中可以看出，該芳香烴羥化酶系統(tǒng)的最適pH值約為9.0。表3芳香烴羥化酶酶系統(tǒng)活測定中所用的緩沖液<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>雖然本發(fā)明已以較佳實施例披露如上，然其并非用以限定本發(fā)明，任何所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
：的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍所做的更動與改進，都將落入本發(fā)明的保護范圍。序列表<110>南開大學<120>—種芳香烴羥化酶系統(tǒng)及應用<130〉7P13010-CN<160〉12<170〉Patentlnversion3.2<210>1〈211>558<212>DNA〈213>芳香烴羥化酶系統(tǒng)的NADH依賴的FMN還原酶基因序列<400>1gtgaagttgttaggtatctcaggaacattagtgggcaccaagacatgcattctggtggaa60caggtgcttgtcgaggcgaagcggatctgtccggaggtagacatacaactcttgg3tttg120aaggactaccaggtggagttttgcgatggccgccaacagtcgtcctacaatgaggacaca180caaaaggtgatcgagctcgtatccgtcgctgactgctacgtgatcggcacaccgatcttc240caaggctccattaccggggcattgaagaacctgtttgatttgatcagtccccaggcacta300cggcacaaagtgatggggtttgtcgccaacggtgggacgtaccagcattatctagtgatt360gagaatcagttgaaaccaattgctatgcttcttccgggcattcgtggcacctggtagcgtc420tacgcccataccgatcatttcaatgagaaaaatgaattggttgatccggaggtacgcgag480cgcgttgcccagctcgcatgggaagtggtgcatatgcactggtcactgaagtctggtggt540gtccatgcccatcgttga558<210>2<211〉540<212>DNA<213〉芳香經(jīng)羥化酶系統(tǒng)的FAD合成酶基因序列<400〉2atgaaggtgcatgaggcaaatcaggggttgacgctacccggctcggtggtggcgataggg60gctttcgacggagtgcaccagggtcatcaggccgtgcttcgacaggcagtggagcgcagt120cggcagctcggcgtcgagagcgtagcgtacacgattgatcccccgccccgctgtcgcttt180cagggatcgcgcatgttgacgaccttgcaggagaagctagacaggtttgctgtcttgggg240ttgaaccacgcggtggtggcccatttcgacgagcggtacgctgcgcgtcgggtggacgcg300ttcaUcgcgaactgaccgctttgaacccgcgggaggtgatcgttgggcaggactttcgc360tUggtcgcaaccgggaaggggacgtagccttgctccggcgtcacttt.cccgtgcggatc420gttcagacggtctgctgtgcggacggccaacggatctcctcaacgcgcattcgcgagttg480atcgagcggggagagtgggaacagtcgaccgtccttctggggtggccgcttagctcgtaa540<210〉3<211>1485<212〉腿〈213〉芳香烴羥化酶系統(tǒng)的芳香族化合物羥化酶基因序列<400〉3atgaggatggggatccgcacaggtgcccagtacatcagtggattgaagtcccggaagccagaaatctggttgagtggccgtcgcgtgatcaacgtatgcgaagaacctgtgttcaaacaaccaatccgcgaaatcgccagactctatgatatgcagcatgatcccgagtatcaggacaagattacacacatttgcacagaaaccggagagcgggtgagcaacgcgttcctggtccctaaatctcgggaggatctgctagcccgccgtgcgttgtttgaagtatgggcccgcgccacgtttggtctgatggggagaactcctgattttctcaatgtcgtgctcacctcgctgtacagcaacgcttcgtttttggaaaagtacaatccgcagtgggcggaaaacatccgt.gcgtactaccgctatgtgcgcgacaacgacctgtttttgacgcacgccatcatcaatccgcaaaacgaccggagcaagccgtcccacgaacsgcaggacacgtttacgcacctaggagtggtaagggagacgccggaggggttgattgtgagaggtgccaagatgctggccacactggcaccgatcacggacgaggtgatcatctataccttccctggatat.aagccaggtgatgagcggtacgcggtctcgtttgctatcccgatcgacacgccagggctgcgcattctctgccgagaaccaatgcaggatggcacacgcccgctgtttgaccatccgctagcatcccgcttcgaggaaatggatgcgctcttggtgttcaacgatgtgctggtgccatgggaccgggtgttcatctacaataacgtggaagcggctaacctgctctatccgaagaccggtatcgcgcagcaacctgctcatcaaacaggagtgcgcggtctgattaagctgcagttcgccaccgaagtagctattcgtttggccgattcgatcggggtggacgtctatctgaacgtgcaaaatgacctaggtgagctgctccagtcggtagaagcaatccgcgcattgctgcacctagctgaacacgaactggaggtgttgccctccggcg鄉(xiāng)tgatgccaggatgggtgccgcttgagacgattcgtggtctcctgcccaagctgtatccacgtgctgtgg卿tattacaaatcatcggtgccggtggcctgttgatgtccccaacgggtgccgactttgctaatccggaactagcggcagacatgg卿aatactacgctggtcgcattggagtgggcggag鄉(xiāng)agagggttcggctgttc咖ctggcttgggatttatgtggcgaagcatttggccagagactcctgcagtatgagcgtttctacactggcgacccgatccgc1380aagcgggcgatcttctataacaacatcaaaagggaacgtacgctcgtcatggtggatgag1440gctctgcggatgccgaatcagcaggagaaagttgtgaatgcctga601201802403003604204805406006607207808409009601020108011401200126013201485<210>4<211>185<212〉PRT<213〉芳香烴羥化酶系統(tǒng)的NADH依賴的FMN還原酶氨基酸序列<400〉4ValLysLeuLeuGlylieSerGlyThrLeuValGlyThrLysThrCys151015lieLeuValGluGinValLeuValGluAlaLysArglieCysProGlu202530ValAsplieGinLeuLeuAspLeuLysAspTyrGinValGluPheCys354045AspGlyArgGinGinSerSerTyrAsnGluAspThrGinLysVallie505560GluLeuValSerValAlaAspCysTyrVallieGlyThrProliePhe65707580GinGlySerlieThrGlyAlaLeuLysAsnLeuPheAspLeulieSer859095ProGinAlaLeuArgHisLysValMetGlyPheValAlaAsnGlyGly100105110ThrTyrGinHisTyrLeuVallieGluAsnGinLeuLysProlieAla115120125SerPhePheArgAlaPheValAlaProGlySerValTyrAlaHisThr130135140AspHisPheAsnGluLysAsnGluLeuValAspProGluValArgGlu145150155160ArgValAlaGinLeuAlaTrpGluValValHisMetHisT卬SerLeu165170175LysSerGlyGlyValHisAlaHisArg180185<210>5<211〉179〈22〉PRT<213>芳香烴羥化酶系統(tǒng)的FAD合成酶氨基酸序列<400>5MetLysValHisGluAlaAsnGinGlyLeuThrLeuProGlySerVal151015ValAlalieGlyAlaPheAspGlyValHisGinGlyHisGinAlaVal202530LeuArgGinAlaValGluArgSerArgGinLeuGlyValGluSerVal354045AlaTyrThrlieAspProProProArgCysArgPheGinGlySerArg505560MetLeuThrThrLeuGinGluLysLeuAspArgPheAlaValLeuGly65707580LeuAsnHisAlaValValAlaHisPheAspGluArgTyrAlaAlaArg859095ArgValAspAlaPhelieArgGluLeuThrAlaLeuAsnProArgGlu100105110VallieValGlyGinAspPheArgPheGlyArgAsnArgGluGlyAsp115120125ValAlaLeuLeuArgArgHisPheProValArglieValGinThrVal130135140CysCysAlaAspGlyGinArglieSerSerThrArglieArgGluLeu145150155160lieGluArgGlyGluTrpGluGinSerThrValLeuLeuGlyTrpPro165170175LeuSerSer<210>6<211>494<212>PRT<213>芳香烴羥化酶系統(tǒng)的芳香族化合物羥化酶氨基酸序列<400>6MetArgMetGlylieArgThrGlyAlaGinTyrlieSerGlyLeuLys151015SerArgLysProGlulieTrpLeuSerGlyArgArgVallieAsnVal202530CysGluGluProValPheLysGinProlieArgGlulieAlaArgLeu354045TyrAspMetGinHisAspProGluTyrGinAspLyslieThrHislie505560CysThrGluThrGlyGluArgValSerAsnAlaPheLeuValProLys65707580SerArgGluAspLeuLeuAlaArgArgAlaLeuPheGluValTrpAla859095ArgAlaThrPheGlyLeuMetGlyArgThrProAspPheLeuAsnVal100105110ValLeuThrSerLeuTyrSerAsnAlaSerPheLeuGluLysTyrAsn115120125ProGinTrpAlaGluAsnlieArgAlaTyrTyrArgTyrValArgAsp130135140AsnAspLeuPheLeuThrHisAlalielieAsnProGinAsnAspArg145150155160SerLysProSerHisGluGinGinAspThrPheThrHisLeuGlyVal165170175ValArgGluThrProGluGlyLeulieValArgGlyAlaLysMetLeu180185190AlaThrLeuAlaProlieThrAspGluVallielieTyrThrPhePro'195200205GlyTyrLysProGlyAspGluArgTyrAlaValSerPheAlaliePro210215220lieAspThrProGlyLeuArglieLeuCysArgGluProMetGinAsp225230235240GlyThrArgProLeuPheAspHisProLeuAlaSerArgPheGluGlu245250255MetAspAlaLeuLeuValPheAsnAspValLeuValProTrpAspArg260265270ValPhelieTyrAsnAsnValGluAlaAlaAsnLeuLeuTyrProLys275280285ThrGlylieAlaGinGinProAlaHisGinThrGlyValArgGlyLeu290295300lieLysLeuGinPheAlaThrGluValAlalieArgLeuAlaAspSer305310315320lieGlyValAspValTyrLeuAsnValGinAsnAspLeuGlyGluLeu325330335LeuGinSerValGluAlalieArgAlaLeuLeuHisLeuAlaGluHis340345350GluLeuGluValLeuProSerGlyGluValMetProGlyTrpValPro355360365LeuGluThrlieArgGlyLeuLeuProLysLeuTyrProArgAlaVal370375380GluValLeuGinlielieGlyAlaGlyGlyLeuLeuMetSerProThr385390395400GlyAlaAspPheAlaAsnProGluLeuAlaAlaAspMetGluLysTyr405410415TyrAlaGlyArglieGlyValGlyGlyGluGluArgValArgLeuPhe420425430LysLeuAlaTrpAspLeuCysGlyGluAlaPheGlyGinAi.gLeuLeu435440445GinTyrGluArgPheTyrThrGlyAspProlieArgLysArgAlalie450455柳PheTyrAsnAsnlieLysArgGluArgThrLeuValMetValAspGlu465470475480AlaLeuArgMetProAsnGinGinGluLysValValAsnAla485490<210>7<211>29<212>DNA<213>克隆芳香烴羥化酶系統(tǒng)的NADH依賴的FMN還原酶基S的上游引物序列<400>7ccggaattcgtgaagttgttaggtatctc29<210>8<211>29<212>DNA<213>克隆芳香烴羥化酶系統(tǒng)的NADH依賴的FMN還原酶基因的下游引物序列<400>8cccaagctttcaacgatgggcatggacac29<210>9<211>33<212>DNA<213>克隆芳香烴羥化酶系統(tǒng)的FAD合成酶基因的上游引物序列<400>9ggaattccatatgaaggtgcatgaggcaaatea33<210>10<211>29<212>DNA<213>克隆芳香烴羥化酶系統(tǒng)的FAD合成酶基因的下游引物序列<400>10cccaagcttttacgagctaagcggccacc29<210>11<211>33<212>DNA<213>克隆芳香烴羥化酶系統(tǒng)的芳香族化合物羥化酶基因的上游引物序列<400>)1ggaattccatatgaggatggggatccgcacagg33<20>12<211>29<212>DNA<213>克隆芳香烴羥化酶系統(tǒng)的芳香族化合物羥化酶基因的下游引物序列<400>12cccaagctttcaggcattcacaactttct29權(quán)利要求1.一種芳香烴羥化酶系統(tǒng)，其特征在于包括NADH依賴的FMN還原酶，F(xiàn)AD合成酶和芳香族化合物羥化酶。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的芳香烴羥化酶系統(tǒng)，其特征在于所述的NADH依賴的FMN還原酶、FAD合成酶和芳香族化合物羥化酶的編碼基因依次分別具有a)SEQIDNO:1、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示的核苷酸序列；或b)不同于SEQIDNO:1、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3但編碼的氨基酸序列與SEQIDNO:1、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所編碼的氨基酸序列相同的核苷酸序列；或c)在嚴格雜交條件下與所述的a)或b)中的序列雜交，并且編碼具有活性的所述的芳香烴羥化酶系統(tǒng)的核苷酸序列。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的芳香烴羥化酶系統(tǒng)，其特征在于所述的NADH依賴的FMN還原酶、FAD合成酶和芳香族化合物羥化酶具有d)上述a)、b)或c)所述的核苷酸序列編碼的氨基酸序列；或e)SEQIDNO:4、SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示的氨基酸序列；或f)上述e)中缺失、替換或插入一個或多個氨基酸后、并且具有所述的NADH依賴的FMN還原酶、FAD合成酶和芳香族化合物羥化酶的活性的氨基酸序列。4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的芳香烴羥化酶系統(tǒng)，其特征在于所述的芳香烴羥化酶系統(tǒng)于嗜熱脫氮芽孢桿菌NG80-2中分離得到。5.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的芳香烴羥化酶系統(tǒng)，其特征在于所述的芳香烴羥化酶系統(tǒng)的底物包括鄰氨基苯甲酸、2-羥基苯乙酸、4-羥基苯乙酸、水楊酸中的至少一種。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的芳香烴羥化酶系統(tǒng)，其特征在于所述的芳香烴羥化酶系統(tǒng)的最適底物是鄰氨基苯甲酸。7.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的芳香烴羥化酶系統(tǒng)，其特征在于所述的芳香烴羥化酶系統(tǒng)的反應溫度為25°C-100°C。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的芳香烴羥化酶系統(tǒng)，其特征在于所述的芳香烴羥化酶系統(tǒng)的最適反應溫度為60°C。9.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的芳香烴羥化酶系統(tǒng)，其特征在于所述的芳香烴羥化酶系統(tǒng)的反應pH值為3.2-11.0。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的芳香烴羥化酶系統(tǒng)，其特征在于所述的芳香烴羥化酶系統(tǒng)的最適反應pH值為9.0。11.一種表達芳香烴羥化酶系統(tǒng)的重組質(zhì)粒，其特征在于至少包括權(quán)利要求2的NADH依賴的FMN還原酶、FAD合成酶和芳香族化合物羥化酶的編碼基因。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的重組質(zhì)粒，其特征在于所述的重組質(zhì)粒的載體為pET-28a(+)。13.—種產(chǎn)生芳香烴羥化酶系統(tǒng)的重組菌，其特征在于所述的重組菌內(nèi)導入了權(quán)利要求2的NADH依賴的FMN還原酶、FAD合成酶和芳香族化合物羥化酶的編碼基因。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的重組菌，其特征在于所述的重組菌為大腸桿菌。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的重組菌，其特征在于所述的重組菌為大腸桿菌BL21菌株。16.權(quán)利要求1-3任一項所述的芳香烴羥化酶系統(tǒng)用于降解單環(huán)芳香烴化合物或氨基取代芳香烴或其衍生物中的至少一種。專利摘要本發(fā)明涉及一種芳香烴羥化酶系統(tǒng)及應用，其中該系統(tǒng)包括NADH依賴的FMN還原酶，F(xiàn)AD合成酶和芳香族化合物羥化酶。本發(fā)明還涉及表達所述的芳香烴羥化酶系統(tǒng)的重組質(zhì)粒及重組菌，本發(fā)明所述的芳香烴羥化酶系統(tǒng)可用于降解單環(huán)芳香烴化合物或氨基取代芳香烴或其衍生物中的至少一種。文檔編號C12N15/52GKCN101397549SQ200710154194公開日2009年4月1日申請日期2007年9月24日發(fā)明者露馮,劉雪倩,磊王申請人:南開大學導出引文BiBTeX,EndNote,RefMan