專利名稱:一種磷脂酶d的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種磷脂酶D的生產(chǎn)方法，涉及發(fā)酵領(lǐng)域。具體的說(shuō)是采用固態(tài)發(fā)酵的方 法生產(chǎn)磷脂酶D，以小麥、麩皮、豆餅粉和麥糟為固態(tài)基質(zhì)，并添加磷酸二氫 鉀、七水硫酸鎂、葡萄糖等物質(zhì)，通過(guò)固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)磷脂酶D。
技術(shù)背景
磷脂作為一種生物活性物質(zhì)，有著獨(dú)特的理化性質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，在世界范 圍內(nèi)的食品、保健品、醫(yī)藥以及詞料行業(yè)已被廣泛使用。磷脂酰絲氨酸 (phosphatidylserine, PS)是磷脂家族中的一員，近20年來(lái)國(guó)內(nèi)外的動(dòng)物試驗(yàn)及 臨床應(yīng)用，表明PS對(duì)改善記憶和認(rèn)知能力、防治老年癡呆癥、抑郁癥及緩解精 神壓力都有顯著療效。
目前大規(guī)模生產(chǎn)磷脂酰絲氨酸的重要性不僅僅在于其生物學(xué)及工業(yè)化應(yīng)用 潛力，同時(shí)也與其在保健、營(yíng)養(yǎng)品方面的逐漸應(yīng)用有關(guān)。然而無(wú)論從自然界分 離提取或化學(xué)合成法生產(chǎn)磷脂酰絲氨酸都十分復(fù)雜，目前研究人員正尋求利用 酶特別是磷脂酶D進(jìn)行酶法轉(zhuǎn)化來(lái)定向合成磷脂酰絲氨酸，如專利申請(qǐng)文獻(xiàn) 1~3。[專利申請(qǐng)文獻(xiàn)1:公開(kāi)號(hào)CN155288A;專利申請(qǐng)文獻(xiàn)2:公開(kāi)號(hào) CN1897919A;專利申請(qǐng)文獻(xiàn)3:公開(kāi)號(hào)CN1468314A]
磷脂酶D (PhospholipaseD， PLD; EC 3111414)首先發(fā)現(xiàn)于植物中(如巻 心菜、花生等作物)，之后在微生物(鏈霉菌、大腸桿菌、沙門(mén)氏菌等)和哺乳 動(dòng)物細(xì)胞中均有發(fā)現(xiàn)。它不但可以水解卵磷脂生成磷酸脂和膽堿，通過(guò)打斷其 磷酸酯鍵完成反應(yīng)，而且當(dāng)有分子作為親核供體時(shí)，磷脂酶D能催化轉(zhuǎn)酯反應(yīng)。 同時(shí)，來(lái)自微生物界的磷脂酶D相對(duì)于來(lái)自植物界的有更強(qiáng)大的轉(zhuǎn)酯能力，底 物特異性低。其中又以源自鏈霉菌屬的磷脂酶D的轉(zhuǎn)酯能力尤為突出。
但是，目前采用液體發(fā)酵產(chǎn)酶水平低、發(fā)酵周期長(zhǎng)(一般要接近7天)、生 產(chǎn)成本高等缺點(diǎn)給實(shí)際應(yīng)用帶來(lái)了很多困難。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種磷脂酶D的生產(chǎn)方法，用固態(tài)發(fā)酵，具有單位基 質(zhì)酶活高，發(fā)酵周期短，生產(chǎn)成本低等特點(diǎn)，為大規(guī)模應(yīng)用提供了便利條件。
本發(fā)明的技術(shù)方案 一種磷脂酶D的生產(chǎn)方法，以小麥、麩皮、豆餅粉和
麥糟為固態(tài)基質(zhì)，并添加磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂和葡萄糖，通過(guò)固態(tài)發(fā)酵生
產(chǎn)磷脂酶D;
以肉桂鏈輪絲菌AS 4.1084為出發(fā)菌株；該菌株詳見(jiàn)中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物
保藏委員會(huì)菌種目錄網(wǎng)頁(yè)http://www.ctcccas.ac.cn/，本申請(qǐng)人亦可向公眾提供。
固態(tài)基質(zhì)以麥糟為基本質(zhì)量單位，小麥、麩皮、豆餅粉添加比例為小
麥添加麥糟質(zhì)量的2% 5%，麩皮添加麥糟質(zhì)量的5% 10。％，豆餅粉添加麥糟
質(zhì)量的3% 8%;固態(tài)基質(zhì)按常規(guī)加水進(jìn)行蒸煮備用；
磷酸二氫鉀的添加量為固態(tài)基質(zhì)和水總質(zhì)量的0.1% 0.4%，七水硫酸鎂的 添加量為固態(tài)基質(zhì)和水總質(zhì)量的0.03% 0.075%，葡萄糖的添加量為固態(tài)基質(zhì)
和水總質(zhì)量的0.4% 1 % ;
固態(tài)發(fā)酵條件接種量為菌株的種子培養(yǎng)液與固態(tài)培養(yǎng)基總質(zhì)量的體積
質(zhì)量比為5% 10%，發(fā)酵初始水份為56% 68%;發(fā)酵初始pH 6.8 7.2，發(fā)酵 過(guò)程品溫25 32'C，發(fā)酵時(shí)間72 120小時(shí)。
所述的磷脂酶D的生產(chǎn)方法，麥糟改用麥糟、玉米芯、干玉米秸稈中的任 意一種或幾種的組合物替代。
所述的磷脂酶D的生產(chǎn)方法，麥糟、玉米芯、干玉米秸稈需粉碎，粉碎的 細(xì)度為1 3 cm。
本發(fā)明所述的肉桂鏈輪絲菌AS 4.1084購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委 員會(huì)。
本發(fā)明所述方法中其它沒(méi)有具體描述的部分均采用本技術(shù)領(lǐng)域：
公知的或己 公開(kāi)報(bào)道的方法。在本發(fā)明所進(jìn)行的描述中，如無(wú)特別說(shuō)明均為質(zhì)量百分比。
本發(fā)明的有益效果1)固態(tài)發(fā)酵是一種傳統(tǒng)的發(fā)酵方法，由于固態(tài)發(fā)酵水 分少，每克基質(zhì)的體積小，這將帶來(lái)一系列的好處如a、要處理的廢水量很少； b、產(chǎn)品濃縮在基質(zhì)里，往往不要過(guò)濾濃縮就可以使用；c、即使要萃取制成酶 制劑，所需的溶劑量較少；d、成品儲(chǔ)藏所需的場(chǎng)地較少；
2)同液體發(fā)酵相比具有單位基質(zhì)酶活水平高，發(fā)酵周期短，生產(chǎn)成本低等 特點(diǎn)，為實(shí)際大規(guī)模應(yīng)用提供了便利條件。 具體實(shí)施方案
實(shí)施例1磷脂酶D酶活測(cè)定
步驟一隨機(jī)均勻的取10g固體發(fā)酵物，加入50mL純凈水，振蕩搖勻， 在20'C條件下浸泡lh，離心分離得到含磷脂酶D的浸出液。同時(shí)，另外再隨機(jī) 均勻的取10g固體發(fā)酵物，測(cè)定其中的絕干物質(zhì)含量。
步驟二:30mL0.1 mol/L醋酸鈉緩沖液(用NaOH調(diào)pH值至7.5)中含有0.15 mol/L絲氨酸、5 mmol/L氯化鈣，同時(shí)加入1 mL浸出液，與15 mL含有0.75 mmol卵磷脂的氯仿混合，在30'C下以200轉(zhuǎn)每分鐘的速度混合得到均勻的乳狀 液進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)6小時(shí)后，停止轉(zhuǎn)動(dòng)，雙液相靜止分層。提取lmL有機(jī)相， 經(jīng)揮發(fā)后，剩余物經(jīng)氯仿洗滌2次，最后溶解于50^L氯仿中，HPLC法分析產(chǎn)
物生成量。采用的流動(dòng)相為乙腈甲醇85%磷酸=100 : io : 0.8，檢測(cè)波長(zhǎng)206
nm，進(jìn)樣量15^iL，流速為110 mL/min，利用外標(biāo)法(以磷脂酰絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)品為
外標(biāo)物)計(jì)算底物卵磷脂的轉(zhuǎn)化率。
磷脂酶D的酶活定義為每小時(shí)轉(zhuǎn)化l,ol大豆卵磷脂所需要的酶量(mg)。 步驟三將步驟二測(cè)定得到的浸出液中磷脂酶D的酶活進(jìn)一步換算成固態(tài)
發(fā)酵基質(zhì)中每克絕干物質(zhì)磷脂酶D的酶活。 實(shí)施例2固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)磷脂酶D
麥糟粉碎細(xì)度為2cm，小麥、麩皮、豆餅粉的粉碎細(xì)度為0.55 cm。取麥糟 500 g，小麥粉15g，麩皮40g，豆餅粉30g混和，并加入水825 g，在加水的 同時(shí)加入磷酸二氫鉀3.5 g、七水硫酸鎂0.7g、葡萄糖8.4g;肉桂鏈輪絲菌的接 種量為固體培養(yǎng)基總質(zhì)量的8% (體積質(zhì)量比)，發(fā)酵初始水份為61.7%;發(fā)酵 初始pH7.0，發(fā)酵過(guò)程品溫28 °C，發(fā)酵時(shí)間96小時(shí)。獲得的磷脂酶D酶活為 每克絕干物料4210單位。
實(shí)施例3固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)磷脂酶D
麥糟粉碎細(xì)度為2cm，小麥、麩皮、豆餅粉的粉碎細(xì)度為0.55 cm。取麥糟 500 g，小麥粉10 g，麩皮25 g，豆餅粉15 g混和，并加入水900 g，在加水的 同時(shí)加入磷酸二氫鉀1.45 g、七水硫酸鎂0.435 g、葡萄糖5.8g;肉桂鏈輪絲菌 的接種量為固體培養(yǎng)基總質(zhì)量的10% (體積質(zhì)量比)，發(fā)酵初始水份為68.0%; 發(fā)酵初始pH6.8，發(fā)酵過(guò)程品溫32 'C，發(fā)酵時(shí)間72小時(shí)。獲得的磷脂酶D酶 活為每克絕干物料3618單位。
實(shí)施例4固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)磷脂酶D
麥糟粉碎細(xì)度為2cm，小麥、麩皮、豆餅粉的粉碎細(xì)度為0.55 cm。取麥糟 500 g，小麥粉25g，麩皮50g，豆餅粉40g混和，并加入水615g，在加水的 同時(shí)加入磷酸二氫鉀4.92g、七水硫酸鎂0.922 g、葡萄糖12.3g;肉桂鏈輪絲菌 的接種量為固體培養(yǎng)基總質(zhì)量的5% (體積質(zhì)量比)，發(fā)酵初始水份為56.0。/^; 發(fā)酵初始pH 7.2，發(fā)酵過(guò)程品溫25 °C，發(fā)酵時(shí)間120小時(shí)。獲得的磷脂酶D 酶活為每克絕干物料3779單位。
實(shí)施例5固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)磷脂酶D
麥糟粉碎細(xì)度為3 cm，小麥、麩皮、豆餅粉的粉碎細(xì)度為0.45 cm。取麥糟 500 g，小麥粉20g，麩皮30g，豆餅粉35g混和，并加入水850 g，在加水的 同時(shí)加入磷酸二氫鉀3.6g、七水硫酸鎂0.79g、葡萄糖11.4g;肉桂鏈輪絲菌的 接種量為固體培養(yǎng)基總質(zhì)量的7.5% (體積質(zhì)量比)，發(fā)酵初始水份為65.1%; 發(fā)酵初始pH7.0，發(fā)酵過(guò)程品溫30 。C，發(fā)酵時(shí)間90小時(shí)。獲得的磷脂酶D酶 活為每克絕干物料4108單位。
實(shí)施例6固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)磷脂酶D
麥糟粉碎細(xì)度為1 cm，小麥、麩皮、豆餅粉的粉碎細(xì)度為0.75 cm。取麥糟
500 g，小麥粉20g，麩皮35g，豆餅粉35g混和，并加入水775 g，在加水的 同時(shí)加入磷酸二氫鉀2.8g、七水硫酸鎂0.82g、葡萄糖6.8g;肉桂鏈輪絲菌的 接種量為固體培養(yǎng)基總質(zhì)量的6% (體積質(zhì)量比)，發(fā)酵初始水份為60.5%;發(fā) 酵初始pH 7.1，發(fā)酵過(guò)程品溫28 。C，發(fā)酵時(shí)間108小時(shí)。獲得的磷脂酶D酶 活為每克絕干物料3964單位。
實(shí)施例7固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)磷脂酶D
麥糟粉碎細(xì)度為1 cm，玉米芯粉碎細(xì)度為2 cm，干玉米秸稈粉碎細(xì)度為3 cm;小麥、麩皮、豆餅粉的粉碎細(xì)度為0.65 cm。取麥糟100g，玉米芯300 g， 干玉米秸稈100g,小麥粉22.5g，麩皮37.5g，豆餅粉35g混和，并加入水725 g，在加水的同時(shí)加入磷酸二氫鉀3.9g、七水硫酸鎂0.9g、葡萄糖11.5g;肉桂 鏈輪絲菌的接種量為固體培養(yǎng)基總質(zhì)量的9% (體積質(zhì)量比)，發(fā)酵初始水份為 62.0%;發(fā)酵初始pH6.9，發(fā)酵過(guò)程品溫31 'C，發(fā)酵時(shí)間84小時(shí)。獲得的磷 脂酶D酶活為獲得的磷脂酶D酶活為每克絕干物料4059單位。
實(shí)施例8固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)磷脂酶D
麥糟粉碎細(xì)度為2.5 cm，玉米芯粉碎細(xì)度為2 cm，小麥、麩皮、豆餅粉的 粉碎細(xì)度為0.60cm。取麥糟250g，玉米芯250 g，小麥粉20 g，麩皮37g，豆 餅粉28g混和，并加入水700 g，在加水的同時(shí)加入磷酸二氫鉀2.8 g、七水硫 酸鎂0.81g、葡萄糖7.0g;肉桂鏈輪絲菌的接種量為固體培養(yǎng)基總質(zhì)量的5.5% (體積質(zhì)量比)，發(fā)酵初始水份為59.5%;發(fā)酵初始pH 7.0，發(fā)酵過(guò)程品溫26 °C ， 發(fā)酵時(shí)間112小時(shí)。獲得的磷脂酶D酶活為獲得的磷脂酶D酶活為每克絕干物 料3874單位。
實(shí)施例9固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)磷脂酶D
玉米芯粉碎細(xì)度為2cm，其余同實(shí)施例l，獲得的磷脂酶D酶活為獲得的 磷脂酶D酶活為每克絕干物料4186單位。 實(shí)施例IO固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)磷脂酶D
玉米芯粉碎細(xì)度為1.5 cm，其余同實(shí)施例7，獲得的磷脂酶D酶活為獲得的 磷脂酶D酶活為每克絕干物料4102單位。 實(shí)施例ll固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)磷脂酶D
干玉米秸稈碎細(xì)度為2 cm，其余同實(shí)施例l，獲得的磷脂酶D酶活為獲得 的磷脂酶D酶活為每克絕干物料4121單位。 實(shí)施例12固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)磷脂酶D
玉米芯粉碎細(xì)度為1.5 cm，干玉米秸稈碎細(xì)度為2 cm，其余同實(shí)施例8， 獲得的磷脂酶D酶活為獲得的磷脂酶D酶活為每克絕干物料3911單位。
以上實(shí)施方案，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員很顯然可以做很多改進(jìn)和變化而不會(huì) 背離本發(fā)明的基本精神。所有這些變化和改進(jìn)都在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1、一種磷脂酶D的生產(chǎn)方法，其特征在于以小麥、麩皮、豆餅粉和麥糟為固態(tài)基質(zhì)，并添加磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂和葡萄糖，通過(guò)固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)磷脂酶D；
以肉桂鏈輪絲菌AS 4.1084為出發(fā)菌株；
固態(tài)基質(zhì)以麥糟為基本質(zhì)量單位，小麥、麩皮、豆餅粉添加比例為小麥添加麥糟質(zhì)量的2％～5％，麩皮添加麥糟質(zhì)量的5％～10％，豆餅粉添加麥糟質(zhì)量的3％～8％；固態(tài)基質(zhì)按常規(guī)加水進(jìn)行蒸煮備用；
磷酸二氫鉀的添加量為固態(tài)基質(zhì)和水總質(zhì)量的0.1％～0.4％，七水硫酸鎂的添加量為固態(tài)基質(zhì)和水總質(zhì)量的0.03％～0.075％，葡萄糖的添加量為固態(tài)基質(zhì)和水總質(zhì)量的0.4％～1％；
固態(tài)發(fā)酵條件接種量為菌株的種子培養(yǎng)液與固態(tài)培養(yǎng)基總質(zhì)量的體積質(zhì)量比為5％～10％，發(fā)酵初始水份為56％～68％；發(fā)酵初始pH 6.8～7.2，發(fā)酵過(guò)程品溫25～32℃，發(fā)酵時(shí)間72～120小時(shí)。
2、 根據(jù)權(quán)利要求
1所述的磷脂酶D的生產(chǎn)方法，其特征在于麥糟改用麥糟、 玉米芯、干玉米秸稈中的任意一種或幾種的組合物替代。
3、 根據(jù)權(quán)利要求
2所述的磷脂酶D的生產(chǎn)方法，其特征在于麥糟、玉米芯、 干玉米秸稈需粉碎，粉碎的細(xì)度為l 3cm。
專利摘要
一種磷脂酶D的生產(chǎn)方法，涉及發(fā)酵領(lǐng)域。本發(fā)明采用固態(tài)發(fā)酵的方法生產(chǎn)磷脂酶D，以小麥、麩皮、豆餅粉和麥糟為固態(tài)基質(zhì)，并添加磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂、葡萄糖等物質(zhì)，通過(guò)固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)磷脂酶D。采用肉桂鏈輪絲菌進(jìn)行發(fā)酵，接種量為固體培養(yǎng)基總質(zhì)量的5％～10％(體積質(zhì)量比)，發(fā)酵初始水份為56％～68％；發(fā)酵初始pH 6.8～7.2，發(fā)酵過(guò)程品溫25～32℃，發(fā)酵時(shí)間72～120小時(shí)。本發(fā)明具有單位基質(zhì)酶活水平高，發(fā)酵周期短，生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)，為實(shí)際大規(guī)模應(yīng)用提供了便利條件。
文檔編號(hào)C12N9/16GKCN101182498SQ200710135354
公開(kāi)日2008年5月21日 申請(qǐng)日期2007年11月7日
發(fā)明者斌 吳, 梁 張 申請(qǐng)人:江南大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan