專利名稱：:一株克勞氏芽孢桿菌突變株及其發(fā)酵生產(chǎn)堿性果膠酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
：。技術(shù)背景目前堿性果膠酶在生物工程領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛，其應(yīng)用領(lǐng)域包括棉纖維的生物精練、植物韌皮纖維脫膠、造紙、處理果膠廢水、咖啡和茶發(fā)酵、洗滌劑等。中國專利(公開號CN1480529A)中公開了一株短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)CCTCCNo:M203042經(jīng)液體深層發(fā)酵生產(chǎn)堿性果膠酶，可用于棉紡織物精練處理。中國專利(公開號CN1177003A)中公開了一株嗜堿芽孢桿菌(Bacillusalcalophilus)CCTCCM96009能直接用于苧麻脫膠。中國專利(公開號CN1113951A)中公開了一株枯草芽孢桿菌(BacillusSubtilis)CCTCCNo:0213經(jīng)高濃度液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)堿性果膠酶。我們從堿性土壤中分離篩選出一株嗜堿細(xì)菌，具有較高的產(chǎn)堿性果膠酶能力，經(jīng)鑒定為克勞氏芽孢桿菌(Bacillusclausii)，我們也研究過該菌株發(fā)酵生產(chǎn)堿性果膠酶的性質(zhì)(張保國，白志輝，李祖明，張國政，張洪勛.克勞氏芽孢桿菌S-4菌株固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)堿性果膠酶.食品與發(fā)酵工業(yè).2005，31(3):8-11)。本發(fā)明將該原始菌株進(jìn)行紫外誘變，得到高產(chǎn)堿性果膠酶的突變株，目前還沒有用該突變株菌株進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)堿性果膠酶的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一株嗜堿細(xì)菌克勞氏芽孢桿菌的突變株，它具有很高的產(chǎn)堿性果膠酶能力；并提供一種利用該菌株發(fā)酵生產(chǎn)堿性果膠酶的方法。該菌株是將從堿性土壤中分離得到的克勞氏芽孢桿菌產(chǎn)堿性果膠酶菌株，經(jīng)紫外誘變得到的堿性果膠酶高產(chǎn)突變株(BacillusclausiiN_10)，其產(chǎn)堿性果膠酶的能力比原始菌株提高50%，經(jīng)連續(xù)培養(yǎng)性能穩(wěn)定。菌種保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，編號為CGMCCNo.2073?！N生產(chǎn)堿性果膠酶的方法，是以甜菜粕為碳源，加入氮源棉粕，磷酸鹽、碳酸鈉和水，接種編號為CGMCCNo.2073的嗜堿細(xì)菌，采用固態(tài)發(fā)酵方法生產(chǎn)堿性果膠酶。采用該菌株進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)堿性果膠酶的步驟如下1、菌種保藏?？藙谑涎挎邨U菌突變株N-10保藏于4t:冰箱內(nèi)堿性瓊脂培養(yǎng)基斜面，半年轉(zhuǎn)接一次。培養(yǎng)基組成胰蛋白胨1.5%，大豆蛋白胨0.2%，酵母浸膏0.3%，葡萄糖0.2X，NaCl0.2%，K2HP040.12%，NaC030.3%，瓊月旨1.5%，于115。C滅菌15分鐘。2、種子培養(yǎng)。液體培養(yǎng)基組成果膠0.5%，酵母浸膏1%，MgS047H200.05%，K2HP040.1%，NaC030.3%;于115"滅菌15分鐘。接種，35"搖瓶培養(yǎng)24小時(shí)，既得液體種子。3、固態(tài)發(fā)酵。產(chǎn)堿性果膠酶固態(tài)培養(yǎng)基是向含果膠固體生物質(zhì)(甜菜粕、麩皮、葵花盤、橘皮、米糠、蘋果渣等)中添加3%重量的棉粕和2.5倍重量的營養(yǎng)液制成，營養(yǎng)液組成麥芽糖1.2%，磷酸二氫鉀0.12%，碳酸鈉1.2%。甜菜粕和棉粕混勻后和營養(yǎng)液分別于115t:滅菌15分鐘，營養(yǎng)液與甜菜渣的重量比為2.5:1，混合均勻，接種液體種子，于4(TC靜態(tài)培養(yǎng)72小時(shí)。4、酶的提取和凈化。固態(tài)發(fā)酵后的物料，加入10倍重量的pH為10的0.05mo1/L的Na2C03/NaHC03緩沖溶液，浸泡30分鐘，在高速離心機(jī)中進(jìn)行固液分離，提取液用孔徑0.1ym的微濾膜過濾除去菌體，濾液用截留分子量為10000的超濾膜濃縮，收集濃縮液，即堿性果膠酶溶液，貯藏。以下通過具體實(shí)施例詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施，目的在于幫助讀者更好地理解本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)，但不作為對本發(fā)明實(shí)施范圍的限定。實(shí)施例1:不同氮源對產(chǎn)酶的影響向甜菜粕中添加2.5倍重量的營養(yǎng)液，營養(yǎng)液組成不同氮源1.2%，磷酸二氫鉀0.12%，碳酸鈉1.0%。甜菜粕和營養(yǎng)液分別于115t:滅菌15分鐘，按重量比l:2.5混合均勻，接種液體種子，于4(TC靜態(tài)培養(yǎng)72小時(shí)。結(jié)果見表1。表1:不同氮源對產(chǎn)酶的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>[0017]實(shí)施例2:不同碳酸鈉添加量對產(chǎn)酶的影響向甜菜粕和棉粕的混合物中(5份甜菜粕+3%份棉粕)中添加2.5倍重量的營養(yǎng)液，營養(yǎng)液組成凌芽糖1.2%，磷酸二氫鉀0.12%，碳酸鈉不同量。甜菜粕和棉粕的混合物與營養(yǎng)液分別于115t:滅菌15分鐘，按重量比l:2.5混合均勻，接種液體種子，于4(TC靜態(tài)培養(yǎng)72小時(shí)。結(jié)果見表2。當(dāng)碳酸鈉1.2%時(shí)，產(chǎn)酶率最高，達(dá)到3300單位/克干底物。[0019]表2:不同碳酸鈉添加量對產(chǎn)酶的影響營養(yǎng)液中碳酸鈉含量(％)酶產(chǎn)率(Xl(^U/g干底物)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>注采用DNS法測定酶活，1個(gè)酶活力單位(u)定義為在55°C，pH10反應(yīng)條件下，每分鐘降解聚半乳糖醛酸鈉產(chǎn)生1ymol半乳糖醛酸所需的酶的量。表中結(jié)果為三次平行實(shí)驗(yàn)的平均值，相對偏差小于10%。權(quán)利要求一株產(chǎn)堿性果膠酶的嗜堿細(xì)菌，其特征在于，該嗜堿細(xì)菌是一株克勞氏芽孢桿菌突變株N-10(BacillusclausiiN-10)，能夠利用甜菜粕發(fā)酵生產(chǎn)堿性果膠酶，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo.2073。2.—種利用權(quán)利要求1所述嗜堿細(xì)菌生產(chǎn)堿性果膠酶的方法，其特征在于，以甜菜粕為碳源，加入氮源棉粕，磷酸鹽、碳酸鈉和水，接種權(quán)利要求1所述嗜堿細(xì)菌，采用固態(tài)發(fā)酵方法生產(chǎn)堿性果膠酶。3.權(quán)利要求2所述的生產(chǎn)堿性果膠酶的方法，其特征在于，固態(tài)發(fā)酵后的物料加入10倍重量的pH為10的Na2C03/NaHC03緩沖溶液，浸泡30分鐘，在高速離心機(jī)中進(jìn)行固液分離，提取液用孔徑0.1m的微濾膜過濾除去菌體，濾液用截留分子量為10000的超濾膜濃縮，收集濃縮液，即堿性果膠酶溶液，貯藏。專利摘要本發(fā)明提供了一株高產(chǎn)堿性果膠酶的克勞氏芽孢桿菌(Bacillusclausii)N-10突變株，并提供了一種利用該菌株發(fā)酵制備堿性果膠酶的方法。屬于生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
：。發(fā)明以甜菜粕為碳源和誘導(dǎo)物，棉粕為氮源，添加適當(dāng)麥芽糖、磷酸鹽、碳酸鈉和水分，接種克勞氏芽孢桿菌(Bacillusclausii)N-10菌株，在接觸空氣條件下，于溫度40℃左右，靜態(tài)培養(yǎng)72小時(shí)左右達(dá)到產(chǎn)酶高峰。用Na2CO3/NaHCO3緩沖溶液浸提培養(yǎng)物，過濾，濾液即堿性果膠酶液，超濾濃縮得到濃縮酶液或噴霧干燥得到堿性果膠酶干粉。經(jīng)DNS法測定酶活力，堿性果膠酶產(chǎn)率達(dá)到3300單位/克干底物。(酶活力單位定義為在pH10，溫度55℃條件下每分鐘降解聚半乳糖醛酸鈉產(chǎn)生1μmol半乳糖醛酸所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。)文檔編號C12R1/07GKCN101096650B發(fā)布類型授權(quán)專利申請?zhí)朇N200710100383公開日2010年5月26日申請日期2007年6月11日發(fā)明者李祖明,李鴻玉,白志輝,陳艷申請人:北京聯(lián)合大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX,EndNote,RefMan