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Cho細胞生產的人源抗甲肝病毒基因工程抗體的制作方法

文檔序號:63889閱讀:301來源:國知局
專利名稱:Cho細胞生產的人源抗甲肝病毒基因工程抗體的制作方法
技術領域
本發(fā)明屬于生物工程和生物制藥技術領域
。
背景技術
本發(fā)明包括兩株人源抗甲肝病毒中和性基因工程抗體。分別由中國
鼠卵巢細胞(CHO)生產細胞系生產。其抗體及其制劑可用于制備診斷、預防和治療由甲型肝炎病毒感染引起的甲型肝炎的藥物或試劑。
傳染病所致死亡病例數在全世界死亡人口中仍占首位,而病毒性肝炎是嚴重危害我國人民健康的傳染病。在法定報告的傳染病中,各種肝炎病毒引起的急、慢性肝炎在我國所有傳染病中發(fā)病率和死亡率均占首位。甲型肝炎(甲肝)是由甲肝病毒引起的急性傳染病,感染對象以青少年及兒童為主,成年人發(fā)病率也呈上升趨勢,它是各種病毒性肝炎中發(fā)病率最高的一種,每年發(fā)生的急性病毒性肝炎中,約有50%為甲型肝炎。我國是甲肝流行最嚴重的國家之一,雖然甲肝疫苗的使用已經降低了甲肝的發(fā)病率,但每年在我國局部地區(qū)仍有一定規(guī)模的爆發(fā)流行,而一旦發(fā)生傳染病爆發(fā)流行,特異性抗體制劑的防御和治療將比疫苗更迅速有效。
至今為止,大多數病毒性疾病無特異性治療藥物,用于臨床治療和預防某些病毒性疾病的生物制品仍然以血制品為主,如多年來臨床上使用的血源性丙種球蛋白,用于甲肝或乙肝病毒引起的病毒性肝炎以及麻疹等預防,這些血制品中不僅非特異性雜蛋白多,特異性抗體含量很低,而且最大的問題是血源制品潛在的未能檢出的病源污染問題,從長遠利益考慮應當摒棄。作為一類新興起的生物工程藥,人源抗病毒基因工程抗體以其對人體無免疫原性,無污染源,特異性抗病毒療效及連續(xù)規(guī)模生產可行性等優(yōu)勢逐漸成為預防和治療病毒性疾病的一類有實際運用前景的新產品。目前美國FDA批準上市或待批的生物制品中,各種形式的單克隆抗體和基因工程抗體占到一定比例,目前已批準上市的67種生物制品中,治療和預防用單克隆抗體和基因工程抗體共有9種。正在待批中的抗體有35種。其中已批準上市并且產生巨大經濟和社會效益的四種人源化基因工程抗體中,其中有一種即為抗病毒基因工程抗體,其商品名為“SynagisTM″,為人源化抗呼吸道合胞病毒(RSV)基因工程抗體。
因此以人源基因工程產品替代血制品已成為國內外研究的一大方向,并正在逐步走向成功。用純鼠源單克隆抗體預防和治療病毒性疾病在國際上尚無任何批準的先例,鼠源抗體人用最大的不利之處為異源蛋白,在人體內易引起遺傳免疫排斥而使抗體失效并引起免疫性疾病。因此,特異性抗病毒人源中和性抗體是病毒性疾病預防和治療的最有前景的生物制品之一??辜赘慰贵w制劑研制成功,將為國內外首創(chuàng),有可能獲一類新藥證書。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是將已獲得的中和性抗甲肝病毒Fab抗體基因(詳見專利公開號為CN1316437A的專利申請)與人源IgG恒定區(qū)基因重組,通過哺乳類細胞表達系統(tǒng),在哺乳類細胞CHO細胞中生產針對甲肝病毒的具有明顯中和功能的分泌型完全人源IgG抗體,為將來取代目前市場上的血源性丙種球蛋白,研究開發(fā)新的臨床抗病毒預防和治療用特異性抗體藥物提供可行性研究。
本發(fā)明包括以CHO生產細胞系生產的兩株人源抗甲肝病毒中和性基因工程抗體及其抗體制劑,陳述如下1.人源抗甲肝病毒基因工程抗體,其特征在于1)為來源于噬菌體人源抗體庫篩選的與人源IgGFc基因重組后在CHO穩(wěn)定表達細胞的全人源IgG1λ全抗體,它由兩條重鏈和兩條λ-κ嵌合輕鏈組成,分子量為150kD左右,命名ChHAIgG16;2)為來源于噬菌體人源抗體庫篩選的與人源IgGFc基因重組后在CHO穩(wěn)定表達細胞的全人源IgG1κ全抗體,它由兩條重鏈和兩條κ輕鏈組成,分子量為150kD左右,命名ChHAIgG78;3)人源抗甲肝病毒基因工程抗體ChHAIgG16或ChHAIgG78,其可變區(qū)基因組成特征為特異性的輕鏈和重鏈基因,來源于對人源抗甲肝病毒抗體基因庫的特異性富積篩選表達,其相應的三個CDR區(qū)序列為本抗體特有的全新序列,其中ChHAIgG16輕鏈和重鏈可變區(qū)基因序列已在專利公開號為CN1316437A專利申請中陳述;ChHAIgG78輕鏈可變區(qū)CDR1,CDR2和CDR3序列為分別“RASQSVSSSYLA”,“GASSRAT”和“QQYGSSPLT”;HAV78IgG重鏈可變區(qū)CDR1,CDR2和CDR3序列為分別“SHEMN”,“YIGSRGSDTSYADSVKGR”和“ERYRYFEDYYHGLDV”,其基因特征決定了其對甲肝病毒的親和力和中和保護功能;4)人源抗甲肝病毒基因工程抗體ChHAIgG16或ChHAIgG78,其輕重鏈先導序列和恒定區(qū)基因來源于哺乳類細胞人源抗體高效表達載體VH-dhfr1和VK-dhfr1,該載體已在專利公開號為CN1363682專利申請中陳述;5)是通過哺乳類細胞表達載體系統(tǒng),在CHO工程細胞系中生產的特異性結合和識別甲肝病毒外殼蛋白的高親和力中和性人源完全抗體,具有與天然抗體分子類似的全抗體分子結構特征;其結合甲肝病毒外殼蛋白和中和病毒感染的功能由存在于抗體基因輕鏈和重鏈可變區(qū)的決定族互補區(qū)域CDR1、CDR2和CDR3中特異性核苷酸序列決定,其相應的氨基酸序列構成了抗體的特異性抗原結合區(qū)域。
2.用于生產人源抗甲肝病毒基因工程抗體的CHO工程細胞系的特征在于1)為穩(wěn)定高效表達人源抗甲肝病毒中和性基因工程抗體ChHAIgG16的CHO工程細胞系;2)為穩(wěn)定高效表達人源抗甲肝病毒中和性基因工程抗體ChHAIgG78的CHO工程細胞系;3)可被放大規(guī)模生產,其生產的抗體為分泌型抗體,可從培養(yǎng)上清中獲得;4)經無血清細胞培養(yǎng)后,可通過親和層析過程從其培養(yǎng)上清中經純化而獲得抗體蛋白。
3.人源抗甲肝病毒基因工程抗體制劑HAMaxTM,其特征在于為包含ChHAIgG16和ChHAIgG78兩種抗體中的一種抗體單一的或兩種混合的靜脈注射用、肌肉注射用、口服或外用的抗體制劑;其對甲肝病毒抗原具有很高的親和力,并具有在體外完全中和甲肝病毒和體內完全保護猴子抵御甲肝病毒攻擊。
4.CHO細胞生產的人源抗甲肝病毒基因工程抗體極其抗體制劑HAMaxTM的用途,其特征在于1)可用于預防或治療由甲肝病毒引起的甲型肝炎藥物的制備;2)可用于診斷甲肝病毒感染的試劑的制備;3)可用于預防和治療由甲肝病毒感染引起的甲型肝炎的靜脈注射用、肌肉注射用、口服或外用的生物制劑的制備。
總而言之,本發(fā)明陳述的人源抗甲肝病毒中和性基因工程全抗體,是在獲得抗體基因的基礎上獲得全抗體基因產物的表達,此抗體基因可隨著質粒DNA在細菌內的復制而穩(wěn)定復制,并已被重組到CHO細胞DNA中,形成穩(wěn)定表達細胞系。利用此穩(wěn)定表達細胞系,可在CHO細胞中連續(xù)規(guī)模生產抗甲肝病毒全抗體,所述抗體具有識別甲肝病毒核殼蛋白上中和抗原,從而阻斷甲肝病毒感染的功能,利用其高度中和甲肝病毒感染的功能特性和與天然抗體分子類似的全抗體分子結構特征,制備抗體制劑,可望在臨床上替代目前市場上的血制品丙種球蛋白而用于預防和治療由甲肝病毒感染引起的甲型肝炎。
四、


1.圖1為ChHAIgG78輕重鏈可變區(qū)由核甘酸序列推導的氨基酸序列,包括抗體可變區(qū)的框架區(qū)(FR)和高變區(qū)(CDR)。
2.圖2為用FITC標記的抗人IgGK鏈(2A)和抗人IgGFc(2B)熒光抗體染色的第30代ChHAIgG16CHO細胞表達人源IgG抗體的熒光。
3.圖3為ELISA檢測穩(wěn)定傳代中HAIgG16和HAIgG78兩株CHO工程細胞系表達上清中分泌的IgG抗體含量。
4.圖4為SDS-PAGE電泳分析CHO細胞中表達的親和層析純化的人源抗甲肝病毒IgG抗體。
5.圖5為測定人源抗甲肝病毒基因工程抗體的親和力和國際單位比較的ELISA分析結果。
6.圖6為人源抗甲肝病毒基因工程抗體的體外中和效力檢測。
7.圖7為ChHAIgG16和ChHAIgG78與HRP標記鼠抗甲肝病毒中和抗體的競爭ELISA分析。
8.圖8為免疫組和對照組恒河猴HAV抗體及ALT的動態(tài)變化。
具體實施方式
以下的優(yōu)先實施例對本發(fā)明作詳細說明,但不意味著限制本發(fā)明的內容。在這些實施例中,為說明本發(fā)明,采用的抗體Fab基因和哺乳類細胞人源抗體高效表達載體均來自本實驗室發(fā)明。所用主要菌株為商品化產品XLI-Blu(美國Strategene公司)。CHO細胞購自美國ATCC。甲肝病毒為本研究所肝炎室從我國病人分離的龍甲株,現(xiàn)由肝炎室保存,可向相關技術領域
的研究機構或單位公開提供(參見專利公開號為CN1316437A的專利申請)。
實施例1為CHO細胞生產的人源抗甲肝病毒基因工程抗體基因的序列特征;實施例2-4為CHO細胞生產的人源抗甲肝病毒基因工程抗體的克隆制備方法;實施例5為CHO細胞生產的人源抗甲肝病毒基因工程抗體的蛋白特征;實例6-9為CHO細胞生產的人源抗甲肝病毒基因工程抗體功能特征。
實例1,CHO細胞生產的人源抗甲肝病毒基因工程抗體基因的序列特征其可變區(qū)基因組成特征為特異性的輕鏈和重鏈基因,來源于對人源抗甲肝病毒抗體基因庫的特異性富積篩選表達,其相應的三個CDR區(qū)序列為本抗體特有的全新序列,其中ChHAIgG16輕鏈和重鏈可變區(qū)基因序列已在專利公開號為CN1316437A專利申請中陳述。ChHAIgG78輕鏈可變區(qū)CDR1,CDR2和CDR3序列為分別“RASQSVSSSYLA”,“GASSRAT”和“QQYGSSPLT”。其完整核甘酸序列如下GAGCTCACGCAGTCTCCA GGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGG GAAAGAGCCACC CTC TCC TGC AGG GCCAGTCAGAGTGT AGCAGCAGCTACTTA GCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGC ATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGT AGCTCACCGCTCACTTTCGGCGGA GGGACCAAG GTGGAGATCAAACGA ACTGTGChHAIgG78重鏈可變區(qū)CDR1,CDR2和CDR3序列為分別“SHEMN”,“YIGSRGSDTSYADSVK”其完整核甘酸序列如下CTCGAGTCTGGGGGAGGCTTGATACAGCCCGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGTAGCCTCTGGATTC AGGTTCAGTAGTCATGAAATGAACTGGGTC CGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTTTCATACATCGGTAGTCGTGGTAGTGACACATCCTACGCAGACTCTGTGAAGGGCCGCTTCACC GTC TCCAGA GAC AAC
GCC CGG AAC ACA CTG TAT CTG CAA ATG AACAACCTGA GAGCCGAGGACACGGCTGTTTATTACT GTGCGCGAGAGAGG TAT CGA TACTTTGAA GACTACTATCACGGTTT GACGTCTGGGGCCAAGGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA圖1為ChHAIgG78輕重鏈可變區(qū)由核甘酸序列推導的氨基酸序列,包括抗體可變區(qū)的框架區(qū)(FR)和高變區(qū)(CDR)。
實例2,CHO細胞生產的人源抗甲肝病毒基因工程抗體基因的克隆重組將通過噬菌體表面呈現(xiàn)系統(tǒng)獲得的抗甲肝病毒中和抗體Fab基因克隆入本實驗室發(fā)明的人源抗體高效表達表達載體中。其中,ChHAIgG16和ChHAIgG78輕鏈可變區(qū)基因以EcoRV和XhoI內切酶位點分別克隆入載體VK-dhfrl中(該載體已在專利公開號為CN1363682專利申請中陳述),置于EF-1α啟動子控制之下,獲得表達載體16VL-dhfr和78VK-dhfr。ChHAIgG16和ChHAIgG78重鏈可變區(qū)基因以BssHII和BstE II分別克隆入載體VH-dhfr1中(該載體已在專利公開號為CN1363682專利申請中陳述),獲得表達載體16VH-dhfr和78VH-dhfr。載體質粒DNA經柱層析純化(QiagenMidi Kit,Qiagen公司,美國)后用于轉染CHO細胞。
實例3,高效穩(wěn)定表達人源IgG抗體的CHO細胞系的建立極其表達用LipofectinAINE 2000轉染試劑盒(GIBCO BRL公司,美國)將純化的表達載體質粒DNA和LipofectAMINE Plus共轉染24孔板中長成單層CHO-dhfr-細胞(美國ATCC商品號CRL-9096),24小時后撤除IMDM培養(yǎng)基(GIBCO BRL公司,美國)中用于維持CHO-dhfr細胞生長的次品黃嘌呤(H)和胸腺嘧啶(T),并按1∶20-30稀傳入T25方瓶。24小時后加入篩選藥物氨甲喋呤(MTX,Sigma公司,美國),起始濃度為10-7M,逐漸加大至10-6M,在壓藥過程中挑選雙重表達IgG重鏈和輕鏈基因的陽性克隆獲得重組完全人源IgG抗體的表達。
實例4,人源抗甲肝病毒全抗體基因在CHO細胞中的穩(wěn)定傳代表達根據實例2方法,首先建成人源抗甲肝病毒全抗體ChHAIgG16和ChHAIgG78 CHO細胞工程細胞系,將高效表達人源抗甲肝病毒全抗體基因的目的細胞系以耐受MTX10-8M或2×10-6M的代次為第一代,在含10%新生牛血清的IMDM培養(yǎng)條件下1∶4傳代,每代細胞約生長3-4天,收集每代細胞的表達上清以備檢測。用免疫熒光方法檢測不同代次序CHO細胞內IgG1抗體的表達。如圖2所示,是用FITC標記的抗人IgGK鏈(2A)和抗人IgGFc(2B)熒光抗體染色的第30代ChHAIgG16CHO細胞表達人源IgG抗體的熒光。其細胞表達陽性率在穩(wěn)定傳代第30代次時仍然穩(wěn)定在此基礎上95%以上。在用ELISA夾心法檢測感傳代細胞表達上清中分泌的IgG抗體,用抗人IgGFab抗體(Sigma公司,美國)包被ELISA板,加待檢測的不同稀釋度的CHO細胞表達上清后,加HRP標記的抗人IgGFc抗體,顯色后檢測O.D值,并與用已知濃度的人源IgG標準品(SIgG)和已知濃度的純化ChHAIgG16(RIgG)ELISA檢測標準曲線進行比較,計算出表達上清中的IgG含量。如圖3所示,是ELISA檢測穩(wěn)定傳代中HAIgG16和HAIgG78兩株CHO工程細胞系表達上清中分泌的IgG抗體含量,其中ChHAIgG16工程細胞系表達水平穩(wěn)定在50-60mg/L,而HAIgG78工程細胞系表達水平穩(wěn)定在40-50mg/L。
實例5,CHO細胞生產的人源抗甲肝病毒基因工程抗體的親和層析純化收集CHO細胞無血清培養(yǎng)上清,2000G離心,用低蛋白吸附濾膜過濾上清,將濾過后上清過ProteinG親合層析柱,洗脫中和,經脫鹽柱脫鹽。圖4是SDS-PAGE電泳分析CHO細胞中表達的親和層析純化的人源抗甲肝病毒IgG抗體。其中圖4A為還原條件下的純化抗甲肝病毒IgG抗體重鏈(50KD)和輕鏈(25KD)電泳帶,從左至右分別為蛋白分子標準品,ChHAIgG16純化抗體0.5ug,1ug和2ug,人源IgG標準品0.5ug,1ug和2ug。圖4B為非還原條件下的純化抗甲肝病毒IgG抗體H2L2四聚體電泳帶。從左至右分別為蛋白分子標準品,ChHAIgG16純化抗體0.5ug,1ug和2ug,人源IgG標準品0.5u,HAIgG78純化抗體0.5ug,1ug和2ug。
實例6,CHO細胞生產的人源抗甲肝病毒基因工程抗體的親和力測定極其國際標準單位比較用純化的甲肝病毒包被ELISA板,將實例4中純化的HAIgG16抗體和HAIgG78抗體濃度調整到1mg/ml,以1∶400起始(每孔0.25ug),1∶2倍比稀釋,將不同稀釋度的樣品加入孔中,37C反應后,加HRP標記的抗人IgGFc抗體,顯色后檢測O.D值。同時與來自生物制品檢定所78國際單位/ml標準丙種球蛋白相比較測定其標準國際單位。圖5是測定人源抗甲肝病毒基因工程抗體的親和力和國際單位比較的ELISA分析結果。圖中16IgG,78IgG,3∶1Mix,SigG和EHF-IgG分別代表ChHAIgG16,ChHAIgG78抗體,ChHAIgG16和ChHAIgG78以3∶1重量混合抗體,標準丙種球蛋白和無關的抗?jié)h坦病毒人源抗體。與標準丙種球蛋白相比,特異性抗甲肝病毒抗體高于丙種球蛋白近4倍,其親和常數可達1.6×10-11M。1mg重組人源抗甲肝病毒基因工程抗體相當于320國際單位。而ChHAIgG16和ChHAIgG78混合抗體并未達到提高抗體親和力的效果。
實例7,CHO細胞生產的人源抗甲肝病毒基因工程抗體中和功能測定極其國際標準單位比較將實例4中純化的ChHAIgG16和ChHAIgG78抗體濃度調整到1mg/ml,以1∶25起始(每孔4ug),1∶2倍比稀釋,將不同稀釋度的樣品與100TCID的甲肝病毒37C孵育2小時,然后感染甲肝病毒敏感細胞T4細胞。21天后ELISA檢測各樣品管中甲肝病毒含量。檢測的樣本為甲肝病毒感染21天后的細胞裂解上清。圖6是人源抗甲肝病毒基因工程抗體的體外中和效力檢測。中和試驗結果表明,這株抗體不僅有很高的親和力,而且同樣據有較強的中和能力。當體外中和100TCID50甲肝病毒感染達80%以上時僅需1ug左右,而50%中和時,僅需0.05ug抗體。而ChHAIgG16和ChHAIgG78混合抗體在中和試驗中具有協(xié)同增強作用。同樣條件純化的抗?jié)h坦病毒基因工程抗體則不能中和甲肝病毒感染。
實例8.CHO細胞生產的人源抗甲肝病毒基因工程抗體競爭抑制實驗用純化的甲肝病毒包被ELISA板。將實例4中純化的ChHAIgG16和ChHAIgG78抗體濃度調整到1mg/ml,以每孔ug起始,1∶2倍比稀釋,將不同稀釋度的樣品加入孔中,37℃反應后,加1∶1000稀釋的HRP標記鼠抗甲肝病毒中和抗體,顯色后檢測O.D值。圖7為ChHAIgG16和ChHAIgG78與HRP標記鼠抗甲肝病毒中和抗體的競爭ELISA分析。其中,ChHAIgG16抗體在0.1ug情況下可完全與HRP標記鼠抗甲肝病毒中和抗體競爭,而ChHAIgG78抗體則不能很好地HRP標記鼠抗甲肝病毒中和抗體競爭,表明ChHAIgG16抗體和HAIgG78抗體針對不同的甲肝病毒抗原決定族。
實例9.CHO細胞生產的人源抗甲肝病毒基因工程抗體在恒河猴體內的保護性實驗實驗用恒河猴4只,由廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生防疫站提供,3雌1雄,重為1.95-4Kg,實驗隨機分為2組,每組2只,每只猴子實驗前采血,檢測抗HAV總抗體,為陰性,ALT正常,并排除被其它肝炎病毒感染的可能。一組猴子(猴204,猴205)在用甲肝病毒野毒株攻擊前,先靜脈接種人源抗甲肝病毒基因工程抗體ChHAIgG16和ChHAIgG78 3∶1混合抗體制劑,2mg/只;一組猴子(猴206,猴207)不接種抗體,只注射生理鹽水。30小時后,用甲肝病毒野毒株攻擊這兩組猴子,10%的糞便懸液(其中含有抗菌素)3ml/只猴子,ELISA檢測甲肝抗原P/N值在3左右,靜脈注射。每周采血檢測ALT(血清丙氨酸轉氨酶),采取常規(guī)方法檢測每天收集的大便。血清中抗HAV總抗體采用競爭法ELISA檢測,按甲肝抗體檢測試劑盒說明書進行(萬泰生物技術公司,中國)。糞便中甲肝病毒RNA檢測采用抗體捕獲PCR方法進行,方法如下所用負鏈引物為結合于VP1的核苷酸2389-2414,5’-GGAAATGTCTCAGGTACTTTCTTTG-3’,正鏈引物為結合于VP3的羧基端核苷酸2167-2193,5’-GTTTTGCTCCTCTTTATCATGCTATG-3’??贵w捕捉病毒在0.5ml離心管中進行。循環(huán)參數為94℃變性30秒,55℃退火復性30秒,72℃延伸30秒,35個循環(huán),最后一個周期結束時引物延伸時間增加5分鐘。結果如圖8所示,是免疫組和對照組恒河猴HAV抗體及ALT的動態(tài)變化。實驗組(圖8A為猴204數據,圖8B為猴205數據)與對照組(圖8C為猴206數據,圖8D為猴207數據)在重組抗體免疫及甲肝病毒野毒株攻擊前后ALT及抗HAV總抗體的動態(tài)變化在甲肝病毒野毒株攻擊后觀察了三個月,對照組在野毒株攻擊后約5-6周,ALT明顯升高,持續(xù)約2個星期,而對照組ALT無明顯變化,均保持正常水平。對照組抗HAV總抗體在5-6周前后開始明顯呈現(xiàn)陽性,并一直持續(xù)到觀察結束,說明HAV野毒株在對照組恒河猴體內進行了復制并引起感染和發(fā)病。而實驗組恒河猴在接受人源重組抗HAV抗體后,其外源抗HAV抗體一直持續(xù)陽性達6周左右,其中一只在8周時仍能檢出陽性,但在9周后抗體變?yōu)殛幮?,另一只?周后變?yōu)殛幮?。但直到觀察結束(14周),實驗組猴子ALT仍為正常。說明外源重組抗體在恒河猴體內可有效地保護恒河猴不受甲肝病毒感染,更不發(fā)病。
權利要求
1.人源抗甲肝病毒基因工程抗體,其特征在于1)為來源于噬菌體人源抗體庫篩選的與人源IgGFc基因重組后在CHO穩(wěn)定表達細胞的全人源IgG1λ全抗體,它由兩條重鏈和兩條λ-κ嵌合輕鏈組成,分子量為150kD左右,命名ChHAIgG16;2)為來源于噬菌體人源抗體庫篩選的與人源IgGFc基因重組后在CHO穩(wěn)定表達細胞的全人源IgG1κ全抗體,它由兩條重鏈和兩條κ輕鏈組成,分子量為150kD左右,命名ChHAIgG78;3)人源抗甲肝病毒基因工程抗體ChHAIgG16或ChHAIgG78,其可變區(qū)基因組成特征為特異性的輕鏈和重鏈基因,來源于對人源抗甲肝病毒抗體基因庫的特異性富積篩選表達,其相應的三個CDR區(qū)序列為本抗體特有的全新序列,其中ChHAIgG16輕鏈和重鏈可變區(qū)基因序列已在專利公開號為CN1316437A專利申請中陳述;ChHAIgG78輕鏈可變區(qū)CDR1,CDR2和CDR3序列為分別“RASQSVSSSYLA”,“GASSRAT”和“QQYGSSPLT”;HAV78IgG重鏈可變區(qū)CDR1,CDR2和CDR3序列為分別“SHEMN”,“YIGSRGSDTSYADSVKGR”和“ERYRYFEDYYHGLDV”;其基因特征決定了其對甲肝病毒的親和力和中和保護功能;4)人源抗甲肝病毒基因工程抗體ChUAIgG16或ChHAIgG78,其輕重鏈先導序列和恒定區(qū)基因來源于哺乳類細胞人源抗體高效表達載體VH-dhfr1和VK-dhfr1,該載體已在專利公開號為CN1363682專利申請中陳述;5)是通過哺乳類細胞表達載體系統(tǒng),在CHO工程細胞系中生產的特異性結合和識別甲肝病毒外殼蛋白的高親和力中和性人源完全抗體,具有與天然抗體分子類似的全抗體分子結構特征;其結合甲肝病毒外殼蛋白和中和病毒感染的功能由存在于抗體基因輕鏈和重鏈可變區(qū)的決定族互補區(qū)域CDR1、CDR2和CDR3中特異性核苷酸序列決定,其相應的氨基酸序列構成了抗體的特異性抗原結合區(qū)域。
2.根據權利要求
1,用于生產人源抗甲肝病毒基因工程抗體的CHO工程細胞系的特征在于1)為穩(wěn)定高效表達人源抗甲肝病毒中和性基因工程抗體ChHAIgG16的CHO工程細胞系;2)為穩(wěn)定高效表達人源抗甲肝病毒中和性基因工程抗體ChHAIgG78的CHO工程細胞系;3)可被放大規(guī)模生產,其生產的抗體為分泌型抗體,可從培養(yǎng)上清中獲得;4)經無血清細胞培養(yǎng)后,可通過親和層析過程從其培養(yǎng)上清中經純化而獲得抗體蛋白。
3.人源抗甲肝病毒基因工程抗體制劑HAMaxTMM,其特征在于為包含ChHAIgG16和ChHAIgG78兩種抗體中的一種抗體單一的或兩種混合的靜脈注射用、肌肉注射用、口服或外用的抗體制劑;其對甲肝病毒抗原具有很高的親和力,并具有在體外完全中和甲肝病毒和體內完全保護猴子抵御甲肝病毒攻擊。
4.CHO細胞生產的人源抗甲肝病毒基因工程抗體極其抗體制劑HAMaxTMM的用途,其特征在于1)可用于預防或治療由甲肝病毒引起的甲型肝炎藥物的制備;2)可用于診斷甲肝病毒感染的試劑的制備;3)可用于預防和治療由甲肝病毒感染引起的甲型肝炎的靜脈注射用、肌肉注射用、口服或外用的生物制劑的制備。
專利摘要
CHO細胞生產的人源抗甲肝病毒基因工程抗體包括兩株人源抗甲肝病毒中和性基因工程抗體CHO(中國倉鼠卵巢細胞)生產細胞系極其生產的預防和治療用人源抗甲肝病毒中和性基因工程抗體制劑。其產品特征為來源于噬菌體人源抗體庫篩選的與人源IgGFc基因重組后在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞穩(wěn)定表達細胞的全人源抗體IgG1λ和IgG1κ,分別命名ChHAIgG16和ChHAIgG78。分子量為150kd左右。由ChHAIgG16和ChHAIgG78以3∶1混合的雞尾酒式抗體制劑,命名HAMax
文檔編號C12N5/10GKCN1605628SQ200410070620
公開日2005年4月13日 申請日期2004年7月23日
發(fā)明者梁米芳, 曹經媛, 李川, 李德新 申請人:中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan
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