專利名稱:一種分析城市污水廠污泥微生物群落構(gòu)成的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種使用聚合酶鏈反應(yīng)-變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)技術(shù)對(duì)城市污水廠污泥中微生物群落構(gòu)成的分析方法，屬于微生物生態(tài)學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
城市污水廠污泥是由多種微生物形成的菌膠團(tuán)與吸附其上的有機(jī)物和無機(jī)物組成的集合體，含有大量的細(xì)菌、病毒、原生動(dòng)物、寄生蟲卵及其他的微生物，微生物多樣性豐富，微生物群落構(gòu)成復(fù)雜。分析城市污水廠污泥中微生物群落構(gòu)成具有十分重大的學(xué)術(shù)價(jià)值和實(shí)際應(yīng)用前景既可通過分析獲得污泥中微生物種群結(jié)構(gòu)的時(shí)空動(dòng)態(tài)變化，判斷和預(yù)測(cè)污泥生態(tài)系統(tǒng)的功能變化趨勢(shì)；又可根據(jù)污泥生態(tài)系統(tǒng)中微生物群落構(gòu)成和特定種群的動(dòng)態(tài)變化，監(jiān)測(cè)和調(diào)控污泥處理處置工藝的運(yùn)行情況，從而對(duì)工藝運(yùn)行和控制起正確的指導(dǎo)作用。
過去對(duì)污泥中微生物的研究多采用傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法，采用分類和鑒定，主要是根據(jù)微生物的個(gè)體形態(tài)、培養(yǎng)特征和生理生化等特征，運(yùn)用平板計(jì)數(shù)法、鏡檢法等進(jìn)行環(huán)境生物學(xué)的研究。但是這種傳統(tǒng)方法存在很多不足不能反映成分復(fù)雜的城市污水廠污泥樣品中微生物的真實(shí)情況；難以獲得微生物群落結(jié)構(gòu)和空間分布的有關(guān)信息等；且純培養(yǎng)方法和原理大多從醫(yī)藥微生物學(xué)引進(jìn)，對(duì)成分復(fù)雜的城市污水廠污泥樣并不很適合(譬如在自然生態(tài)環(huán)境下許多微生物處于貧營(yíng)養(yǎng)，而在實(shí)驗(yàn)室用營(yíng)養(yǎng)豐富的牛肉汁蛋白胨來測(cè)定樣品中活細(xì)菌的總數(shù)，大量的貧營(yíng)養(yǎng)微生物不適宜生長(zhǎng)，造成測(cè)定結(jié)果誤差大)；一般實(shí)驗(yàn)室在分離培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)通常只是在28℃下培養(yǎng)，而污泥中除了存在中、高溫型細(xì)菌，還有低溫型細(xì)菌，此時(shí)低溫型細(xì)菌則被忽視了。
近幾年，對(duì)廢水和土壤中的微生物種群動(dòng)態(tài)分析采用了逐步發(fā)展起來的現(xiàn)代分子生物技術(shù)，尤其是基于16S r DNA基因序列多態(tài)性分析技術(shù)，因?yàn)樵摷夹g(shù)可有效避免傳統(tǒng)培養(yǎng)、分離中的篩選和富集作用所造成的微生物多樣性丟失，群構(gòu)成變化等問題，并能更為直接可靠地反映樣品中微生物多樣性及種群分布情況，且現(xiàn)代分子生物技術(shù)較傳統(tǒng)培養(yǎng)、分離和鑒定也更為簡(jiǎn)易、快速和準(zhǔn)確。這些方法包括限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性(RAPD)、擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)、核酸雜交技術(shù)、熒光原位雜交(FISH)和變性梯度凝膠電泳(DGGE)等。其中變性梯度凝膠電泳(DGGE)因穩(wěn)定性和重復(fù)性好，靈敏度高，能提供群落中優(yōu)勢(shì)種群信息和可同時(shí)分析多個(gè)樣品等優(yōu)點(diǎn)而被實(shí)際應(yīng)用于對(duì)廢水和土壤中的微生物種群動(dòng)態(tài)分析。
中科院生態(tài)環(huán)境研究中心運(yùn)用PCR-DGGE技術(shù)對(duì)農(nóng)田土壤微生物群落研究進(jìn)行引物設(shè)計(jì)并申請(qǐng)了中國(guó)專利“一種PCR-DGGE研究環(huán)境微生物群落的引物設(shè)計(jì)方案”(公開號(hào)CN1456684A)。
然而城市污水廠污泥和農(nóng)田土壤的化學(xué)、物理性質(zhì)高度異質(zhì)，微生物數(shù)量和種群分布也明顯不同，這就決定了兩種環(huán)境樣品在進(jìn)行微生物群落構(gòu)成分析時(shí)存在差異。目前國(guó)內(nèi)外尚無關(guān)于運(yùn)用PCR-DGGE技術(shù)進(jìn)行城市污水廠污泥微生物群落構(gòu)成研究的相關(guān)報(bào)道。因?yàn)槌鞘形鬯畯S污泥成分復(fù)雜、微生物多樣性豐富。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是公開一種分析城市污水廠污泥微生物群落構(gòu)成的方法。本發(fā)明進(jìn)一步的目的是將PCR-DGGE技術(shù)應(yīng)用于分析成分復(fù)雜的城市污水廠污泥微生物群落構(gòu)成。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明根據(jù)城市污水廠污泥特性，結(jié)合土壤樣品微生物多樣性研究方法，摸索出一種適用于城市污水廠污泥中微生物種群構(gòu)成的分析方法?？梢圆唤?jīng)過純培養(yǎng)直接提取城市污水廠污泥樣品中微生物的總基因組DNA，因?yàn)镈NA分子的種類及各分子的相對(duì)比例反映了污泥樣品中微生物種群的種類數(shù)量和種群間的相對(duì)比例，在得到的DGGE圖譜中，每一條帶可以是來自若干種不同微生物的基因組DNA片斷組成，條帶的數(shù)目反映該種群微生物種群數(shù)量的高低，這樣，城市污水廠污泥微生物群落的結(jié)構(gòu)信息，就被間接地記錄于DGGE圖譜上。因此，分析DGGE圖譜就可分析污泥微生物的群落構(gòu)成。具體步驟包括第一步DNA提取、第二步PCR擴(kuò)增先在提取的DNA模板中加入引物、Taq酶、緩沖液和dNTP，然后控制起始94℃預(yù)變性5min；94℃變性45s，60℃引物復(fù)性45s，72℃引物延伸90s，30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸20min。產(chǎn)物用1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)物，電泳緩沖液為0.5×TBE緩沖液。第三步PCR產(chǎn)物濃縮合并數(shù)管PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物，用Parafilm膜封口，置于-70℃冰箱冷凍過夜保存，取出后用冷凍抽干機(jī)濃縮處理4小時(shí)，將得到的干粉溶解于30μl pH為7.6的TE緩沖液中。第四步DGGE電泳分離得DGGE圖譜，其特點(diǎn)是第一步是分兩次直接提取污泥的總DNA，首先稱取2～5g污泥樣品，用13.5-27ml的DNA提取液、40-60μL20mg/mL溶菌酶和1.5mL 20％活性劑SDS，65℃度水浴2小時(shí)，每隔15-20分鐘輕搖幾下，離心收集上清液置于離心管中，沉淀中再加入4.5mL DNA提取液和0.5mL 20％的SDS，離心收集上清液合并于上次上清液。在上清液中加入等體積的氯仿∶異戊醇＝24∶1(體積比)混合液，離心10min，取上層水層于另一離心管中。在上層水層中重復(fù)上步操作加入氯仿-異戊醇混合液后離心，合并水層，用占水層0.6倍體積的異丙醇，室溫放置1h，9000r/min離心20min，收集沉淀溶解于500μL pH為7.6的TE緩沖液中。
第四步，DGGE電泳分離首先制備聚丙烯酰胺變性梯度凝膠，使其變性梯度為30％～60％。然后使用電泳緩沖液為1×TAE，電壓150V，60℃，電泳4～8h，溴乙錠染色20～40min。得DGGE圖譜，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下1.由于本發(fā)明直接提取城市污水廠污泥樣品中的總DNA，避免了在傳統(tǒng)培養(yǎng)過程中的篩選和富集作用，能更直接真實(shí)地反應(yīng)污泥樣品中的微生物多樣性及種群分布情況，較傳統(tǒng)培養(yǎng)、分離和鑒定也更為簡(jiǎn)易、準(zhǔn)確。
2.由于本發(fā)明所采用的在DNA提取中重復(fù)氯仿-異戊醇抽提步驟，以進(jìn)一步純化DNA，減少污泥中的腐殖酸質(zhì)、有機(jī)分子等雜質(zhì)對(duì)核酸提取和PCR反應(yīng)過程的抑制作用。因此首次將PCR-DGGE應(yīng)用于成分復(fù)雜的污泥樣品微生物種群動(dòng)態(tài)的分析。與傳統(tǒng)方法的一個(gè)多星期才出結(jié)果比較，節(jié)省了大量的時(shí)間(只需兩天即可完成)和財(cái)力，且避免了傳統(tǒng)方法菌種培養(yǎng)和篩選時(shí)微生物信息的缺失。
3.由于本發(fā)明減少了樣品的取樣量，僅為傳統(tǒng)取樣量的1/5，使含水率低，樣品松散的城市污水廠污泥能與加入樣品中的緩沖溶液不形成粘度很大的泥，使之后加入的溶菌酶和活性劑SDS混合均勻，導(dǎo)致本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單易行。
4.本發(fā)明無需昂貴的操作試劑盒，成本低，用本發(fā)明的方法可同時(shí)分析多個(gè)城市污水廠污泥微生物種群結(jié)構(gòu)，獲得其空間動(dòng)態(tài)變化，以及為城市污水廠污泥處理工藝的運(yùn)行改良提供很好的指導(dǎo)和評(píng)價(jià)作用。
5.本發(fā)明應(yīng)用范圍廣，適于城市污水廠污泥及經(jīng)各種處理處置工藝后污泥，可針對(duì)污泥處理工藝不同運(yùn)行階段的污泥樣品進(jìn)行DGGE分析，從而為工藝運(yùn)行穩(wěn)定性提供指導(dǎo)和評(píng)價(jià)。同時(shí)可針對(duì)不同種群菌種進(jìn)行分析，確定優(yōu)勢(shì)菌種并進(jìn)而研究菌種功能性，為科研和工藝改良提供新的思路和依據(jù)。



圖1為本發(fā)明的工藝流程示意圖圖2-A為城市污水廠經(jīng)脫水污泥DNA提取瓊脂糖凝膠電泳圖圖2-B為PCR擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳圖圖2-C為DGGE聚丙烯酰胺凝膠電泳圖圖3-A為堆肥工藝5種污泥DNA提取瓊脂糖凝膠電泳圖圖3-B為5種污泥PCR擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳圖圖3-C為5種污泥DGGE聚丙烯酰胺凝膠電泳圖具體實(shí)施方式
首先請(qǐng)參閱附圖1，本發(fā)明第一步DNA提取是分兩次進(jìn)行的，首先在污泥樣品中加入DNA提取液、溶菌酶和玻璃珠搖動(dòng)后加入活性劑SDS反應(yīng)，離心得上清液忽然沉淀。然后在沉淀中再加入DNA提取液等震蕩離心收集上清液，合并于上次上清液。接著在上清液中加入氯仿-異戊醇混合液，離心取水層，得到水層含DNA溶液。再在水層含DNA溶液中重復(fù)上步操作加入氯仿-異戊醇混合液后離心，得純化后含DNA溶液，加入異丙醇放置1h，離心，收集沉淀溶解于TE緩沖液中獲得污泥樣品提取的總DNA。然后進(jìn)入第二步PCR擴(kuò)增、第三步PCR產(chǎn)物濃縮、第四步DGGE電泳分離得DGGE圖譜。
實(shí)施例1對(duì)上海市某城市污水廠的脫水污泥進(jìn)行采樣分析，污泥的基本性質(zhì)為含水率80％，水溶性總氮3.0g/kgDM，總有機(jī)質(zhì)550g/kgDM，總油30g/kg干固體，優(yōu)先控制污染物未檢出，大腸菌群值≥24,000MPN/100gDM。對(duì)脫水污泥的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行如下分析第一步DNA的重復(fù)提取稱取2g污泥樣品于三角瓶，加入13.5mL DNA提取液(100mmol/L Tris-HCl，100mmol/L EDTA，100mmol/L K2HPO4，100mmol/LKH2PO4，1.5mol/L NaCl，1％CTAB，pH8.0)，再加入40μL溶菌酶(20mg/mL)和2-5顆滅菌玻璃珠，于37℃，225r/min搖床上搖動(dòng)20min，接著加入1.5mL濃度為20％活性劑SDS，65℃水浴2h，每隔15min輕輕搖動(dòng)幾下，將上述提取樣在室溫下5000r/min離心10min，收集上清液，轉(zhuǎn)移到50mL離心管中。沉淀中再加入4.5mL DNA提取液和0.5mL 20％的SDS，振蕩10s后65℃水浴10min，5000r/min離心10min，收集上清液，與上次上清液合并，與等體積的混合液(24體積氯仿和1體積異戊醇混合制成)，5000r/min離心10min，取上層水層于另一50mL離心管中。在水層中重復(fù)上步操作，合并水層，用0.6倍體積的異丙醇室溫放置1h，9000r/min離心20min，收集沉淀溶解于500μL pH為7.6的TE緩沖液中。獲得圖2-A脫水污泥DNA提取瓊脂糖凝膠電泳圖。
第二步，PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測(cè)對(duì)提取的污泥DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所用的引物P1的序列為5’-CGCCCGCCGCGCGGCGGGCGGGGGGGGCCCACGGGGGGCCTACGGGAGGAGCAG-3’，引物P2的序列為5’-ATTACCGCGGATGCTGG-3’，由上海博亞生物工程技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為39μL ddH2O，5μL 10*反應(yīng)緩沖液，1μL PCR引物P1，1μL PCR引物P2，1μL dNTP，1μL Taq酶，2μL模板。PCR擴(kuò)增程序?yàn)槠鹗?4℃預(yù)變性5min；94℃變性45s，60℃引物復(fù)性45s，72℃引物延伸90s，30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸20min。得到污泥PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)物，電泳緩沖液為0.5×TBE緩沖液。見圖2-B PCR擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳圖。
第三步，PCR產(chǎn)物濃縮合并數(shù)管PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物，用Parafilm膜封口置于-70℃冰箱冷凍過夜保存，取出后用冷凍抽干機(jī)濃縮處理4～6小時(shí)，將得到的干粉溶解于30μl pH為7.6的TE緩沖液中，保存于-30℃冰箱備用。
第四步，DGGE電泳分離為了滿足城市污水廠污泥特有的復(fù)雜微生物種類，制備聚丙烯酰胺變性梯度凝膠的變性梯度提高為30％～60％。使用的電泳緩沖液為1×TAE，電壓150V，60℃，電泳5h，溴乙錠染色20min。得DGGE圖譜，見圖2-C DGGE聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。通過該圖可分析比較污泥微生物種群多樣性程度。
實(shí)施例2用本發(fā)明的方法可同時(shí)分析多個(gè)城市污水廠污泥微生物種群結(jié)構(gòu)，獲得其空間動(dòng)態(tài)變化，為城市污水廠污泥處理工藝的運(yùn)行改良提供很好的指導(dǎo)和評(píng)價(jià)作用?，F(xiàn)對(duì)經(jīng)某快速高效堆肥工藝處理的各處理階段污泥采樣分析，污泥的基本性質(zhì)如表1所示表1.堆肥工藝各處理階段污泥的基本性質(zhì)編號(hào) 取樣特點(diǎn) 含水率％ VS％1 上一批回流物料 37 37.82 脫水污泥(原泥) 81 10.5與調(diào)理劑混合后3 58 23.7物料，處理第1天高溫期物料，處4 42 40.9理第8天出料，處理第165 36 43.8天下面按本發(fā)明步驟對(duì)各污泥樣品進(jìn)行DNA提取、PCR擴(kuò)增和DGGE分離。
第一步DNA提取各稱取5g污泥樣品于三角瓶，加入27mL DNA提取液(100mmol/L Tris-HCl，100mmol/L EDTA，100mmol/L K2HPO4，100mmol/LKH2PO4，1.5mol/LNaCl，1％CTAB，pH8.0)，再加入60μL溶菌酶(20mg/mL)和5-9顆滅菌玻璃珠，于37℃，225r/min搖床上搖動(dòng)20min，接著加入1.5mL20％SDS，65℃水浴2h，每隔20min輕輕搖動(dòng)幾下，將上述提取樣經(jīng)室溫5000r/min離心10min，收集上清液，轉(zhuǎn)移到50mL離心管中。沉淀中再加入4.5mL DNA提取液和0.5mL 20％的SDS，振蕩10s后65℃水浴10min，5000r/min離心10min。收集上清液合并于上次上清，與等體積氯仿-異戊醇混合，5000r/min離心10min，取上層水層于另一50mL離心管中。在水層中重復(fù)上步操作，合并水層，用0.6倍體積的異丙醇室溫放置1h，9000r/min離心20min，收集沉淀溶解于500μL pH為7.6的TE緩沖液中，測(cè)得附圖3-A的5種污泥的DNA提取瓊脂糖凝膠電泳圖。
第二步PCR擴(kuò)增對(duì)提取DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增所用引物以及PCR反應(yīng)體系與實(shí)施例1相同。PCR擴(kuò)增程序與實(shí)施例1也相同起始94℃預(yù)變性5min；94℃變性45s，60℃引物復(fù)性45s，72℃引物延伸90s，30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸20min。用1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，電泳緩沖液為0.5×TBE緩沖液。測(cè)得附圖3-B的PCR擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳圖。
第三步PCR產(chǎn)物濃縮步驟與實(shí)施例1相同。
第四步DGGE電泳分離制備聚丙烯酰胺變性梯度凝膠，使其變性梯度為30％～60％。使用的電泳緩沖液為1×TAE，電壓150V，60℃，電泳5h，溴乙錠染色40min，得附圖3-C的DGGE聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。DGGE圖譜5種污泥樣品的PCR產(chǎn)物在DGGE種被分離成條帶清晰、數(shù)目不等的電泳條帶，這說明堆肥工藝不同階段污泥之間存在明顯的微生物種群分布差異。同時(shí)由DGGE圖譜可看出上一批的回流物料和出料的圖譜極為相似，說明該堆肥工藝具有良好的重現(xiàn)性，已基本實(shí)現(xiàn)工藝的穩(wěn)定運(yùn)行。
可見本發(fā)明所采用的提取方法、PCR反應(yīng)體系的設(shè)定及其DGGE的操作對(duì)于成分復(fù)雜的污泥樣品中微生物種群動(dòng)態(tài)的分析是可行的，DGGE分離結(jié)果對(duì)該堆肥工藝的運(yùn)行能提供很好的指導(dǎo)和評(píng)價(jià)意義。
權(quán)利要求
1.一種分析城市污水廠污泥微生物群落構(gòu)成的方法，包括第一步DNA提?。坏诙絇CR擴(kuò)增在提取的DNA中加入引物和反應(yīng)體系，PCR擴(kuò)增程序?yàn)槠鹗?4℃預(yù)變性5min；94℃變性45s，60℃引物復(fù)性45s，72℃引物延伸90s，30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸20min，產(chǎn)物用1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)物，電泳緩沖液為0.5×TBE緩沖液；第三步PCR產(chǎn)物濃縮合并數(shù)管PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物，用Parafilm膜封口，置于-70℃冰箱冷凍過夜保存，取出后用冷凍抽干機(jī)濃縮處理4小時(shí)，將得到的干粉溶解于30μl pH為7.6的TE緩沖液中；第四步DGGE電泳分離得DGGE圖譜，其特征在于第一步DNA提取是分兩次直接提取污泥的總DNA的，首先稱取2～5g污泥樣品，用13.5-27ml的DNA提取液、40-60μL20mg/mL溶菌酶和1.5mL20％SDS，65℃度水浴2小時(shí)，每隔15-20分鐘輕搖幾下，離心收集上清液置于離心管中，沉淀中再加入4.5mL DNA提取液和0.5mL 20％的SDS，離心收集上清液合并于上次上清，在上清液中加入等體積的由氯仿和異戊醇按24∶1體積比組成的混合液，離心10min，取上層水層于另一離心管中；在沉淀中重復(fù)上步操作加入氯仿異戊醇混合液后離心，合并水層，加入0.6倍體積的異丙醇，室溫放置1h，9000r/min離心20min，收集沉淀溶解于500μL pH為7.6的TE緩沖液中；第四步，DGGE電泳分離首先制備變性梯度為30％～60％的聚丙烯酰胺凝膠，然后使用電泳緩沖液為1×TAE，電壓150V，60℃，電泳4～8h，溴乙錠染色20～40min，得DGGE圖譜。
專利摘要
一種分析城市污水廠污泥微生物群落構(gòu)成的方法，涉及PCR－DGGE技術(shù)對(duì)城市污水廠污泥微生物群落構(gòu)成的分析方法。包括第一步DNA提取；第二步PCR擴(kuò)增；第三步PCR產(chǎn)物濃縮；第四步DGGE電泳分離得DGGE圖譜。其特點(diǎn)是第一步DNA提取分兩次直接得到總DNA。先取2～5g污泥樣品，用DNA提取液等對(duì)污泥進(jìn)行DNA提取后，沉淀中再加入DNA提取液等離心收集上清液，合并上次上清，再在上清液中加入由氯仿和異戊醇組成的混合液，離心，取上層水層，重復(fù)上步操作離心，合并水層，完成DNA提取。第四步，DGGE使用變性梯度為30％～60％的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后得反映城市污水廠污泥微生物群落構(gòu)成的DGGE圖譜。本發(fā)明省時(shí)省力、簡(jiǎn)捷準(zhǔn)確、成本低?？蓮V泛應(yīng)用于各類城市污水廠污泥微生物群落構(gòu)成的分析。
文檔編號(hào)C12Q1/68GKCN1584051SQ200410018580
公開日2005年2月23日 申請(qǐng)日期2004年5月24日
發(fā)明者趙建夫, 陳玲, 李竺, 王峰, 方萍, 傅以鋼 申請(qǐng)人:同濟(jì)大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan