專利名稱:攜帶人原癌基因的哺乳動物癌細胞和轉(zhuǎn)基因哺乳動物以及利用上述原癌基因的癌癥診斷 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種由包含具有SEQ ID NO1的核苷酸序列的人原癌基因的表達載體所轉(zhuǎn)染的哺乳動物細胞；一種帶有包含人的原癌基因的核苷酸構(gòu)建體的哺乳動物胚胎；一種從哺乳動物胚胎中衍生的轉(zhuǎn)癌基因哺乳動物；和一種使用所述原癌基因診斷乳腺癌、腎臟癌、卵巢癌和胃癌的試劑盒。
背景技術(shù)：
包括人在內(nèi)的每一個高等動物，都帶有大約100,000個基因，但只有約15％的這部分基因能夠表達，個體的生命演化特征，如發(fā)生、分化、穩(wěn)態(tài)、對刺激的反應(yīng)、細胞周期的調(diào)控、衰老與編程性細胞死亡(細胞程序性死亡)都取決于哪些基因在表達(Liang，P.和A.B.Pardee，Science，257967-971(1992))。
致病的現(xiàn)象如腫瘤發(fā)生是由于基因突變使基因表達的方式發(fā)生了變化而導(dǎo)致的。
有報道說腫瘤的發(fā)生是由于各種各樣的遺傳變化，如染色體雜合性缺失、癌基因的激活以及抑癌基因的失活等等而導(dǎo)致的(Bishop，J.M.，Cell，64，235-248(1991)；和Hunter，T.，Cell，64，249-270(1991))。而且，還有報道說，有10％-30％的人類癌癥是由于原癌基因的擴增使癌基因激活而引起的。
因此，原癌基因的激活在許多腫瘤的病因?qū)W中是起主要作用的，所以存在鑒定原癌基因的需要。
本發(fā)明人曾報道過子宮頸癌1(HCCR-1)的原癌基因在癌細胞內(nèi)的特異地過表達(韓國專利公開號No.2001-39566)。為了揭示腫瘤發(fā)生過程中的機理，本發(fā)明的發(fā)明者努力去建立一種癌細胞系和一種利用HCCR-1原癌基因使其發(fā)生癌癥的轉(zhuǎn)基因哺乳動物。
發(fā)明概述依上所述，本發(fā)明的一個目的是提供了一種含有誘導(dǎo)的HCCR-1原癌基因的哺乳動物細胞。
本發(fā)明的另外一個目的是提供了一種帶有HCCR-1原癌基因的哺乳動物胚胎和一種衍生于此哺乳動物胚胎的轉(zhuǎn)基因哺乳動物。
本發(fā)明的另外一個目的是提供一個利用HCCR-1原癌基因來診斷乳腺癌、腎臟癌、卵巢癌和胃癌的試劑盒。
按照本發(fā)明的一個方面，提供了一種被一種表達載體轉(zhuǎn)化的哺乳動物細胞，所述的表達載體包含帶有SEQ ID NO1核苷酸序列的人的HCCR-1原癌基因。



本發(fā)明的上述目的和特點在結(jié)合附圖的下述優(yōu)選實施方案中將會得到清楚的體現(xiàn)。
圖1A和圖1B分別是單層培養(yǎng)的HCCR-1M細胞和親代野生型NIH/3T3細胞的相差特征；圖2是HCCR-1M的單層培養(yǎng)細胞的蘇木精-伊紅染色結(jié)果；圖3是HCCR-1M細胞的透射電子顯微鏡圖片；圖4是同種異體移植HCCR-1M細胞的裸鼠照片，其顯示出明顯的節(jié)狀瘤；圖5是取自同種異體移植HCCR-1M細胞的裸鼠的明顯節(jié)狀瘤的蘇木精-伊紅染色結(jié)果；圖6是取自同種異體移植HCCR-1M細胞的裸鼠的明顯節(jié)狀瘤的透射電子顯微鏡圖片；圖7A至7D是免疫組織化學法的分析結(jié)果，其分別顯示了在取自接種HCCR-1M細胞的裸鼠的明顯節(jié)狀瘤中的網(wǎng)硬蛋白纖維、角蛋白、上皮膜抗原和波形蛋白的表達；
圖8是單層培養(yǎng)細胞的HCCR-1MN的相差特征；圖9是HCCR-1M細胞和HCCR-1MN細胞中HCCR-1原癌基因表達的蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果；圖10A和圖10B是HCCR-1H的單層培養(yǎng)細胞和親代野生型293細胞各自的相差特征；圖11是取自同種異體移植HCCR-1H細胞的裸鼠的明顯節(jié)狀瘤的蘇木精-伊紅染色結(jié)果；圖12A至12C是免疫組織化學法的分析結(jié)果，其分別顯示來在取自接種HCCR-1H細胞的裸鼠的明顯節(jié)狀瘤中的細胞角蛋白8、細胞角蛋白19和波形蛋白的表達結(jié)果；圖13是HCCR-1H細胞中HCCR-1原癌基因表達的RNA印跡分析結(jié)果；圖14是一張圖，其顯示了在陽性對照293細胞、陰性對照細胞、親代野生型NIH/3T3細胞、轉(zhuǎn)染了pcDNA3載體的比較NIH/3T3細胞、和HCCR-1M細胞中的端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性；圖16A至16C分別是HCCR-1M細胞中egr-1基因，c-fos基因和甘油醛-2-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因表達的RNA印跡分析結(jié)果；圖17A是HCCR-1H細胞中p53腫瘤抑制基因表達的蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果；圖17B是β-肌動蛋白的蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果；圖18所示為HCCR-1H細胞中p53腫瘤抑制基因表達的免疫沉淀分析結(jié)果；圖19A、19C、19E、19G和19I分別是HCCR-1H細胞中MDM2，Bax，p21WAF1，p16INK4A和p14ARF基因表達的蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果；圖19B、19D、19F、19H和19J是β-肌動蛋白的蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果；圖20A是蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果，其顯示了沉淀中的GST蛋白，所屬沉淀是通過免疫沉淀CHO細胞中的FLAG蛋白來制備的，所述的CHO細胞被表達FLAG和HCCR-1的融合蛋白的載體、以及表達GST和D52的融合蛋白的載體所共沉淀；圖20B是利用免疫沉淀GST蛋白制備的沉淀中的PLAG蛋白；圖21是含有HCCR-1原癌基因的核苷酸構(gòu)建體的示意圖；
圖22是衍生于具有誘導(dǎo)的HCCR-1原癌基因的胚胎的轉(zhuǎn)基因患癌小鼠；圖23是一張從攜帶誘導(dǎo)的HCCR-1原癌基因的胚胎中衍生的轉(zhuǎn)基因患癌小鼠的乳房腫瘤照片；圖24是從攜帶誘導(dǎo)的HCCR-1原癌基因的胚胎中衍生的轉(zhuǎn)基因患癌小鼠的乳房腫瘤的蘇木精-伊紅染色結(jié)果；圖25是從攜帶誘導(dǎo)的HCCR-1原癌基因的胚胎中衍生的轉(zhuǎn)基因患癌小鼠的乳房腫瘤的透射電子顯微鏡圖片；圖26A是乳房、腎臟、卵巢和胃的腫瘤組織中HCCR-1原癌基因表達的RNA印跡分析結(jié)果；圖26B是使用β-肌動蛋白探針雜交的相同印跡。
圖27是人的乳房、腎臟、卵巢和胃的腫瘤組織中HCCR-1原癌基因表達的蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果；圖28是顯示HCCR-1原癌基因在人染色體上位置的熒光原位雜交分析結(jié)果；發(fā)明詳述被用于本發(fā)明的哺乳動物細胞和轉(zhuǎn)基因哺乳動物制備的SEQ ID NO1人原癌基因(以下稱為“HCCR-1”原癌基因)，位于第12條染色體的長臂上(12q)，其具有一個可讀框，該可讀框編碼具有SEQ ID NO2的氨基酸序列、分子量為大約50kDa的蛋白。
考慮密碼子的兼并性以及在HCCR-1原癌基因?qū)⒁槐磉_的具體動物中的優(yōu)選密碼子，可以例如在沒有不利地改變所表達蛋白的氨基酸序列的編碼區(qū)中，或者在沒有不利地影響HCCR-1原癌基因表達的非編碼區(qū)中，得到SEQ ID NO1核苷酸序列的許多改變和變型。因此，本發(fā)明的范圍還包括具有與HCCR-1原癌基因及其片段基本上一致的堿基序列的多聚核苷酸序列。這里使用的“基本上一致的多聚核苷酸序列”指的是一個具有與HCCR-1原癌基因80％或更多，優(yōu)選90％或更多，最優(yōu)選95％或更多同源性的多聚核苷酸序列。
HCCR-1原癌基因可以從人的腫瘤組織中獲得或者采用常規(guī)的DNA合成的方法獲得。另外，如此制備的HCCR-1原癌基因可以插入到常規(guī)載體中以獲得表達載體。
接下來，表達載體可以轉(zhuǎn)移到一個合適的哺乳動物細胞中以獲得由此表達載體轉(zhuǎn)染的哺乳動物細胞。舉例來說，NIH/3T3細胞(ATCC CRL1658)，一種分化的小鼠成纖維細胞系，和293細胞(ATCC CRL 1573)，一個人的胚胎腎臟細胞系，被分別轉(zhuǎn)染包含HCCR-1原癌基因的表達載體pcDNA3/HCCR-1以獲得轉(zhuǎn)染HCCR-1原癌基因的NIH/3T3細胞和293細胞并被分別命名為HCCR-1M細胞和HCCR-1H細胞，根據(jù)布達佩斯條約中有關(guān)專利程序中菌種保藏的規(guī)定，這兩種細胞于2000年12月26日被保藏在韓國典型培養(yǎng)物保藏中心(KCTC)(地址#52，Oun-dong，Yusong-ku，Taejon 305-333，韓國)，序列號分別為KCTC 0923BP和KCTC0922BP。
如此獲得的本發(fā)明哺乳動物細胞過表達HCCR-1原癌基因并顯示出腫瘤膨大細胞的形態(tài)特征。具體地說，小鼠HCCR-1M細胞具有多面體形狀，帶有顯著的核仁的細胞核，發(fā)育良好的粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(rER)和高爾基復(fù)合體，細胞表面帶有細絨毛，并且呈現(xiàn)畸形的有絲分裂象。與野生型細胞相比，人的HCCR-1H細胞具有增大的細胞直徑和細胞體積。
本發(fā)明的哺乳動物細胞具有致瘤力，因此，移植此哺乳動物細胞的哺乳動物可以產(chǎn)生腫瘤如可觸瘤。而且，從腫瘤中分離的哺乳動物細胞亦具有致瘤力。例如，一種被命名為HCCR-1MN，從移植HCCR-1M細胞的裸鼠的可觸瘤中分離到的小鼠細胞，具有與那些HCCR-1M細胞相似的形態(tài)特征。
本發(fā)明的哺乳動物細胞產(chǎn)生大量與D52蛋白(基因庫序列號NM003288)相互作用的HCCR-1蛋白，據(jù)報道D52蛋白與乳腺癌有關(guān)(Byrne，J.A.et al.，Cancer Res.，55，2896-2903(1995)；和Byrne，J.A.et al.，Oncogene，16，873-881(1998))。它同時增強細胞內(nèi)的蛋白激酶C和端粒末端轉(zhuǎn)移酶的活性，引起特殊細胞周期關(guān)卡控制的丟失，和抑制egr-1的表達，從而誘使細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。在此過程中，與細胞周期調(diào)控有關(guān)的p53腫瘤抑制基因表達量增加，而絕大多數(shù)的p53蛋白是無活性的，從而導(dǎo)致細胞惡性轉(zhuǎn)化。HCCR-1原癌基因引起p53腫瘤抑制基因在上游水平發(fā)生功能喪失。因此，如果能鑒定出控制p53基因的HCCR-1原癌基因部分，那么通過改變相應(yīng)的核苷酸序列就可能使p53基因恢復(fù)活性。
此外，可以將包含HCCR-1原癌基因的核苷酸構(gòu)建體導(dǎo)入合適的哺乳動物如小鼠的胚胎，可以將如此得到的哺乳動物胚胎植入一個合適受體的子宮中并使其發(fā)育形成轉(zhuǎn)基因哺乳動物。這種建立轉(zhuǎn)基因哺乳動物的方法在本領(lǐng)域為人所熟知，優(yōu)選在胚胎的8細胞期或更早時期導(dǎo)入此核苷酸構(gòu)建體。
以此法建立的轉(zhuǎn)基因哺乳動物過表達HCCR-1原癌基因，并在乳房內(nèi)發(fā)展成為乳腺管乳突狀腺癌(ductal papillary adenocarcinoma of breast)，其表現(xiàn)出如下特征有明顯邊界的無包膜的節(jié)狀瘤；乳突狀結(jié)構(gòu)和腺或鴨樣結(jié)構(gòu)；中心部分發(fā)生大面積的壞死；具有不明顯界限的立方形或卵圓形細胞；正常的乳房組織鄰接在那里；和大量顆粒狀嗜酸性胞質(zhì)。
轉(zhuǎn)基因胚胎也可以通過雌雄轉(zhuǎn)基因哺乳動物交配而獲得。典型轉(zhuǎn)基因胚胎是小鼠FVB/N胚胎(被命名為小鼠胚胎HCCR-1)，其攜帶圖21結(jié)構(gòu)的核酸構(gòu)建體。根據(jù)布達佩斯條約中有關(guān)專利程序中菌種保藏的規(guī)定，這兩種細胞于2000年12月26日被保藏在韓國典型培養(yǎng)物保藏中心(KCTC)(地址#52，Oun-dong，Yusong-ku，Taejon 305-333，韓國)，序列號為KCTC 0924BP。
由于本發(fā)明的哺乳動物細胞和轉(zhuǎn)基因哺乳動物能夠過表達HCCR-1原癌基因以引發(fā)癌癥，因此它們在篩選致癌物或抗癌制劑，如抗氧化劑的應(yīng)用上是有利的。
此外，HCCR-1原癌基因在乳房、腎臟、卵巢和胃的腫瘤組織中過表達，因此其產(chǎn)物可以被有效地用于癌癥的診斷。癌癥的診斷可以通過能與HCCR-1原癌基因表達的HCCR-1 mRNA或蛋白特異結(jié)合的探針或抗體與來自受試者的乳房、腎臟、卵巢和胃的組織中的mRNA或蛋白的相互作用來實現(xiàn)；可以利用許多本領(lǐng)域已知的實驗技術(shù)來檢測HCCR-1mRNA或蛋白，從而確定受試者是否過表達HCCR-1原癌基因產(chǎn)物。利用放射性同位素或酶標記的探針或抗體可以很容易的檢測出原癌基因產(chǎn)物的存在。所以，本發(fā)明還提供了一個診斷乳腺癌、腎臟癌、卵巢癌和胃癌的試劑盒，此試劑盒含有一個可以與HCCR-1原癌基因表達的mRNA或蛋白特異結(jié)合的探針或抗體。典型的探針包括一段可以與HCCR-1原癌基因轉(zhuǎn)錄的mRNA或此mRNA的一部分互補的多核苷酸或者寡核苷酸，這樣使其可以與HCCR-1 mRNA特異結(jié)合，優(yōu)選的情況是其具有SEQID NO3的核苷酸序列。所述的探針可以從人組織中獲得或利用常規(guī)的DNA合成方法合成。此外，抗體可以利用本領(lǐng)域熟知的常規(guī)方法制備。
以下實施例的目的是為了進一步對本發(fā)明進行描述，而不是為了限制本發(fā)明。
參考實施例1透射電子顯微鏡(TEM)細胞或組織用2.5％的戊二醛磷酸緩沖液(pH7.4)固定，用2％的四氧化鋨進行后固定。樣品用濃度梯度乙醇進行脫水處理，并包埋在Epon812中。用乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛將超薄切片染色，并用透射電子顯微鏡(JEOL 1,200 EX，Tokyo，Japan)拍照。
參考實施例2蛋白質(zhì)印跡分析參照Laemmli所述的方法(Nature，227，680-685(1970))將細胞收集并在Laemmli樣品緩沖液中裂解。細胞質(zhì)蛋白用10％的SDS-PAGE分離并電印跡到硝酸纖維素膜上。硝酸纖維素膜與抗體一起溫浴。沖洗后，將膜在封阻液中溫浴，此封閉液含有1∶1,000稀釋的、作為二抗的過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗鼠免疫球蛋白(Jackson免疫學研究)。蛋白用ECL蛋白質(zhì)印跡分析試劑盒(Amersham)顯示。
參考實施例3免疫組織化學分析組織首先與一抗溫浴，而后切成5μm的厚度。結(jié)合的一抗用生物素?；?，抗生物素蛋白，生物素?；备^氧化物酶和氨乙基咔唑(AEC)等色素原顯色(HISTOSTAIN-BULKKITS，Zymed)。
參考實施例4總RNA的提取總RNA利用一個商品化的系統(tǒng)(RNeasy total RNA kit，Qiagen Inc.，Germany)從樣品組織或細胞中抽提，并利用Message clean試劑盒(GenHunter Corp.，USA)來去除污染的DNA。
參考實施例5RNA印跡分析20μg的總RNA用1％的甲醛瓊脂糖凝膠電泳后轉(zhuǎn)移到尼龍膜上(Boehringer-Mannheim，Germany)。將印跡與由rediprime II隨機引物標記系統(tǒng)(Amersham，UK)制備的32P隨機引物探針在42℃條件下雜交過夜。連續(xù)重復(fù)兩次RNA印跡分析，用光密度測定法進行定量，并用β-肌動蛋白探針對同樣的印跡進行雜交以確定mRNA的完整性。
制備實施例1包含HCCR-1原癌基因的表達載體的構(gòu)建大腸桿菌JM-109/HCCR1(KCTC 0667BP)帶有表達載體p CEV-LAC/HCCR-1，其包含由SEQ ID NO1核苷酸序列代表的全長HCCR-1cDNA。從大腸桿菌JM-109/HCCR1細胞培養(yǎng)物中分離表達載體pCEV-LAC/HCCR-1。然后用SalI酶切如此獲得的表達載體pCEV-LAC/HCCR-1以獲得包含HCCR-1全長cDNA的2.1kb的DNA片段。
用XhoI酶切哺乳動物表達載體pcDNA3(Invitrogene)以得到與SalI相配的末端。將2.1kb的SalI片段與XhoI消化的pcDNA3連接以獲得包含全長HCCR-1 cDNA的表達載體pcDNA3/HCCR-1。
制備實施例2抗HCCR-1抗體產(chǎn)物為了獲得制備抗HCCR-1抗體時有用的HCCR-1蛋白，從大腸桿菌JM-109/HCCR1(KCTC 0667BP)細胞培養(yǎng)物中分離表達載體pCEV-LAC/HCCR-1。以表達載體pCEV-LAC/HCCR-1為模板，以SEQ ID Nos4和5為引物進行聚和酶鏈式反應(yīng)(PCR)以獲得SEQ ID NO1的123到473的核苷酸序列(SEQ ID NO2的39-155氨基酸殘基)。將PCR產(chǎn)物插入到載體pMAL-p2(New England Biolab，USA)的BamHI/SalI酶切位點以獲得重組載體(命名為pMAL-p2/HCR-1-c-末端)，隨后，將pMAL-p2/HCCR-1-c-末端轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中(ATCC CRL 47092)。將轉(zhuǎn)化體在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所得到的培養(yǎng)物用100倍體積的LB培養(yǎng)基稀釋。稀釋培養(yǎng)物溫浴3小時后加入1mM的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)以誘導(dǎo)HCCR-1原癌基因的表達。衍生于載體pMAL-p2、與麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP，42kDa)融合的HCCR-1蛋白的C-末端得到表達，其分子量為大約64kDa。利用pMAL蛋白融合和純化系統(tǒng)(New England Biolab，USA)純化了此64kDa的融合蛋白。
給10只3個月大的，各重約2.5kg的新西蘭白兔進行腹部用藥，每周1mg的融合蛋白給予三次。把免疫兔子的血樣進行離心以獲得包含多克隆抗體的血清。
實施例1轉(zhuǎn)染HCCR-1原癌基因的小鼠細胞的制備利用從制備實施例1中得到的表達載體pcDNA3/HCCR-1用脂轉(zhuǎn)胺(lipofectamine)轉(zhuǎn)染NIH/3T3細胞(ATCC CRL 1658)——分化的小鼠成纖維細胞系，將得到的NIH/3T3細胞在補充有G418(Gibco)的WaymouthMB 752/1培養(yǎng)基中培養(yǎng)以獲得轉(zhuǎn)染HCCR-1原癌基因的NIH/3T3細胞，其被命名為HCCR-1M，于2000年12月26日保藏在韓國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為KCTC 0923BP。
實施例2轉(zhuǎn)染HCCR-1原癌基因的人源細胞的制備除了以293細胞(ATCC CRL-1573)代替NIH/3T3細胞之外，重復(fù)實施例1的操作程序，以獲得轉(zhuǎn)染HCCR-1原癌基因的293細胞細胞，其被命名為HCCR-1H，于2000年12月26日保藏在韓國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為KCTC 0922BP。
對照實施例用載體pcDNA3轉(zhuǎn)染的對照細胞的制備除了以載體pcDNA3(Invitrogen)代替載體pcDNA3/HCCR-1之外，重復(fù)實施例1的操作程序，以獲得轉(zhuǎn)染載體pcDNA3的對照細胞。
實施例3HCCR-1M細胞的形態(tài)特征(步驟1)HCCR-1M細胞的相差特征由實施例1獲得的HCCR-1M細胞在Waymouth MB 752/1培養(yǎng)基中進行單層培養(yǎng)后在相差顯微鏡下觀察。NIH/3T3的親代野生型細胞為對照。
圖1A和圖1B是HCCR-1M的單層培養(yǎng)細胞和NIH/3T3的親代野生型細胞各自的相差特征。從圖1A和圖1B中可以看出，NIH/3T3的親代野生型細胞呈紡錘體狀，具有細長的細胞核和稀少的細胞質(zhì)，而HCCR-1M細胞呈多面體狀，卵圓形的細胞核和飽滿的細胞質(zhì)。
(步驟2)蘇木精-伊紅染色由實施例1獲得的HCCR-1M細胞在Waymouth MB 752/1培養(yǎng)基中進行單層培養(yǎng)后用蘇木精-伊紅染色。
圖2是HCCR-1M單層培養(yǎng)細胞的蘇木精-伊紅染色結(jié)果。從圖2中可以看出，HCCR-1M細胞呈現(xiàn)細胞核多態(tài)性、清晰的核仁、顆粒狀染色質(zhì)模式、瘤巨細胞和不典型的有絲分裂特征。
(步驟3)TEM由實施例1獲得的HCCR-1M細胞按照參考實施例1的程序進行處理。
圖3是HCCR-1M細胞的TEM照片，單位刻度代表3μm，插頁是圓圈所示部位的高度放大圖(單位刻度，1μm)。從圖3中可以看出，HCCR-1M細胞表面帶有細絨毛，帶有顯著的核仁的分葉細胞核，發(fā)育良好的粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(rER)和高爾基復(fù)合體(圓圈)。
上述結(jié)果顯示HCCR-1M細胞具有腫瘤細胞的形態(tài)特征。
實施例4HCCR-1M細胞的腫瘤發(fā)生能力將由實施例1獲得的5×106的HCCR-1M細胞以皮下組織注射的方式被注射到9只裸鼠(背景為5周齡的無胸腺nu/nu BALB/c)軀干后側(cè)面。
所有注射HCCR-1M細胞的9只裸鼠在21天后均發(fā)現(xiàn)可觸的腫瘤。圖4是同種異體移植HCCR-1M細胞的裸鼠的照片。這說明HCCR-1M細胞具有腫瘤發(fā)生能力。
當皮下組織中的腫瘤直徑達到1.5-2.5cm時，裸鼠死亡，腫瘤被取出并用于下面的腫瘤分析和細胞系的建立。
實施例5移植HCCR-1M細胞的裸鼠的腫瘤結(jié)特征同種異體移植HCCR-1M細胞的裸鼠的腫瘤結(jié)特征的檢測如下。
(步驟1)蘇木精-伊紅染色用蘇木精-伊紅染色由實施例4獲得的腫瘤結(jié)。
圖5是腫瘤結(jié)的蘇木精-伊紅染色結(jié)果(×250)。從圖5中可以看出，腫瘤結(jié)具有典型的由纖維基質(zhì)分開的上皮細胞巢。
(步驟2)TEM
由實施例4獲得的腫瘤結(jié)按照參考實施例2的程序進行處理。
圖6是腫瘤結(jié)的TEM照片，單位刻度代表3μm，插頁是圓圈所示部位的高度放大圖(單位刻度，0.5μm)。從圖6中可以看出，腫瘤結(jié)細胞具有發(fā)育良好的細胞器和緊密連接的橋粒。這說明HCCR-1M細胞已變?yōu)楸砥ぜ毎?br> (步驟3)免疫組織化學分析將由實施例4獲得的腫瘤結(jié)按照參考實施例3的程序進行免疫組織化學分析，分別利用抗-網(wǎng)硬蛋白纖維、抗-角蛋白、抗-上皮膜抗原(EMA)和作為一抗的抗-波形蛋白抗體(DAKO)。
圖7A至7D分別是腫瘤結(jié)中網(wǎng)硬蛋白纖維、角蛋白、上皮膜抗原和波形蛋白表達產(chǎn)物的免疫組織化學分析結(jié)果(×250)。從圖7A至7D中可以看出，細胞巢被網(wǎng)硬蛋白纖維包圍(圖7A)，細胞顯示出上皮標記如角蛋白(圖7B)和EMA(圖7C)，以及間充質(zhì)標記如波形蛋白(圖7D)的共表達。這些結(jié)果說明HCCR-1原癌基因?qū)е麻g充質(zhì)NIH/3T3細胞向上皮細胞轉(zhuǎn)換。
特別是，導(dǎo)入原癌基因的間充質(zhì)NIH/3T3細胞轉(zhuǎn)化為肉瘤，而裸鼠異體移植HCCR-1M細胞后形成可觸瘤。
實施例6從異體移植HCCR-1M細胞的裸鼠中制備癌細胞系從由實施例4獲得的腫瘤結(jié)中分離細胞并在添加20％的胎牛血清的Waymouth MB 752/1培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，將其命名為HCCR-1MN細胞。
實施例7HCCR-1MN細胞的特征由實施例6獲得的HCCR-1MN細胞按照實施例3的步驟1程序在相差顯微鏡下觀察。
圖8是HCCR-1MN單層培養(yǎng)細胞的相差特征(×300)。從圖8中可以看出，HCCR-1MN細胞所具有的形態(tài)特征與實施例3的步驟1中HCCR-1M細胞所具有的形態(tài)特征相似。
實施例8HCCR-1M細胞與HCCR-1MN細胞的蛋白質(zhì)印跡分析為了檢測HCCR-1M細胞與HCCR-1MN細胞中HCCR-1原癌基因的表達情況，分別將由實施例1和實施例6獲得的HCCR-1M細胞與HCCR-1MN細胞，利用由制備實施例2獲得的抗-HCCR-1血清，按照參考實施例2程序進行蛋白質(zhì)印跡分析。為了比較，親代野生型NIH/3T3細胞和從比較實施例中獲得的NIH/3T3細胞也進行了蛋白質(zhì)印跡分析。
圖9是HCCR-1M細胞與HCCR-1MN細胞中HCCR-1原癌基因的表達的蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果。從圖9中可以看出，HCCR-1M細胞與HCCR-1MN細胞中HCCR-1蛋白過表達，但如圖中弱帶所示，親代野生型NIH/3T3細胞和轉(zhuǎn)染載體pcDNA3的NIH/3T3細胞中卻無過表達。
實施例9HCCR-1H細胞的特征為了檢測HCCR-1H細胞的形態(tài)特征，將HCCR-1H細胞按照實施例3的步驟1程序在相差顯微鏡下觀察。以親代野生型293細胞為對照。
圖10A和10B分別是HCCR-1H單層培養(yǎng)細胞和親代野生型293細胞的相差特征(×300)。從圖10A和10B中可以看出，HCCR-1H細胞與親代野生型293細胞相比具有增大的細胞直徑和細胞結(jié)構(gòu)。
實施例10HCCR-1H細胞的致瘤力為檢測HCCR-1H細胞的致瘤力，將由實施例2得到的HCCR-1H細胞按照實施例4的程序進行重復(fù)操作。
異種移植HCCR-1H細胞的裸鼠在21天后均發(fā)現(xiàn)可觸的腫瘤。這說明HCCR-1H細胞具有致瘤力。
當皮下組織中的腫瘤直徑達到1-1.5cm時，裸鼠死亡，腫瘤被取出并用于隨后的腫瘤分析。
實施例11移植HCCR-1H細胞的裸鼠的腫瘤結(jié)特征同種異體移植HCCR-1H細胞的裸鼠的腫瘤結(jié)特征的檢測如下。
(步驟1)蘇木精-伊紅染色用蘇木精-伊紅染色由實施例10獲得的腫瘤結(jié)。
圖11是可觸腫瘤結(jié)的蘇木精-伊紅染色結(jié)果(×250)。從圖11中可以看出，腫瘤結(jié)具有典型的上皮細胞癌的特征，如非典型細胞形狀，多型性，核仁增大，增加的細胞核與細胞質(zhì)的比率。
(步驟2)免疫組織化學分析由實施例10獲得的腫瘤結(jié)按照參考實施例3的程序進行免疫組織化學分析，分別利用抗-細胞角蛋白8、抗-細胞角蛋白19和作為一抗的抗-波形蛋白的抗體(DAKO)。
圖12A至12C分別是可觸腫瘤結(jié)中細胞角蛋白8、細胞角蛋白19和波形蛋白表達產(chǎn)物的免疫組織化學分析結(jié)果(×250)。從圖12A至12C中可以看出，腫瘤細胞顯示出上皮標記如細胞角蛋白8、細胞角蛋白19(圖12A和圖12B)，以及間充質(zhì)標記，波形蛋白(圖12C)的共表達。這些結(jié)果說明HCCR-1原癌基因?qū)е麻g充質(zhì)293細胞向上皮細胞轉(zhuǎn)換。
實施例12HCCR-1H細胞的RNA印跡分析為了檢測HCCR-1H細胞中HCCR-1原癌基因的表達水平，按照參考實施例4的程序，總RNA從由實施例2中獲得的HCCR-1H細胞中分離，利用32P標記的隨機HCCR-1 cDNA作探針，按照參考實施例5程序進行RNA印跡分析。
圖13是HCCR-1H細胞與親代野生型293細胞中HCCR-1原癌基因的表達的RNA印跡分析結(jié)果。從圖13中可以看出，在HCCR-1H細胞中過表達約2.1kb的mRNA單轉(zhuǎn)錄體，而親代野生型293細胞中卻沒有。
實施例13小鼠細胞中由HCCR-1原癌基因誘導(dǎo)的腫瘤發(fā)生機理為了檢測小鼠細胞中由HCCR-1原癌基因誘導(dǎo)的腫瘤發(fā)生機理，以下對據(jù)報道與腫瘤發(fā)生過程有關(guān)的蛋白酶C(PKC)和端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性異常，細胞周期關(guān)卡控制的消失，egr-1、c-fos和GAPDH表達的變化等進行評價。
(步驟1)PKC活性分析通常，腫瘤發(fā)展的第二步是使PKC介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑發(fā)生異常。為確保HCCR-1控制蛋白激酶C(PKC)的活性，利用親代野生型NIH/3T3細胞和從比較實施例中獲得的被載體pcDNA3轉(zhuǎn)染的比較NIH/3T3細胞以及由實施例1獲得的HCCR-1M細胞進行PKC分析。
PKC活性是按照開發(fā)商的介紹，利用Sigma TECTTM蛋白激酶C分析系統(tǒng)(Promega)來檢測的。PKC活性的定義是在存在和不存在磷脂的情況下，每分鐘結(jié)合到底物中的PKC量的差。每個數(shù)值是三個獨立實驗的平均值±s.d.。
圖14是親代野生型MH/3T3細胞，被載體pcDNA3轉(zhuǎn)染的比較NIH/3T3細胞和HCCR-1M細胞中PKC活性的圖表。從圖14中可以看出，HCCR-1M細胞中PKC的活性比野生型高出約10倍。這說明，HCCR-1原癌基因提高了細胞的PKC活性。
(步驟2)端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性分析基于PKC顯著提高端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性的報道，利用親代野生型NIH/3T3細胞和從比較實施例中獲得的被載體pcDNA3轉(zhuǎn)染的比較NIH/3T3細胞以及由實施例1獲得的HCCR-1M細胞進行端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性分析。
端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性是按照開發(fā)商的介紹，利用端粒末端轉(zhuǎn)移酶PCR-酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(Boehringer Mannheim，USA)來檢測的。試劑盒提供人端粒末端轉(zhuǎn)移酶陽性永生腎細胞作為陽性對照。以經(jīng)RNase預(yù)處理的293細胞為陰性對照。對1×103的細胞提取數(shù)量進行分析。結(jié)果顯示了四次獨立實驗的平均光密度(OD)值的均值(平均值±s.d.)。
圖15是陽性對照細胞、陰性對照細胞、親代野生型NIH/3T3細胞、被載體pcDNA3轉(zhuǎn)染的比較NIH/3T3細胞和HCCR-1M細胞中端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性示意圖。從圖15中可以看出，野生型NIH/3T3細胞顯示可檢測到的端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性，而HCCR-1M細胞與野生型細胞相比具有升高約7倍的端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性。陽性對照細胞中端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性很高而陰性對照細胞中的端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性卻檢測不到。這些結(jié)果與以往的研究是一致的(Holt，s.e.，Wright，W.E.和Shay J.W.Mol.Cell Biol.16，2931-2939(1996))，這說明HCCR-1M細胞具有由活化PKC誘發(fā)的高端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性。
(步驟3)細胞周期實驗?zāi)[瘤細胞特別對直接調(diào)控它們細胞周期的基因有必然的傷害。為了檢測HCCR-1M細胞中是否具有交替的生長機會，細胞周期概況的確定如下所述。
HCCR-1M細胞和親代野生型NIH/3T3細胞培養(yǎng)到中對數(shù)生長期后在含有0.5％的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中溫浴36小時，使其生長停滯。細胞用胰蛋白酶處理后收集并用70％乙醇固定。向2×106的細胞中添加50ug/ml碘化丙錠染色液和100單位/ml的RNase A(BoerhingerMannheim)。溫浴30分鐘后，用FACS Caliber(Becton Dickinson)在488nm下進行熒光分析以確定細胞中DNA的含量。用Modfit 5.2軟件對至少1×104的細胞/樣品進行分析。
確定了親代野生型NIH/3T3細胞和HCCR-1M細胞中G0/G1期、S期、G2/M期所占的百分率，結(jié)果如表I所示。
表I


從表I中可以看出，親代野生型NIH/3T3細胞和HCCR-1M細胞中S期細胞的比率分別為20.6％和31.5％。這些結(jié)果說明，HCCR-1M細胞中很大的群體明顯的發(fā)生了從G0/G1期到S期的轉(zhuǎn)變。
為了評價血清依賴的細胞周期進程，HCCR-1M細胞和親代野生型NIH/3T3細胞在含有0.5％的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中溫浴36小時使其生長停滯。將細胞轉(zhuǎn)移到含有20％的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在指定的時間內(nèi)收集以確證G0/G1期、S期、G2/M期細胞所占的百分率，結(jié)果如表II所示。
表II


從表II中可以看出，在0小時時，親代野生型NIH/3T3細胞中S期細胞的比率為8％，而HCCR-1M細胞中S期細胞的比率為21.8％。這些結(jié)果說明，持續(xù)過表達HCCR-1原癌基因可以產(chǎn)生相對量的、對血清剝奪性誘導(dǎo)的G0/G1期生長停滯具有抵抗力的細胞。在轉(zhuǎn)移到含有20％的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中使細胞從生長停滯狀態(tài)解脫以后，HCCR-1M細胞比野生型NIH/3T3細胞仍然多出超過10％的S期細胞。因此，過表達HCCR-1原癌基因可以對細胞產(chǎn)生縮短G0/G1期，增加S期的細胞數(shù)量等反調(diào)節(jié)。
(步驟4)egr-1、c-fos和GAPDH的表達模式基于egr-1、c-fos和GAPDH的表達模式參與了腫瘤形成的事實，如下檢測了由實施例1獲得的HCCR-1M細胞中egr-1、c-fos和GAPDH的表達模式。
在含有0.5％的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中溫浴36小時后，處于中對數(shù)生長期的HCCR-1M細胞和親代野生型NIH/3T3細胞的生長停滯(休眠期)。將細胞轉(zhuǎn)移到新鮮的含有20％的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)0，15，30，60和120分鐘以刺激生長(有絲分裂期)。按照參考實施例4的程序從休眠期和有絲分裂期的細胞中抽提總RNA，并利用32P隨機引物標記的egr-1、c-fos和GAPDH的cDNA為探針，依據(jù)參考實施例5的程序?qū)嵤㏑NA印跡雜交。
圖16A、16B和16C分別是HCCR-1M細胞和親代野生型NIH/3T3細胞中egr-1、c-fos和GAPDH表達產(chǎn)物的RNA印跡雜交結(jié)果。從圖16A至16C中可以看出，與野生型NIH/3T3細胞相比較，有絲分裂期的HCCR-1M細胞對egr-1的表達顯示出明顯的負調(diào)節(jié)，對GAPDH顯示出正調(diào)節(jié)而對c-fos的表達無顯著影響。
這些結(jié)果說明，小鼠NIH/3T3細胞中對HCCR-1基因的反調(diào)節(jié)引起PKC和端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性的增高，細胞周期尤其是關(guān)卡控制的消失，egr-1表達的負調(diào)節(jié)等結(jié)果，從而誘使細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。
實施例14人細胞中HCCR-1原癌基因誘發(fā)的腫瘤發(fā)生機理為了確證人細胞中HCCR-1原癌基因誘發(fā)的腫瘤發(fā)生機理，下面檢測了p53腫瘤抑制子、MDM2、Bax、p21WAF1、p16INK4A、和p14ARF等已報道的與腫瘤有關(guān)的基因的表達模式。
(步驟1)p53腫瘤抑制子的表達模式為了確證HCCR-1H細胞中p53的表達模式，如下進行蛋白質(zhì)印跡分析與RNA印跡分析溶解由實施例2獲得的HCCR-1H細胞和親代野生型293細胞，依據(jù)參考實施例2的程序，利用只與野生型p53作用的單克隆抗p53抗體DO-7(氨基酸37至45；Novocastra Laboratories，Ltd.，UK)或者與野生型與突變型p53均起作用的Ab-5(DO-7克隆)(氨基酸37至45；NEOMARKERS，INC.，CA)對胞溶產(chǎn)物進行蛋白質(zhì)印跡分析。用鼠抗人β-肌動蛋白抗體(Sigma)進行了同樣的印跡分析以確定總的蛋白含量。
圖17A是HCCR-1H細胞和親代野生型293細胞中p53腫瘤抑制子表達產(chǎn)物的蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果；圖17B是β-肌動蛋白同樣的印跡分析結(jié)果。從圖17A可以看出，與親代野生型293細胞相比，HCCR-1H細胞中p53蛋白水平有顯著提高。
另外，由實施例2獲得的HCCR-1H細胞在含有2％的胎牛血清和2mM的谷氨酰胺但不含甲硫氨酸的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)2小時后，用100μl的L-35S甲硫氨酸(Amersham)進行標記。將這些細胞用1×Hanks緩沖液(Gibco，USA)沖洗，然后用正常的含L-甲硫氨酸的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)0.5，1，2或4小時。這些細胞在免測沉淀溶液(50mMTris[pH8.0]，5mM EDTA，150mM NaCl，1％Np-40，1mM苯基甲基磺?；铮?0mM苯甲脒，1μg胃酶抑素(pepstain)/ml，10mM亞硫酸氫鈉)中溶解，用50μl的A-瓊脂糖溶液(Sigma)沖洗后定量。利用抗-p53抗體對這些細胞的胞溶產(chǎn)物進行免測沉淀(Kessler，S.W.，J.Immunol.，115，1617-1623(1975))，然后進行SDS-PAGE。使用Hep 3B肝癌細胞重復(fù)上述操作程序，作為缺少p53基因的對照。
圖18顯示的是HCCR-1H細胞和親代野生型293細胞中p53腫瘤抑制子表達的免測沉淀結(jié)果。從圖18可以看出，與親代野生型293細胞相比，HCCR-1H細胞中p53蛋白水平有顯著提高。由此，可以認為在由HCCR-1原癌基因誘發(fā)的腫瘤發(fā)生機理中，p53蛋白大量表達，但并不能抑制腫瘤，仍保持非活性狀態(tài)。
(步驟2)MDM2、Bax、p21WAF1、p16INK4A、和p14ARF等基因的表達模式盡管直接影響腫瘤抑制基因p21WAF1和p16INK4A，但是由于p53只是調(diào)控圈中的一員，而此調(diào)控圈還涉及MDM2、Bax和p14ARF，所以對MDM2、Bax、p21WAF1、p16INK4A、和p14ARF等基因的表達模式進行分析。
利用由實施例2獲得的HCCR-1H細胞；和抗-MDM2、抗-Bax、抗-p21WAF1、抗-p16INK4A抗體(Oncogene ResearchProducts，USA)和p14ARF(Lab Vision，USA)，依據(jù)參考實施例2程序進行蛋白質(zhì)印跡分析。用抗-β-肌動蛋白抗體(Sigma)進行了同樣的印跡分析以確定總的蛋白含量。
圖19A、19C、19E、19G和19I是HCCR-1H細胞中MDM2，Bax，p21WAF1，p16INK4A和p14ARF等基因表達的蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果；圖19B、19D、19F、19H和19J是β-肌動蛋白的蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果。從圖19A、19C、19E、19G和19I可以看出，與親代野生型293細胞相比，MDM2，Bax，p21WAF1，p16INK4A和p14ARF等蛋白水平下降。這些結(jié)果說明，HCCR-1的過表達可以確定的抑制MDM2，Bax，p21WAF1，p16INK4A和p14ARF等的轉(zhuǎn)錄，從而降低它們的蛋白水平。
總結(jié)這些結(jié)果以及步驟1中的結(jié)果，可以相信HCCR-1的過表達可以增加p53的穩(wěn)定性，但p53蛋白卻不能形成正向調(diào)控MDM2，Bax和p21WAF1表達的自動調(diào)控圈。特別地，從圖19E、和19G可以看出，HCCR-1H細胞中的激酶抑制家族基因p21WAF1和p16INK4A處于p53非依賴性的機制的負調(diào)控。從圖19I可以看出，p14ARF無論在親代野生型293細胞中，還是在HCCR-1H細胞中均無異常表達。這些結(jié)果說明，MDM2-p14ARF調(diào)控圈的改變不是p53失活的可能機理。
上述結(jié)果和實施例13的步驟3的結(jié)果表明，小鼠和人細胞中HCCR-1原癌基因的過表達能夠影響對細胞周期的控制，并和p53以及p21細胞周期調(diào)控因子有關(guān)聯(lián)。
(步驟3)HCCR-1的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用中的配偶體(partner)為確證HCCR-1的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用中的配偶體，下面進行了酵母雙雜交篩選試驗。
大腸桿菌JM-109/HCCR1(KCTC 0667BP)培養(yǎng)后從中分離出表達載體pCEV-LAC/HCCR-1。然后用SalI酶切表達載體pCEV-LAC/HCCR-1并獲得HCCR-1原癌基因，然后插入到包含pLexA DNA結(jié)合域的酵母雙雜交載體(Clontech，USA)的BamHI/SalI位點獲得載體pLexA-HCCR-1，并表達pLexADNA結(jié)合域與HCCR-1的融合蛋白。將載體pLexA-HCCR-1與酵母EGY48(Clontech，USA)混合，42℃加熱10分鐘以轉(zhuǎn)化酵母。用同樣的方法將融合有包含pLexA激活域的pB42AD的人胎腦cDNA文庫(Clontech，USA)轉(zhuǎn)化所得到的酵母。將轉(zhuǎn)化體影印培養(yǎng)到Trp-，Leu-，His-的篩選平板上進行β-半乳糖苷酶過濾提升分析。當轉(zhuǎn)化體含有衍生于cDNA文庫的伴侶基因時，與pLexA激活域融合的伴侶蛋白結(jié)合到與pLexA DNA結(jié)合域融合的HCCR-1蛋白上，在含有X-gal的平板培養(yǎng)基上就形成一個藍色菌落。為了估計假陽性，進行了酵母交配分析(Guarente，L.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90，1639-1641(1993))。
從通過上述方法得到的克隆中篩選到了一個編碼HCCR-1的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用中的配偶體的基因。
將通過上述方法得到的菌落在葡萄糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并從中利用玻璃珠抽提到包含配偶體基因的載體。此載體用電穿孔法導(dǎo)入大腸桿菌KC8(Clontech，USA)中，隨后涂布于M9基本培養(yǎng)基上以篩選轉(zhuǎn)化株。用從轉(zhuǎn)化株中抽提到的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，并在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)以擴增質(zhì)粒DNA。從培養(yǎng)物中抽提到的質(zhì)粒DNA用HindIII酶切以獲得一個包含配偶體基因的1kb片段。配偶體基因的核苷酸序列被證明與TPD52L2基因(基因庫序列號NM003288)相同。TPD52L2基因編碼的D52蛋白最初是由于它在人乳腺癌中增高的表達水平而被發(fā)現(xiàn)的，并在鈣介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑和細胞增殖中起作用(Byrne，J.A.，et al.，Cancer Res.，55，2896-2903(1995)；and Byrne，J.A.，et al.，Oncogene，16，873-881(1998))。
(步驟4)共轉(zhuǎn)染為了檢測HCCR-1蛋白和D52蛋白之間的相互作用，下面對它們開展了共轉(zhuǎn)染研究。
大腸桿菌JM-109/HCCR1(KCTC 0667BP)培養(yǎng)后從中分離出表達載體pCEV-LAC/HCCR-1。然后用SalI酶切表達載體pCEV-LAC/HCCR-1以獲得HCCR-1全長cDNA，然后插入到表達載體N-末端pFALG-CMV(Sigma，USA)的SalI酶切位點以獲得表達FLAG和HCCR-1融合蛋白的表達載體pFLAG-HCCR-1。將由步驟3獲得的TPD52L2基因插入到表達載體pcDNA3(體外遺傳，USA)的NotI酶切位點以獲得表達GST和D52融合蛋白的表達載體pGST-TPD52L2。
用表達載體pFLAG-HCCR-1和pGST-TPD52L2共轉(zhuǎn)染CHO細胞，并在RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。48小時后，用胰蛋白酶處理并收集CHO細胞。將CHO細胞用PBS沖洗并重懸于IP緩沖液(10mM Tris-HCl[pH7.4]，150mM NaCl，1％Np40，2mM釩酸鈉，10mM氟化鈉，10mM焦磷酸鈉，5mM EDTA，10μg/ml抑肽酶(aprotinine)，10μg/ml白胃素(leupeptine)，10μg/ml胃酶抑素(pepstatine)，1mM苯基甲基磺?；?。隨后使細胞懸液通過27針儀并將離心所得到的胞溶產(chǎn)物以沉淀未破碎細胞。上清液通過免疫前IgG和球蛋白A的混合物(Sigma，USA)預(yù)清除。利用抗-FLAG或抗-GST抗體(Sigma，USA)免疫沉淀胞溶產(chǎn)物中的融合蛋白FLAG-HCCR-1或GST-TPD52L2(Kesler，s.w.，J.Immunol.，115，1617-1623(1975))。依據(jù)參考實施例2的程序利用抗-GST或抗-FLAG抗體對剩余的蛋白樣品進行蛋白質(zhì)印跡分析。
圖20A和20B分別是GST蛋白與FLAG蛋白的蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果。從圖20A和20B中可以看出，在兩種沉淀中均檢測到融合蛋白。這些結(jié)果表明，D52蛋白與HCCR-1蛋白相互作用。
實施例15轉(zhuǎn)基因小鼠的制備為了證實HCCR-1原癌基因在體內(nèi)誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生，建立在CMV啟動子控制下表達HCCR-1原癌基因的轉(zhuǎn)基因小鼠。
為了獲得用于制備轉(zhuǎn)基因小鼠的HCCR-1的全長cDNA，從大腸桿菌JM-109/HCCR1(KCTC 0667BP)細胞培養(yǎng)物中分離表達載體pCEV-LAC/HCCR-1。用SalI酶切表達載體pCEV-LAC/HCCR-1，將獲得的HCCR-1全長cDNA插入到表達載體pcDNA3的XhoI酶切位點以獲得表達載體pcDNA3/HCCR-1。用SalI和XmnI酶切表達載體pCEV-LAC/HCCR-1，在0.7％的瓊脂糖凝膠中進行電泳并用電洗脫分離。分離出的DNA片段從10mM Tris-HCl(pH7.4)/0.2mM EDTA溶液中析出并調(diào)至終濃度4ng/ml。如圖21所示，所得DNA的結(jié)構(gòu)包括CMV啟動子，HCCR-1的cDNA基因和牛生長激素(bGH)polyA序列。
按照前核DNA微注射法(Gordon，J.W.，et al.，Pro.Natl.Acad.Sci.USA，77，7382-7384(1980))，將DNA微注射到小鼠FVB/N系(Samyuk Corp.，CAMTAKO，Korea)的一個受精卵中將DNA溶液微注射到1-細胞期的受精卵前核中，并培養(yǎng)20小時以篩選2-細胞期胚胎。將2-細胞期的胚胎植入到假孕受體ICR小鼠(Samyuk Corp.，CAMTAKO，Korea)的輸卵管內(nèi)。從受體小鼠中獲得子代小鼠，并將通過對其尾部活檢而獲得的DNA樣品進行DNA印跡分析。
圖22是衍生于由HCCR-1原癌基因誘導(dǎo)的胚胎的轉(zhuǎn)基因小鼠。從圖22中可以看出，大小為1.5cm×1.5cm的腫瘤結(jié)位于胸部相鄰的右腋部位。
分離出的腫瘤用裸眼進行了觀察。
圖23是轉(zhuǎn)基因小鼠的乳房腫瘤圖片。從圖23中可以看出，轉(zhuǎn)基因小鼠的腫瘤是單一的，沒有包膜卻具清晰輪廓的節(jié)狀瘤。
為了確證腫瘤的形態(tài)特征，對其進行了蘇木精-伊紅染色。圖24是腫瘤的蘇木精-伊紅染色結(jié)果。從圖24中可以看出，此腫瘤包括乳突狀結(jié)構(gòu)和腺或鴨樣結(jié)構(gòu)。中心部分發(fā)生大面積的壞死。正常乳房組織與腫瘤明顯相鄰。立方形或卵圓形細胞具有不明顯的界限并且具有適量的顆粒狀嗜酸性胞質(zhì)。腫瘤細胞具有大的、多型的，含染色質(zhì)多的核，并且有許多有絲分裂，包括一些非典型形態(tài)。注意到一些小但是明顯的核仁。這些結(jié)果說明，轉(zhuǎn)基因小鼠的腫瘤呈現(xiàn)乳腺管乳突狀腺癌的特征。
圖25是腫瘤的透射電子顯微鏡照片，單位刻度代表2μm。從圖25中可以看出，卵圓形腫瘤細胞具有豐富的胞質(zhì)細胞器。細胞核具有聚集的具邊緣的染色體和明顯的核仁。細胞質(zhì)中充滿了一些線粒體和許多囊狀的囊泡化的rER。一些橋粒是明顯的。
所述轉(zhuǎn)基因小鼠的胚胎被命名為HCCR-1，其于2000年12月26日被保藏于韓國典型培養(yǎng)物保藏中心，序列號為KCTC 0924BP。
實施例16HCCR-1原癌基因在乳房、腎臟、卵巢和胃腫瘤組織中的表達為了檢測乳房、腎臟、卵巢和胃的腫瘤組織中HCCR-1原癌基因的表達，按照參考實施例4的程序，從乳房、腎臟、卵巢和胃的腫瘤組織中抽提總RNA，利用32P隨機HCCR-1 cDNA作探針，按照參考實施例5程序進行RNA印跡分析。為了比較，用乳房、腎臟、卵巢和胃的正常組織重復(fù)上述操作。
圖26A是乳房、腎臟、卵巢和胃的腫瘤組織中HCCR-1原癌基因的表達的RNA印跡分析結(jié)果；圖26B是β-肌動蛋白探針的RNA印跡分析結(jié)果。從圖26A和26B中可以看出，與正常組織相比，人的乳房、腎臟、卵巢和胃的腫瘤組織中HCCR-1原癌基因的表達水平增高。
為了檢測乳房、腎臟、卵巢和胃的腫瘤組織中HCCR-1蛋白的表達，利用依據(jù)參考實施例2程序由制備實施例2獲得的抗-HCCR-1血清對乳房、腎臟、卵巢和胃的腫瘤組織進行了蛋白質(zhì)印跡分析。
圖27是乳房、腎臟、卵巢和胃的腫瘤組織中HCCR-1原癌基因表達的蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果。從圖27中可以看出，分別與其相對應(yīng)的正常組織相比，人的乳房、腎臟、卵巢和胃的腫瘤組織中50kDa的HCCR-1蛋白均顯示出升高的表達。
實施例17HCCR-1原癌基因在染色體上的位置用隨機引物標記試劑盒(Promega，USA)對由制備實施例1獲得的HCCR-1全長cDNA進行標記以獲得探針。利用此探針對人類胎盤λ基因組文庫(Stratagene，USA)進行篩選以獲得20kb的基因組DNA。
對基因組DNA進行熒光原位雜交(FISH)(Cherif，D.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87，6639-6649(1990))利用缺口翻譯試劑盒(Vysis，USA)，用SpectrumRed-dUTP對載片上的基因組DNA進行標記。用蔡斯熒光顯微鏡觀察載玻片。染色體用DAPI(Sigma，USA)進行復(fù)染。
圖28是熒光原位雜交分析結(jié)果，其顯示出HCCR-1原癌基因位于12號染色體的長臂。
雖然僅僅參照優(yōu)選的實施方案對本發(fā)明進行了描述，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以在不離開本發(fā)明精神和范圍的情況下制造出各種改變和變型，這些改變和變型被限定在后附的權(quán)利要求
中。
序列表<110>金振宇<120>攜帶人原癌基因的哺乳動物癌細胞和轉(zhuǎn)基因哺乳動物以及利用上述原癌基因的癌癥診斷試劑盒<130>pca10102/KJW<150>KR 2001-41<151>2001-01-02<160>5<170>KOPATIN 1.5<210>1<211>2118<212>DNA<213>智人<220><221>CDS<222>(9)..(1088)<220><221>信號肽<222>(9)..(83)<220><221>混和特征<222>(435)..(494)<223>跨膜結(jié)構(gòu)域<400>1ctgtgaag atg gcg ctc tcc agg gtg tgc tgg gct cgg tcg gct gtg tgg 50Met Ala Leu Ser Arg Val Cys Trp Ala Arg Ser Ala Val Trp1 5 10ggc tcg gca gtc acc cct gga cat ttt gtc acc cgg agg ctg caa ctt 98Gly Ser Ala Val Thr Pro Gly His Phe Val Thr Arg Arg Leu Gln Leu15 20 25 30ggt cgc tct ggc ctg gct tgg ggg gcc cct cgg tct tca aag ctt cac 146Gly Arg Ser Gly Leu Ala Trp Gly Ala Pro Arg Ser Ser Lys Leu His35 40 45ctt tct cca aag gca gat gtg aag aac ttg atg tct tat gtg gta acc 194Leu Ser Pro Lys Ala Asp Val Lys Asn Leu Met Ser Tyr Val Val Thr50 55 60aag aca aaa gcg att aat ggg aaa tac cat cgt ttc ttg ggt cgt cat 242Lys Thr Lys Ala Ile Asn Gly Lys Tyr His Arg Phe Leu Gly Arg His65 70 75ttc ccc cgc ttc tat atc ctg tac aca atc ttc atg aaa gga ttg cag 290Phe Pro Arg Phe Tyr Ile Leu Tyr Thr Ile Phe Met Lys Gly Leu Gln80 85 90atg tta tgg gct gat gcc aaa aag gct aga aga ata aag aca aat atg 338Met Leu Trp Ala Asp Ala Lys Lys Ala Arg Arg Ile Lys Thr Asn Met95 100 105 110tgg aag cac aat ata aag ttt cat caa ctt cca tac cgg gag atg gag 386Trp Lys His Asn Ile Lys Phe His Gln Leu Pro Tyr Arg Glu Met Glu115 120 125cat ttg aga cag ttc cgc caa gac gtc acc aag tgt ctt ttc cta ggt 434His Leu Arg GLn Phe Arg Gln Asp Val Thr Lys Cys Leu Phe Leu Gly130 135 140att att tcc att cca cct ttt gcc aac tac ctg gtc ttc ttg cta atg 482Ile Ile Ser Ile Pro Pro Phe Ala Asn Tyr Leu Val Phe Leu Leu Met145 150 155tac ctg ttt ccc agg eaa cta ctg atc agg cat ttc tgg acc cca aaa 530Tyr Leu Phe Pro Arg Gln Leu Leu Ile Arg His Phe Trp Thr Pro Lys160 165 170caa caa act gat ttc tta gat atc tat cat gct ttc cgg aag cag tcc 578Gln Gln Thr Asp Phe Leu Asp Ile Tyr His Ala Phe Arg Lys Gln Ser175 180 185 190cac cca gaa att att agt tat tta gaa aag gtc atc cct ctc att tct 626His Pro Glu Ile Ile Ser Tyr Leu Glu Lys Val Ile Pro Leu Ile Ser
195 200 205gat gca gga ctc cgg tgg cgt ctg aca gat ctg tgc acc aag ata cag 674Asp Ala Gly Leu Arg Trp Arg Leu Thr Asp Leu Cys Thr Lys Ile Gln210 215 220cgt ggt acc cac cca gca ata cat gat atc ttg gct ctg aga gag tgt 722Arg Gly Thr His Pro Ala Ile His Asp Ile Leu Ala Leu Arg Glu Cys225 230 235ttc tct aac cat cct ctg ggc atg aac caa ctc cag gct ttg cac gtg 770Phe Ser Asn His Pro Leu Gly Met Asn Gln Leu Gln Ala Leu His Val240 245 250aaa gcc ttg agc cgg gcc atg ctt ctc aca tct tac ctg cct cct ccc 818Lys Ala Leu Ser Arg Ala Met Leu Leu Thr Ser Tyr Leu Pro Pro Pro255 260 265 270ttg ttg aga cat cgt ttg aag act cat aca act gtg att cac caa ctg 866Leu Leu Arg His Arg Leu Lys Thr His Thr Thr Val Ile His Gln Leu275 280 285gac aag gct ttg gca aag ctg ggg att ggc cag ctg act gct cag gaa 914Asp Lys Ala Leu Ala Lys Leu Gly Ile Gly Gln Leu Thr Ala Gln Glu290 295 300gta aaa tcg gct tgt tat ctc cgt ggc ctg aat tct acg cat att ggt 962Val Lys Ser Ala Cys Tyr Leu Arg Gly Leu Asn Ser Thr His Ile Gly305 310 315gaa gat agg tgt cga act tgg ctg gga gaa tgg ctg cag att tcc tgc 1010Glu Asp Arg Cys Arg Thr Trp Leu Gly Glu Trp Leu Gln Ile Ser Cys320 325 330agc ctg aaa gaa gct gag ctg tct ctc ttg ctg cac aac gtg gtc ctg 1058Ser Leu Lys Glu Ala Glu Leu Ser Leu Leu Leu His Asn Val Val Leu335 340 345 350ctc tcc acc aac tac ctt ggg aca agg cgc tg aatgaaccat ggagcggatg 1110Leu Ser Thr Asn Tyr Leu Gly Thr Arg Arg355 360gcattgtcct gcagtcgtat agtatagcag tgcaggaaca aacagcactt gccagcaaag 1170tctgtgtgta ctgttaagtg tgtgggaggc agagagagga gcaggggcca tgggcttcac 1230agcatggcac acctgtggga actgcagaca ttcctctcac agctagaact gaaacaaacc 1290ctcttgctag gggtggtccg tgtgaggtgt catcctgtcc ccctcataat tactaatagc 1350tggaactggc agcagcctct actgggcttt tactgtgatg tgttcagttc atgtcctagg 1410aagtcagctt ttgccccagg tgggaatcct tatttggctt aggactgatc cacttccatg 1470ttacttacat ctgtgggttt ttgttgttgc tgttagaaaa tttttggctg gtgaaaacag 1530cactcctttg gctggagcac ttgtgtccat gcatgtactt gggtgtttcc ctccatcctt 1590tctgatatga ccaaaaatca agttgttttg ttttttgtca ccttcactgg catgggctaa 1650ccacttcttt ttcaaaccct ctgaacacct ttttctgatg ggtaacttgc aggaatattc 1710tattggaaaa gataacagga agtacaagtg cttcttgacc ccttcctcaa tgtttctagc 1770cttcactctc cattgtcttt tctgggctgt attacagccc tctgtggatc ttcaactctg 1830ctgcctccac tgtgatgcag cagtccaact gtaactgaca gtggctgcct tctctgggcc 1890atggatcaca cctgtaaggt actaattact gcccagcctg gggagatcag gagaggtctg 1950catagttagt aagttgggtt tagcttttgt gtgtgcatca gtgacttaga gttctgtaat 2010aacttattgt aaatgcatga agcactgttt ttaaacccaa gtaaagactg cttgaaacct 2070gttgatggaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 2118<210>2<211>360<212>PRT<213>智人<400>2Met Ala Leu Ser Arg Val Cys Trp Ala Arg Ser Ala Val Trp Gly Ser1 5 10 15Ala Val Thr Pro Gly His Phe Val Thr Arg Arg Leu Gln Leu Gly Arg20 25 30Ser Gly Leu Ala Trp Gly Ala Pro Arg Ser Ser Lys Leu His Leu Ser35 40 45Pro Lys Ala Asp Val Lys Asn Leu Met Ser Tyr Val Val Thr Lys Thr50 55 60Lys Ala Ile Asn Gly Lys Tyr His Arg Phe Leu Gly Arg His Phe Pro65 70 75 80Arg Phe Tyr Ile Leu Tyr Thr Ile Phe Met Lys Gly Leu Gln Met Leu85 90 95Trp Ala Asp Ala Lys Lys Ala Arg Arg Ile Lys Thr Asn Met Trp Lys100 105 110His Asn Ile Lys Phe His Gln Leu Pro Tyr Arg Glu Met Glu His Leu115 120 125Arg Gln Phe Arg Gln Asp Val Thr Lys Cys Leu Phe Leu Gly Ile Ile130 135 140Ser Ile Pro Pro Phe Ala Asn Tyr Leu Val Phe Leu Leu Met Tyr Leu145 150 155 160Phe Pro Arg Gln Leu Leu Ile Arg His Phe Trp Thr Pro Lys Gln Gln165 170 175Thr Asp Phe Leu Asp Ile Tyr His Ala Phe Arg Lys Gln Ser His Pro180 185 190Glu Ile Ile Ser Tyr Leu Glu Lys Val Ile Pro Leu Ile Ser Asp Ala195 200 205Gly Leu Arg Trp Arg Leu Thr Asp Leu Cys Thr Lys Ile Gln Arg Gly210 215 220Thr His Pro Ala Ile His Asp Ile Leu Ala Leu Arg Glu Cys Phe Ser225 230 235 240Asn His Pro Leu Gly Met Asn Gln Leu Gln Ala Leu His Val Lys Ala245 250 255Leu Ser Arg Ala Met Leu Leu Thr Ser Tyr Leu Pro Pro Pro Leu Leu
260 265 270Arg His Arg Leu Lys Thr His Thr Thr Val Ile His Gln Leu Asp Lys275 280 285Ala Leu Ala Lys Leu Gly Ile Gly Gln Leu Thr Ala Gln Glu Val Lys290 295 300Ser Ala Cys Tyr Leu Arg Gly Leu Asn Ser Thr His Ile Gly Glu Asp305 310 315 320Arg Cys Arg Thr Trp Leu Gly Glu Trp Leu Gln Ile Ser Cys Ser Leu325 330 335Lys Glu Ala Glu Leu Ser Leu Leu Leu His Asn Val Val Leu Leu Ser340 345 350Thr Asn Tyr Leu Gly Thr Arg Arg355 360<210>3<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>特異結(jié)合到HCCR-1 mRNA的寡核苷酸序列<400>3cctggacatt ttgtcacc 18<210>4<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<220><221>混和特征<222>(10)..(15)<223>BamHI限制酶切位點<400>4aggcaactag gatccaggca tttct 25<210>5<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<220><221>混合特征<222>(1)..(6)<223>SalI的限制酶切位點<400>5gtcgacgcag ttcccacagg tgtgccatg 29
權(quán)利要求
1.一種被表達載體轉(zhuǎn)化的哺乳動物細胞，所述的表達載體包含具有SEQ ID NO1核苷酸序列的人原癌基因。
2.權(quán)利要求
1的哺乳動物細胞，其為小鼠細胞系HCCR-1M(KCTC0923BP)或者人細胞系HCCR-1H(KCTC 0922BP)。
3.一種攜帶被引入的核酸構(gòu)建體的哺乳動物胚胎，所述的核酸構(gòu)建體包含具有SEQ ID NO1核苷酸序列的人原癌基因。
4.權(quán)利要求
3的哺乳動物胚胎，其中的哺乳動物是小鼠FVB。
5.權(quán)利要求
4的哺乳動物胚胎，其為小鼠胚胎HCCR-1(KCTC0924BP)。
6.一種轉(zhuǎn)基因患癌的哺乳動物，其衍生于權(quán)利要求
3-5任何一項中的胚胎。
7.權(quán)利要求
6的轉(zhuǎn)基因哺乳動物，其中的癌癥是乳腺管乳突狀腺癌。
8.一種用于癌癥診斷的試劑盒，所述的癌癥選自乳腺癌、腎臟癌、卵巢癌和胃癌，該試劑盒包含一個探針，該探針包含互補于人HCCR-1原癌基因轉(zhuǎn)錄的mRNA或一部分所述mRNA的核苷酸序列，所述的人原癌基因具有SEQ ID NO1核苷酸序列；或者所述試劑盒包含一種抗體，該抗體特異結(jié)合于由所述mRNA翻譯的蛋白或者一部分所述蛋白。
專利摘要
本發(fā)明提供了一種由包含具有SEQ ID NO1的核苷酸序列的人原癌基因的表達載體所轉(zhuǎn)染的哺乳動物細胞；一種帶有包含人的原癌基因的核苷酸構(gòu)建體的哺乳動物胚胎；一種從哺乳動物胚胎中衍生的轉(zhuǎn)癌基因哺乳動物；一種診斷乳腺癌、腎臟癌、卵巢癌和胃癌的試劑盒，此試劑盒含有一種可以與人的原癌基因轉(zhuǎn)錄的mRNA或一部分所述mRNA互補的核苷酸序列探針，或一種可以與mRNA的翻譯蛋白或所述蛋白的一部分特異結(jié)合的抗體。
文檔編號A01K67/027GKCN1484692SQ01821693
公開日2004年3月24日 申請日期2001年7月11日
發(fā)明者金振宇 申請人:金振宇導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan