專利名稱:生產(chǎn)果糖轉移酶的微生物和采用該微生物生產(chǎn)果糖低聚糖和新果糖低聚糖的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及能夠同時生產(chǎn)果糖低聚糖和新果糖低聚糖的一種新的微生物和用所述微生物生產(chǎn)果糖低聚糖和新果糖低聚糖地方法。更具體地說，本發(fā)明涉及來源于土壤的柑桔青霉(Penicillium citrinum)KCTC10225BP，它產(chǎn)生果糖轉移酶，同時用所述果糖轉移酶水解蔗糖成為下列結構式I的果糖低聚糖
結構式I
其中n是整數(shù)1～5，G代表葡萄糖而F代表果糖；以及下列結構式II的新果糖低聚糖。
結構式II 其中n是1～5的整數(shù)，G和F定義如上，本發(fā)明還涉及采用所述微生物生產(chǎn)果糖低聚糖和新果糖低聚糖的方法。
背景技術：
果糖低聚糖是一種低聚糖的混合物，其中低聚糖包括1-蔗果三糖(GF2)、霉菌赤蘚醛糖(GF3)和果糖霉菌赤蘚醛糖(GF4)，其中果糖的1至3個分子通過β-(2，1)鍵分別與蔗糖結合，它們在植物中廣泛存在，例如蘆筍、洋蔥、土豆、蜂蜜等。由于它們優(yōu)良的性能包括例如低的卡路里值、促進乳酸菌和雙歧桿菌的增殖、改進腸道內的微生物區(qū)系和抑制致病細菌的生長、改進腸道蠕動和增強免疫，它們與低聚糖一起作為食品原料現(xiàn)在受到高度重視。因此在各種工業(yè)領域都能找到低聚糖的應用實例，包括食品、飲料、糖果、保健食品之類等等。
特別是，據(jù)報道果糖低聚糖在與二聯(lián)果糖酐III(DFA III)(見日本專利公開號NO.11-43438)聯(lián)合使用時，顯示出杰出的鈣吸收作用。美國專利號5,827,526公開了每天給患者服用0.5g～5g果糖低聚糖能夠減少腹瀉的持續(xù)時間和復發(fā)。
已公開的韓國專利申請No.2000-57520公開了與其它低聚糖相比，果糖低聚糖和半乳糖低聚糖與各種食用成分的混合物能夠改善腸內的流動并有效地表達生物出現(xiàn)前的效應。而且，由于果糖低聚糖通過誘導雙歧乳酸桿菌的增殖顯著促進腸蠕動(其中雙歧乳酸桿菌是構成人類腸道正常微生物區(qū)系的細菌之一)，不影響攝入后的血糖水平，也不會被任何消化酶分解，目前它被作為研究開發(fā)糖尿病人飲食的對象。此外還發(fā)現(xiàn)它們能夠降低血液和肝臟中的膽固醇水平。果糖低聚糖的這些作用還沒有受到仔細的研究。
按照傳統(tǒng)，通過采用能夠產(chǎn)生果糖轉移酶的微生物的方法生產(chǎn)果糖低聚糖。例如，已知使用出芽短柄霉(Aureobasidium pullulans)菌株的方法，使用黑曲霉(Aspergillus niger)的方法和使用青霉屬和鐮孢屬和(Fusariurm sps.)的方法。但是，采用這些方法制備的果糖轉移酶的缺點是低的蔗糖水解效價。
未經(jīng)審查的日本專利申請?zhí)?0-165192公開了采用柑桔青霉FERM P-15944真菌制備β-呋喃果糖苷酶的方法，采用這種方法能夠從蔗糖中生產(chǎn)傳統(tǒng)的果糖低聚糖和新果糖低聚糖的混合物。據(jù)文中所述新果糖低聚糖是一種由新蔗果三糖(6G-β-呋喃果糖基-蔗糖)，新霉菌赤蘚醛糖(6G-β-呋喃果糖基-蔗果三糖)和新果糖基霉菌赤蘚醛糖(6G-β-呋喃果糖基-霉菌赤蘚醛糖)組成的混合物，其結構中果糖的1至3個分子通過β-(2，6)鍵分別與蔗糖結合，不同于傳統(tǒng)的的果糖低聚糖。文中還描述了新果糖低聚糖具有濕潤作用、良好的甜味、低卡路里和抗齲洞作用以及誘導腸內細菌增殖和在腸道內促進局部免疫應答的功能，從而能夠用于各種領域諸如甜味劑、功能食品、飼料、醫(yī)藥和殺蟲劑促進劑。
D.Grizard等公開了了一種采用Cytolase PCL5生產(chǎn)果糖低聚糖和新果糖低聚糖混合物的方法，Cytolase PCL5是市售的來自泡盛曲霉(Aspergillusawamori)的酶(D.Gizard，C.Barthomuf，食品生物技術(Food Biotechnology)，13(1)93-105，1999)。
美國專利號5,334,516公開了采用來源于聚多曲霉(Aspergillus sydowi)的酶從傳統(tǒng)的果糖低聚糖生產(chǎn)新果糖低聚糖(表達為支鏈果糖低聚糖)的方法。
因此，本發(fā)明人已經(jīng)深入調查和研究了現(xiàn)有技術并對各種高收率生產(chǎn)果糖低聚糖的方法進行了研究。結果，我們最終鑒定了一種新的微生物，它能夠產(chǎn)生蔗糖水解效價高的果糖轉移酶，并證明通過將這種微生物與高度濃縮的蔗糖溶液反應能夠以高的收率生產(chǎn)傳統(tǒng)的果糖低聚糖和新果糖低聚糖。基于上述發(fā)現(xiàn)提出了本發(fā)明。
發(fā)明的公開
本發(fā)明的目標是提供一種新的微生物，它能夠生產(chǎn)高效價的果糖轉移酶。
本發(fā)明的另一個目標是提供通過將這種微生物與高度濃縮的蔗糖溶液反應高收率生產(chǎn)果糖低聚糖和新果糖低聚糖的方法。
因此，為了實現(xiàn)上述目標，本發(fā)明提供來源于土壤的柑桔青霉KCTC10225BP，它生產(chǎn)果糖轉移酶，同時用所述果糖轉移酶水解蔗糖成為如下結構式I的果糖低聚糖。
結構式I其中n是整數(shù)1～5，G代表葡萄糖而F代表果糖；和下列結構式II的新果糖低聚糖
結構式II其中n是1～5的整數(shù)，G和F定義如上，本發(fā)明還涉及用所述微生物生產(chǎn)果糖低聚糖和新果糖低聚糖的方法。
另一方面，本發(fā)明提供生產(chǎn)果糖低聚糖和新果糖低聚糖的方法，其包括以下步驟在26到28℃溫度下，將根據(jù)本發(fā)明的微生物柑桔青霉KCTC10225BP，在第一種子培養(yǎng)基中以100到200rpm速度振蕩種子培養(yǎng)2天活化這種微生物；
在26℃到28℃，以200到500rpm速度振蕩，以0.5到1v/vm的速率注入空氣的條件下，在發(fā)酵培養(yǎng)基中大量生產(chǎn)這種微生物；并通過離心法收集所產(chǎn)生的微生物，用0.85％的生理鹽水洗滌兩次，然后在蔗糖白利濃度為60到77的蔗糖溶液中培養(yǎng)20～50小時，白利濃度通過初始插入傳感器測定，培養(yǎng)條件為溫度范圍為35℃到50℃，pH為5到7，振蕩速度為100到300rpm。
另一方面本發(fā)明提供生產(chǎn)果糖低聚糖和新果糖低聚糖的方法，其包括以下步聚
種子培養(yǎng)按照本發(fā)明的微生物柑桔青霉KCTC10225BP；
大量生產(chǎn)這種種子培養(yǎng)的微生物；
將大量生產(chǎn)的微生物與載體混合形成珠子，然后裝柱；和
將蔗糖溶液通過用珠子填充的柱子。
又一方面，本發(fā)明提供來源于按照本發(fā)明的微生物柑桔青霉KCTC10225BP的果糖轉移酶，其顯示高的蔗糖水解效價。附圖簡要說明
在與附圖聯(lián)系起來閱讀以下詳細說明后，本發(fā)明的上述目標和其他特征以及優(yōu)點將更為明顯，其中

圖1顯示當改變按照本發(fā)明的柑桔青霉KCTC10225BP的生物量時的蔗糖水解水平，其中斜率為(單位/lg蔗糖)果糖轉移酶的蔗糖水解效價；
圖2a顯示采用發(fā)酵罐，同時振蕩速度從300rpm變化到500rpm時，微生物的生物量隨主要培養(yǎng)的發(fā)酵時間的變化；
圖2b顯示采用發(fā)酵罐，同時振蕩速度從300rpm變化至500rpm時，細胞內外的酶量隨主要培養(yǎng)發(fā)酵時間的變化；
圖2c顯示采用發(fā)酵罐在600rpm的振蕩速度下，微生物生物量和胞內的酶量隨主要培養(yǎng)的發(fā)酵時間的變化；
圖3a顯示在5升發(fā)酵罐中將按照本發(fā)明的柑桔青霉KCTC10225BP接種到31蔗糖溶液中后，在分批發(fā)酵中果糖低聚糖和新果糖低聚糖的產(chǎn)量隨蔗糖濃度的變化；
圖3b顯示在5升反應器中將按照本發(fā)明的柑桔青霉KCTC10225BP的生物質混合入31蔗糖溶液中后，在分批生產(chǎn)中果糖低聚糖和新果糖低聚糖產(chǎn)量隨氫離子濃度(pH)的變化；
圖3c顯示在5升反應器中將根據(jù)本發(fā)明的柑桔青霉KCTC10225BP的生物質混合入3升蔗糖溶液中后，在分批生產(chǎn)中果糖低聚糖和新果糖低聚糖產(chǎn)量隨溫度的變化；
圖3d顯示在5升反應器中將根據(jù)本發(fā)明的柑桔青霉KCTC10225BP的生物質混合入3升蔗糖溶液中后，在分批生產(chǎn)中與果糖低聚糖和新果糖低聚糖產(chǎn)量隨振蕩速度的變化；
圖4顯示當固定在藻酸鹽上的按照本發(fā)明的柑桔青霉KCTC10225BP與高度濃縮的蔗糖溶液連續(xù)反應時，果糖低聚糖和新果糖低聚糖產(chǎn)量的變化。實施本發(fā)明的最佳模式
現(xiàn)將本發(fā)明詳細描述如下。
本發(fā)明人收集韓國Inchon糖廠周圍分布的土壤并從土壤中分離微生物。發(fā)現(xiàn)其中有一種微生物顯示出產(chǎn)生高效價的果糖轉移酶的能力。這種新的微生物經(jīng)鑒定是柑桔青霉(Penicillium citrinum)，它是一種屬于青霉屬的真菌。將這種微生物于2001年2月27日保存在位于韓國Oun-dong，Yusong-gu，Taejon的韓國生物科學和生物技術研究所(KRIBB)，保存編號為KCTC-10225BP，從而使第三方能得到這種微生物。
本發(fā)明人檢查了根據(jù)本發(fā)明的微生物柑桔青霉KCTC10225BP的科學特征和形態(tài)，結果見表2。測量了從這種微生物產(chǎn)生的果糖轉移酶的蔗糖水解效價，平均為1.5單位/lg蔗糖。這項試驗結果表明與以下試驗結果相比，從根據(jù)本發(fā)明的柑桔青霉KCTC10225BP產(chǎn)生的果糖轉移酶具有高于任何其他已知酶的蔗糖水解效價美國專利5,334,516中需要至少5單位的從曲霉屬產(chǎn)生的酶才能降解1g的蔗糖，D.Grizard等的試驗結果需要7單位的從泡盛曲霉產(chǎn)生的酶才能降解1g蔗糖。
采用根據(jù)本發(fā)明的微生物柑桔青霉KCTC10225BP能夠同時以高收率生產(chǎn)果糖低聚糖和新果糖低聚糖。能用于生產(chǎn)果糖低聚糖和新果糖低聚糖的方法包括分批生產(chǎn)和固定連續(xù)生產(chǎn)的方法等這些本領域眾所周知的方法。
分批生產(chǎn)方法是最常用的方法，其中通過混合含有這種酶的微生物與蔗糖溶液，將蔗糖溶液(底物)與果糖轉移酶反應獲得產(chǎn)品。一方面，本發(fā)明提供采用根據(jù)本發(fā)明的柑桔青霉KCTC10225BP以高收率生產(chǎn)果糖低聚糖和新果糖低聚糖的分批生產(chǎn)方法。
同時，固定連續(xù)生產(chǎn)方法至今也被廣泛應用，其中微生物或酶被固定在載體中，將底物與載體接觸使其與微生物或酶反應。這種方法的優(yōu)點是微生物或酶能夠重復使用并且反應能夠連續(xù)進行。但是，這些方法也有缺點，為固定酶，應提取和分離微生物中所含的酶，而從微生物中提取的酶一般是不穩(wěn)定的。因此，當前采用一種使用固定的微生物細胞的方法，其中微生物直接被固定在載體中。這種微生物固定化方法不需要從微生物細胞中分離酶，于是避免了在酶的提取過程中酶活性的降低。另外，此方法還有一個優(yōu)點是復雜的酶的提取和分離過程能夠一步完成。因此，另一方面，本發(fā)明提供通過將根據(jù)本發(fā)明的柑桔青霉KCTC10225BP固定在載體中來連續(xù)生產(chǎn)果糖低聚糖和新果糖低聚糖的方法。根據(jù)本發(fā)明的這種固定連續(xù)生產(chǎn)方法詳細解釋如下。
首先，將按照本發(fā)明的柑桔青霉KCTC10225BP作種子培養(yǎng)。在發(fā)酵培養(yǎng)基中大量生產(chǎn)種子培養(yǎng)的微生物。種子培養(yǎng)優(yōu)選在26℃～28℃以100～200rpm的速度振蕩下培養(yǎng)兩天。大量生產(chǎn)優(yōu)選在26℃～28℃、以200～600rpm的速度振蕩下并以0.5到1v/vm的速率注入空氣的條件下培養(yǎng)42到72小時。然后將大量生產(chǎn)的微生物與載體充分混合。將所得混合物形成珠子，再裝柱。雖然不限制使用本領域常用的載體，但是載體優(yōu)選選自海藻酸膠、光交聯(lián)樹脂、丙烯酰胺凝膠、K-角叉藻聚糖、脫乙酰殼多糖和明膠。載體的濃度優(yōu)選1～2％。然后將蔗糖溶液通過用珠子裝成的柱子，優(yōu)選蔗糖溶液濃度為60～70白利，流速為100～300ml/hr，溫度為35～55℃。
表1顯示兩個試驗結果，其中通過采用按照本發(fā)明的柑桔青霉KCTC10225BP以分批方法和固定連續(xù)方法生產(chǎn)果糖低聚糖。
表1
如表1所示，當采用分批生產(chǎn)方法時，需要400克微生物才能生產(chǎn)100升果糖低聚糖，生產(chǎn)1升果糖低聚糖需要的反應時間大約為24小時。但是，在反應完成以后，為了從微生物中分離產(chǎn)生的果糖低聚糖，清洗反應容器并用新鮮的蔗糖溶液和微生物填充反應容器還需要12小時，才能開始下一個反應。與此相比，在固定連續(xù)方法中，生產(chǎn)100升果糖低聚糖需要50克微生物，以4.02升/天的生產(chǎn)效率，生產(chǎn)100升果糖低聚糖所需的反應時間約25天。因此可確定當采用固定連續(xù)方法時，只需要更少的微生物，而生產(chǎn)效率卻高出分批方法的6倍。
現(xiàn)在，將采用如下實施例中所示的實施方案詳細描述本發(fā)明。但是，這些實施例是用于闡述本發(fā)明而并非限制本發(fā)明的范圍。
實施例1微生物的鑒定
從韓國Inchon糖廠周圍收集的土壤中獲取微生物。發(fā)現(xiàn)其中的一種微生物具有生產(chǎn)高效價果糖轉移酶的能力。這種新的微生物被鑒定為柑桔青霉，它是屬于青霉屬的真菌類。將這種微生物于2001年2月27日保存在位于韓國Oun-dong，Yusong-gu，Taejon的韓國生物科學和生物技術研究所(KRIBB)，保存編號為KCTC10225BP，從而使第三方能得到這種微生物。
根據(jù)本發(fā)明的這種微生物柑桔青霉KCTC10225BP在本領域常用的真菌培養(yǎng)基Czapek Yeast Algae(CYA)和Malt Extract Algae(MEA)中生長。所鑒定的這種微生物柑桔青霉KCTC10225BP在這兩種培養(yǎng)基中生長時顯示出基本相似的性質和形態(tài)。這種微生物的科學特征和形態(tài)如下表2所示。
表2實施例2種子培養(yǎng)和酶效價測定
作為用于微生物柑桔青霉KCTC10225BP種子培養(yǎng)的培養(yǎng)基，對如韓國公開專利1989-1127所描述的培養(yǎng)產(chǎn)生果糖低聚糖微生物所用的培養(yǎng)基組合物作了改動。這種改進的培養(yǎng)基組合物如表3所示。將該微生物在250毫升燒瓶中培養(yǎng)，加入培養(yǎng)基的量為50毫升。培養(yǎng)在振蕩培養(yǎng)箱中進行，振蕩速度為150rpm，溫度為28℃，培養(yǎng)兩天。
表3
注用5N的鹽酸調pH值至6。
然后，測定從培養(yǎng)的柑桔青霉KCTC10225BP制備的果糖轉移酶的蔗糖水解效價。按照Shinohara Satoshi(日本未審查的專利申請No.10-165192)描述的方法測定蔗糖水解效價。酶效價定義為每單位時間(分鐘)通過水解蔗糖(一種糖底物)產(chǎn)生的葡萄糖的量(μmol)。發(fā)現(xiàn)從根據(jù)本發(fā)明的微生物柑桔青霉KCTC10225BP制備的果糖轉移酶具有平均1.5單位/1g蔗糖的蔗糖水解效價。這項結果表明與以下結果相比，來自根據(jù)本發(fā)明的柑桔青霉KCTC10225BP的果糖轉移酶具有高于任何其他已知酶的蔗糖水解效價美國專利5,334,516中需要至少5單位來自曲霉屬的酶才能降解1g的蔗糖，D.Crizard等的試驗結果需要7單位來自泡盛曲霉的酶才能降解1g蔗糖。
另外，通過檢測根據(jù)本發(fā)明的微生物生物量的蔗糖水解效價，注意到隨著柑桔青霉KCTC10225BP生物量的增加，蔗糖的降解也增加。實施例3主要培養(yǎng)
主要培養(yǎng)(大量生產(chǎn))在一個5升的發(fā)酵罐(Hanil R&D Co.，Ltd.Korea)中采用實施例2中種子培養(yǎng)的微生物進行。在發(fā)酵罐中接種微生物，其量為培養(yǎng)基的5％(v/v)。反應條件為Yu Moo-Young(已公開韓國專利公開No1989-01127)描述方法的改進。圖2a顯示采用發(fā)酵罐，振蕩器的振蕩速度從300rpm變化到500rpm時，微生物的生物量隨培養(yǎng)時間的變化。如圖2a所示，當振蕩速度增加，微生物的量也增加。圖2b顯示，細胞內外的酶量隨振蕩速度的變化。在500rpm的振蕩速度下，50個小時后胞內酶的量有減少的傾向。這種現(xiàn)象被認為是由于微生物的老化和發(fā)酵罐中環(huán)境的惡化引起的。類似的，以400rpm振蕩速度振蕩，50小時后胞內酶的量減少。但是，沒有觀察到胞外酶量的增加。預計微生物分泌物增加的胞外酶的量大約為20單位，考慮到發(fā)酵罐的體積，該數(shù)量太小以致于難于檢測到。圖2c顯示采用發(fā)酵罐在600rpm的振蕩速度下，微生物生物量和胞內酶量隨主要培養(yǎng)的發(fā)酵時間的變化。在培養(yǎng)時間內，微生物生物量和酶量增加。發(fā)酵罐的振蕩速度增加，微生物生物量呈增加趨勢。在形態(tài)學上，當振蕩速度達到400rpm或以上時，可觀察到微膠體，在振蕩速度為200rpm或以下時可以觀察到直徑2毫米的大丸出現(xiàn)。
在酶生產(chǎn)方面，微生物中存在的酶量是每1克微生物1400單位的酶，存在于微生物外的酶量是每1毫升培養(yǎng)基含有150單位的酶。由此可見，根據(jù)本發(fā)明的微生物產(chǎn)生的酶量是Shinohara等的柑桔青霉FERM P-15944(日本未審專利申請No10-165192)的2.8倍，后者含有的酶量為500單位/g。實施例4采用分批生產(chǎn)方法生產(chǎn)果糖低聚糖
用蔗糖溶液與實施例2中制備的微生物反應生產(chǎn)果糖低聚糖。用果糖低聚糖的量除以產(chǎn)生的傳統(tǒng)果糖低聚糖、新果糖低聚糖、果糖、葡萄糖和殘余蔗糖的總和，計算果糖低聚糖的總含量(固體％)。根據(jù)振蕩速度、培養(yǎng)時間、蔗糖濃度、pH和溫度變化，測量總果糖低聚糖含量(固體％)的變化。圖3a顯示的是總果糖低聚糖的產(chǎn)量隨蔗糖濃度的變化。蔗糖溶液的濃度為60～70白利時，觀察到最高的低聚糖產(chǎn)率。當蔗糖溶液濃度高于70白利時，蔗糖結晶為白色沉淀并和果糖低聚糖一起干擾了反應。因此，工業(yè)生產(chǎn)的最佳蔗糖濃度為最高至70白利。同時蔗糖濃度低時，反應可能被其它的微生物污染。因此，最佳的蔗糖濃度為65～70白利。在反應時間方面，24小時內固體比率達到最大65％，這表明本發(fā)明可以毫無疑問地用于實際工業(yè)生產(chǎn)。
圖3b顯示pH在3～7的范圍內，根據(jù)本發(fā)明的果糖低聚糖含量(固體％)的變化。注意pH5～7時果糖低聚糖(固體％)的產(chǎn)率高。
在隨后的試驗中，將蔗糖溶液進行反應時，不通過加入單獨的緩沖溶液來調節(jié)反應的pH值。因此，在工業(yè)生產(chǎn)方面，生產(chǎn)果糖低聚糖的方法可進一步簡化，不需要另外處理。
圖3c顯示果糖低聚糖總含量(固體％)隨反應溫度的變化。溫度高至40℃時，果糖低聚糖總含量呈持續(xù)增加趨勢。就反應速率而言，最高的反應活性出現(xiàn)在45℃。24小時內反應完成。由于在高溫下進行培養(yǎng)，預計其他微生物污染的問題可以得到解決。但是盡管在45℃時，酶效價比其他文件公開的高，但是果糖低聚糖的總產(chǎn)量并不顯著高于其他。這可以用一種已提出的理論解釋，即反應器中蔗糖水解產(chǎn)生的的葡萄糖的積聚抑制了低聚糖的生產(chǎn)。
作為這種問題的解決辦法，建議消耗葡萄糖，包括如加入葡萄糖氧化酶或酵母來消耗葡萄糖(參見Yoon，Jong-won等，韓國生物技術和生物工程學會公報(The Bulletin of the Korean Society for Biotechnology andBicengineerirny)，9，40-47，1994)。但是在本發(fā)明中沒有使用這種方法，這是因為可能產(chǎn)生雜質。
圖3d顯示果糖低聚糖總含量(固體％)隨振蕩速度的變化?？梢宰⒁獾诫S振蕩速度增加，反應活性下降。據(jù)信這是因為在高速振蕩時產(chǎn)生的氣泡減少了蔗糖溶液與微生物之間的反應面積。因此最佳的振蕩速度是最高至200rpm。在本發(fā)明中使用100rpm的振蕩速度生產(chǎn)果糖低聚糖。通過進行上述試驗生產(chǎn)含有新果糖低聚糖的果糖低聚糖，確定最佳的果糖低聚糖生產(chǎn)條件為100rpm振蕩速度，反應24小時，反應溫度為45℃，蔗糖濃度為60～65白利。實施例5通過固定微生物連續(xù)生產(chǎn)果糖低聚糖
將實施例2中種子培養(yǎng)的柑桔青霉KCTC10225BP以5％(v/v)培養(yǎng)基的量接種在5升發(fā)酵罐(Hanil R&D Co.，Ltd，Korea)中并培養(yǎng)。在培養(yǎng)完成后，收集微生物，并將其固定在藻酸鈉(Junsei Chemical，Japan)用于生產(chǎn)果糖低聚糖。將特定濃度的這些微生物與特定濃度的藻酸鹽混合。將所得混合物使用蠕動泵(Gilson，F(xiàn)rance)以預先確定的速率通過直徑1mm的針頭，以20cm的高度滴入1％氯化鈣水溶液(CaCl2)，并使用磁力攪拌器攪拌。用1％的氯化鈣(CaCl2)水溶液通過溶液中鈣離子(Ca2+)和藻酸鹽中鈉離子(Na+)之間的離子交換反應形成珠子。為了確定微生物和藻酸鹽結合的最佳濃度，將25～100克/升的微生物與1～2％的藻酸鹽混合。結果發(fā)現(xiàn)最高達50克/升的微生物和最高達1.5％的藻酸鹽混合形成很好的球狀珠子。超過前述濃度條件時，由于粘性增加，形成了形狀不均勻的珠子。因此，本實施例中采用50克/升的微生物與1.5％形狀的藻酸鹽混合生產(chǎn)珠子。所得珠子在4℃下貯存10小時，用蒸餾水洗滌，浸入4℃60白利的蔗糖溶液中老化10小時。然后將這些珠子裝在1升的玻璃柱子中，將60白利的蔗糖溶液流過這個柱子。此時反應溫度為45℃，蔗糖溶液通過蠕動泵以200毫升/小時的速率注入。圖4顯示40天內用固定連續(xù)法生產(chǎn)果糖低聚糖和新果糖低聚糖的產(chǎn)量變化。可以看到生產(chǎn)的果糖低聚糖的總固體含量(％)恒定在55％～60％的范圍之內，珠子的形狀和硬度與初始狀態(tài)沒有不同。
通過進行上述試驗生產(chǎn)含新果糖低聚糖的果糖低聚糖，發(fā)現(xiàn)用固定連續(xù)方法生產(chǎn)果糖低聚糖的最佳條件為蔗糖濃度為60白利，反應溫度45℃，蔗糖溶液的流速為150～200毫升/小時。實施例6果糖低聚糖分析
采用高壓液相色譜(HPLC)系統(tǒng)(Shimadzu，Japan)分析實施例4和實施例5獲得的果糖低聚糖。采用了Daiso Co.，Ltd.(Osaka，Japan)生產(chǎn)的ODS柱(5微米，150mm×4mm)和折射率檢測器。由于已經(jīng)探測到一種不同于傳統(tǒng)果糖低聚糖的物質，采用了Waters Corp.(Massachusetts，USA)生產(chǎn)的真制備型高壓液相色譜(Prep-HPLC)系統(tǒng)分離產(chǎn)物。采用ARX 400MHz NMR分光計(Bruker，Germany)對所得組分進行NMR分析以確定它們的結構。試驗結果見如下表4
表4
如上表所示，可以證明采用根據(jù)本發(fā)明的微生物柑桔青霉KCTC10225BP生產(chǎn)的果糖低聚糖含有傳統(tǒng)的果糖低聚糖(結構式I)，還含有結構不同于傳統(tǒng)果糖低聚糖的新果糖低聚糖(結構式2)。因此，證明在本發(fā)明中使用的微生物柑桔青霉KCTC10225BP可以同時生產(chǎn)傳統(tǒng)果糖低聚糖和具有不同結構的新果糖低聚糖。
工業(yè)實用性如上所述，本發(fā)明鑒定了一種新的微生物柑桔青霉KCTC10225BP，它能夠水解蔗糖成為傳統(tǒng)果糖低聚糖和新果糖低聚糖。從柑桔青霉KCTC10225BP制備的果糖轉移酶具有比傳統(tǒng)的微生物產(chǎn)生的酶高得多的蔗糖水解效價。因此，使用柑桔青霉KCTC10225BP能夠低成本高收率地生產(chǎn)果糖低聚糖和新果糖低聚糖。
權利要求
1、來源于土壤的柑桔青霉(Penicillium citrinum)KCTC10225BP，其能夠產(chǎn)生果糖轉移酶并用所述果糖轉移酶水解蔗糖為如下結構式I的果糖低聚糖
結構式I
其中n是整數(shù)1～5，G代表葡萄糖而F代表果糖，和下列結構式II的新果糖低聚糖
結構式II
其中n是1～5的整數(shù)，G和F定義如上。
2.用權利要求
1定義的微生物柑桔青霉KCTC10225BP，從蔗糖同時生產(chǎn)果糖低聚糖和新果糖低聚糖的方法。
3.按照權利要求
2生產(chǎn)果糖低聚糖和新果糖低聚糖的方法，其包括如下步驟
將按照權利要求
1定義的微生物柑桔青霉KCTC 10225BP于26～28℃、100～200rmp的振蕩速度下在第一種子培養(yǎng)基中種子培養(yǎng)2天來活化該微生物；
在26～28℃、振蕩速度為200～600rmp、注入空氣速率為0.5～1v/vm的條件下在發(fā)酵培養(yǎng)基中大量生產(chǎn)這種微生物72小時；并
通過離心法收集所產(chǎn)生的微生物，用0.85％的生理鹽水洗滌兩遍，接著在蔗糖白利濃度為60～77的蔗糖溶液中培養(yǎng)20～50小時，白利濃度通過初始插入傳感器測定，培養(yǎng)條件為溫度范圍為35～50℃，pH值為5～7，同時振蕩速度為100～300rmp。
4.按照權利要求
2生產(chǎn)果糖低聚糖和新果糖低聚糖的方法，其包括如下步驟
種子培養(yǎng)如權利要求
1定義的微生物柑桔青霉KCTC10225BP。
大量生產(chǎn)這種種子培養(yǎng)的微生物。
將大量生產(chǎn)的微生物與載體混合形成珠子，然后裝柱；和
將蔗糖溶液通過用珠子填充的柱子。
5.按照權利要求
4的方法，其中在26～28℃、振蕩速度為100～200rmp的條件下，進行種子培養(yǎng)2天。
6.按照權利要求
4的方法，其中大量生產(chǎn)步驟在26～28℃下進行42～72小時，同時振蕩速度為200～600rmp，以0.5～1v/vm的速率注入空氣。
7.按照權利要求
4的方法，其中載體選自海藻酸膠、光交聯(lián)樹脂、丙烯酰胺凝膠、脫乙酰殼多糖和明膠。
8.按照權利要求
4的方法，其中載體使用濃度為1～2％。
9.按照權利要求
4的方法，其中采用經(jīng)1毫米直徑的針頭將微生物和載體的混合物滴入1～2％的氯化鈣水溶液中的方法生產(chǎn)珠子。
10.按照權利要求
4的方法，其中蔗糖溶液的濃度為60～70白利。
11.按照權利要求
4的方法，其中蔗糖溶液在35～55℃的溫度下，以100～300ml/hour的速率通過柱子。
12.來自按照權利要求
1的微生物柑桔青霉KCTC10225BP的果糖轉移酶，其具有水解每1克蔗糖需1.5單位酶的蔗糖水解效價。
專利摘要
本發(fā)明涉及一種新的微生物和生產(chǎn)果糖低聚糖和新果糖低聚糖的方法。更具體地說，本發(fā)明涉及來源于土壤的柑桔青霉KCTC 10225BP，這種微生物產(chǎn)生果糖轉移酶，同時采用所述果糖轉移酶將蔗糖水解成如下結構式I的果糖低聚糖，其中n是整數(shù)1～5，G代表葡萄糖而F代表果糖，和下列結構式II的新果糖低聚糖，其中n是1～5的整數(shù)，G和F定義如上；本發(fā)明還涉及用所述微生物同時生產(chǎn)果糖低聚糖和新果糖低聚糖的方法。
文檔編號C12P19/00GKCN1390945SQ02140122
公開日2003年1月15日 申請日期2002年5月14日
發(fā)明者韓埈相, 樸康埈, 申大燮, 金政勳, 金鎮(zhèn)哲, 李起昌, 李韻和, 金承昱, 樸承源 申請人:第一制糖株式會社導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan