本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)，具體為原發(fā)性肝癌的microrna標(biāo)志物的引物、試劑盒和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、原發(fā)性肝癌是一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。臨床上通常把肝癌分為四期（i期-iv期），分別對(duì)應(yīng)極早期、早期、進(jìn)展期和終末晚期。如果患者能在極早期和早期積極治療，如手術(shù)切除或局部消融治療，那么患者預(yù)后效果較好，通常五年生存率可以達(dá)到80%至90%。這是因?yàn)樾「伟┩ǔ](méi)有侵犯血管，也沒(méi)有發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，因此治療效果較好。但對(duì)于中晚期肝癌，尤其是當(dāng)癌癥已經(jīng)擴(kuò)散到肝臟以外的部位或者有多個(gè)腫瘤存在時(shí)，治愈的可能性大大降低，晚期肝癌的五年生存率通常低于10%，甚至更低。因此，肝癌準(zhǔn)確的早期診斷顯得尤為重要。

2、在中國(guó)，很多患者在確診肝癌時(shí)已經(jīng)處于中晚期。據(jù)估計(jì)，大約只有20%到30%的肝癌患者能夠在疾病早期被發(fā)現(xiàn)。這一方面是由于肝癌早期往往缺乏明顯的癥狀，患者僅有輕微的不適，如疲勞、食欲不振等非特異性癥狀，這些容易被忽視或誤認(rèn)為其他較輕的健康問(wèn)題。另一方面是由于目前用于肝癌篩查的主要手段如超聲波檢查和血液中的甲胎蛋白(afp)檢測(cè)，仍然存在較大技術(shù)缺陷。afp是經(jīng)典的肝癌腫瘤標(biāo)記物，但約30％肝癌患者afp水平正常，18％肝癌患者afp低濃度升高，因此特異性、敏感性均不高。而超聲波檢查對(duì)肝癌的檢出率則受到操作者經(jīng)驗(yàn)和設(shè)備質(zhì)量的影響，并且這些檢查通常需要在肝臟上發(fā)現(xiàn)足夠大的腫瘤時(shí)才能檢測(cè)到。因此，目前亟需有一種創(chuàng)新的方法能夠完全替代或輔助以上傳統(tǒng)方法來(lái)進(jìn)行肝癌的篩查以及分期診斷。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，提供一種原發(fā)性肝癌的microrna標(biāo)志物的引物、試劑盒和應(yīng)用，通過(guò)檢測(cè)特定組合microrna標(biāo)志物（mir-323a-5p、mir-2276-5p、mir-4295、mir-2467-3p和mir-921）的含量，來(lái)輔助對(duì)原發(fā)性肝癌進(jìn)行分期診斷，具有無(wú)創(chuàng)，定量精確，敏感性和特異性佳等特點(diǎn)。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

3、第一方面，本發(fā)明提供一種原發(fā)性肝癌的microrna標(biāo)志物在制備檢測(cè)原發(fā)性肝癌試劑或檢測(cè)工具中的應(yīng)用，所述標(biāo)志物為mir-323a-5p、mir-2276-5p、mir-4295、mir-2467-3p和mir-921。

4、優(yōu)選地，所述試劑或檢測(cè)工具通過(guò)檢測(cè)被試者生物樣品中所述標(biāo)志物的含量來(lái)判斷被試者肝癌程度。

5、優(yōu)選地，所述標(biāo)志物來(lái)源于外泌體。

6、優(yōu)選地，所述外泌體來(lái)源于外周血血清或血漿。

7、第二方面，本發(fā)明提供一種檢測(cè)所述microrna標(biāo)志物的引物在制備檢測(cè)原發(fā)性肝癌試劑或檢測(cè)工具中的應(yīng)用。

8、第三方面，本發(fā)明提供一種檢測(cè)原發(fā)性肝癌的microrna標(biāo)志物的反轉(zhuǎn)錄引物和檢測(cè)引物，所述標(biāo)志物為mir-323a-5p、mir-2276-5p、mir-4295、mir-2467-3p和mir-921；

9、所述反轉(zhuǎn)錄引物為：

10、mir-323a-5p的反轉(zhuǎn)錄引物序列(5?'-3?')為seq?id?no.1所示，序列為gtcgtatccagtgccacacgtcctcgaggcttaagcactggatacgacgcgaacgc；

11、mir-2276-5p的反轉(zhuǎn)錄引物序列(5?'-3?')為seq?id?no.2所示，序列為gtcgtatccagtgcgagccgttgagaccgcaagtgcactggatacgaccgtctgcaa；

12、mir-4295的反轉(zhuǎn)錄引物序列(5?'-3?')為seq?id?no.3所示，序列為gtcgtatccagtgcgagccgttgagaccgcaagtgcactggatacgacaaggaaaa；

13、mir-2467-3p的反轉(zhuǎn)錄引物序列(5?'-3?')為seq?id?no.4所示，序列為gtcgtatccagtgccacacgtcctcgaggcttaagcactggatacgaccctgagcc；

14、mir-921的反轉(zhuǎn)錄引物序列(5?'-3?')為seq?id?no.5所示，序列為gtcgtatccagtgcagtgtcagaggtagtcgcactggatacgacgaatcctg；

15、所述檢測(cè)引物為：

16、mir-323a-5p的正向引物序列(5?'-3?')為seq?id?no.6所示，序列為agacaggtggtccgtggc；

17、mir-323a-5p的反向引物序列(5?'-3?')為seq?id?no.7所示，序列為gtatccagtgccacacgtcctc；

18、mir-2276-5p的正向引物序列(5?'-3?')為seq?id?no.8所示，序列為aatgcgccctctgtcacc；

19、mir-2276-5p的反向引物序列(5?'-3?')為seq?id?no.9所示，序列為atccagtgcgagccgttg；

20、mir-4295的正向引物序列(5?'-3?')為seq?id?no.10所示，序列為aagccagtgcaatgt；

21、mir-4295的反向引物序列(5?'-3?')為seq?id?no.11所示，序列為atccagtgcgagccgttg；

22、mir-2467-3p的正向引物序列(5?'-3?')為seq?id?no.12所示，序列為tctatagcagaggcagaga；

23、mir-2467-3p的反向引物序列(5?'-3?')為seq?id?no.13所示，序列為gtatccagtgccacacgtcctc；

24、mir-921的正向引物序列(5?'-3?')為seq?id?no.14所示，序列為attgcctagtgagggacagaac；

25、mir-921的反向引物序列(5?'-3?')為seq?id?no.15所示，序列為cagtgcagtgtcagaggtagtcg。

26、第四方面，本發(fā)明提供一種所述反轉(zhuǎn)錄引物和檢測(cè)引物在制備檢測(cè)原發(fā)性肝癌試劑或檢測(cè)工具中的應(yīng)用。

27、第五方面，本發(fā)明提供一種原發(fā)性肝癌的診斷試劑盒，所述試劑盒包括對(duì)標(biāo)志物mir-323a-5p、mir-2276-5p、mir-4295、mir-2467-3p和mir-921的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)的試劑。

28、優(yōu)選地，所述診斷試劑盒包括所述標(biāo)志物的反轉(zhuǎn)錄引物和檢測(cè)引物，所述反轉(zhuǎn)錄引物為：

29、mir-323a-5p的反轉(zhuǎn)錄引物序列(5?'-3?')為seq?id?no.1所示；

30、mir-2276-5p的反轉(zhuǎn)錄引物序列(5?'-3?')為seq?id?no.2所示；

31、mir-4295的反轉(zhuǎn)錄引物序列(5?'-3?')為seq?id?no.3所示；

32、mir-2467-3p的反轉(zhuǎn)錄引物序列(5?'-3?')為seq?id?no.4所示；

33、mir-921的反轉(zhuǎn)錄引物序列(5?'-3?')為seq?id?no.5所示；

34、所述檢測(cè)引物為：

35、mir-323a-5p的正向引物序列(5?'-3?')為seq?id?no.6所示；

36、mir-323a-5p的反向引物序列(5?'-3?')為seq?id?no.7所示；

37、mir-2276-5p的正向引物序列(5?'-3?')為seq?id?no.8所示；

38、mir-2276-5p的反向引物序列(5?'-3?')為seq?id?no.9所示；

39、mir-4295的正向引物序列(5?'-3?')為seq?id?no.10所示；

40、mir-4295的反向引物序列(5?'-3?')為seq?id?no.11所示；

41、mir-2467-3p的正向引物序列(5?'-3?')為seq?id?no.12所示；

42、mir-2467-3p的反向引物序列(5?'-3?')為seq?id?no.13所示；

43、mir-921的正向引物序列(5?'-3?')為seq?id?no.14所示；

44、mir-921的反向引物序列(5?'-3?')為seq?id?no.15所示。

45、優(yōu)選地，所述診斷試劑盒還包括pcr反應(yīng)試劑。

46、本發(fā)明的有益效果是：

47、本發(fā)明采用mir-323a-5p、mir-2276-5p、mir-4295、mir-2467-3p和mir-921的microrna標(biāo)志物來(lái)對(duì)原發(fā)性肝癌進(jìn)行分期診斷，具有無(wú)創(chuàng)性，該標(biāo)志物易于檢測(cè)，且定量精確，提高了原發(fā)性肝癌診斷的敏感性和特異性。

48、本發(fā)明標(biāo)志物來(lái)源于外周血血清或血漿的外泌體，外泌體內(nèi)的mirna由于外泌體具有磷脂雙層膜結(jié)構(gòu)，這使得mirna不受外界環(huán)境的影響，在檢測(cè)時(shí)具有更好的穩(wěn)定性，因此本發(fā)明在肝癌診斷中具有良好的應(yīng)用前景。

49、本發(fā)明利用mir-323a-5p、mir-2276-5p、mir-4295、mir-2467-3p和mir-921標(biāo)志物的反轉(zhuǎn)錄引物和檢測(cè)引物來(lái)進(jìn)行原發(fā)性肝癌microrna標(biāo)志物含量的檢測(cè)，采用公式即可評(píng)估被試者原發(fā)性肝癌的分期等級(jí)，精確度高，特異性強(qiáng)。

50、本發(fā)明試劑盒基于數(shù)字pcr平臺(tái)的試劑盒，能夠及時(shí)、準(zhǔn)確并特異地輔助診斷肝癌并分期。