本發(fā)明涉及一種熒光探針化合物，尤其涉及一種小分子熒光探針化合物，還涉及上述熒光探針化合物的制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、p2y14受體（p2y14r）已被證明是先天免疫炎癥性疾病的潛在靶點(diǎn)，如炎癥性腸病、糖尿病、囊性纖維化、腎無菌性炎癥、急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎和過敏性疾病，是gpcr家族中重要的藥物靶標(biāo)。p2y14受體拮抗劑目前僅僅報(bào)道了幾種結(jié)構(gòu)類型的化合物（嘧啶并哌啶類、2-萘酸類、3-取代苯甲酸類和吡唑-3-羧酸類），但還都在臨床前研究階段。其中活性和選擇性最高的為2-萘酸類，然而目前報(bào)道的2-萘酸類結(jié)構(gòu)的拮抗劑存在溶解性差、口服生物利用度低、合成純化難度大等缺陷，對(duì)進(jìn)一步討論構(gòu)效關(guān)系及生物學(xué)評(píng)價(jià)帶來了較大的困難。因此尋找結(jié)構(gòu)更加多樣，活性更強(qiáng)的p2y14r拮抗劑仍然需要被開發(fā)。

2、為了尋找新型的p2y14r拮抗劑，研究者們建立了一些篩選方法。例如在細(xì)胞水平上進(jìn)行的下游信號(hào)camp的含量測(cè)試。但是細(xì)胞水平的篩選實(shí)驗(yàn)存在著影響因素多，篩選周期長(zhǎng)等缺點(diǎn)，難以實(shí)現(xiàn)化合物的快速大量篩選。然而，放射性配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)又存在安全和高成本兩個(gè)問題。因此，需要開發(fā)一種新的測(cè)試方法用于高通量篩選p2y14r配體。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、發(fā)明目的：本發(fā)明的目的是提供一種小分子熒光探針化合物，還提供上述化合物的制備方法及其在靶向p2y14r藥物的高通量篩選方面的應(yīng)用。

2、技術(shù)方案：本發(fā)明公開了一種p2y14r小分子熒光探針化合物，所述化合物為p2y14r小分子熒光探針化合物，結(jié)構(gòu)如式i所示：

3、。

4、上述化合物的制備方法，包括以下步驟：

5、（1）將化合物t1通過脫保護(hù)反應(yīng)，后與n-boc-γ-氨基丁酸進(jìn)行酰胺縮合反應(yīng)，得中間體t2；

6、（2）將中間體t2通過脫保護(hù)反應(yīng)，后與n-(叔丁氧羰基)-5-氨基戊酸進(jìn)行酰胺縮合反應(yīng)，得中間體t3；

7、（3）將中間體t3通過脫保護(hù)反應(yīng)，得到中間體t4；

8、（4）將中間體t4與與異硫氰酸熒光素fitc進(jìn)行親核加成反應(yīng)，即得式i所示的化合物；反應(yīng)通式如下：

9、。

10、其中，步驟（1）中，所述化合物t1和n-boc-γ-氨基丁酸的摩爾比為1:1～1:2，所述反應(yīng)的溫度為室溫，反應(yīng)時(shí)間為12～24h。

11、其中，步驟（1）和（2）中，所述酰胺縮合反應(yīng)，采用的縮合劑為edci、hoat、hatu或bop中的一種或幾種，堿為dipea或tea中的一種或兩種，有機(jī)溶劑為四氫呋喃、乙腈、n，n-二甲基甲酰胺或二甲亞砜中的一種或幾種。

12、其中，步驟（2）中，所述脫保護(hù)反應(yīng)試劑為三氟乙酸或氯化氫乙酸乙酯溶液；所述化合物t2和n-(叔丁氧羰基)-5-氨基戊酸的摩爾比為1:1～1:2；所述反應(yīng)的溫度為室溫，反應(yīng)時(shí)間為12～24h。

13、其中，步驟（3）中，所述脫保護(hù)反應(yīng)，采用的堿為氫氧化鈉、氫氧化鉀或氫氧化鋰中的一種或幾種，溶劑為水、四氫呋喃、甲醇或乙醇中的兩種或幾種；所述反應(yīng)的溫度為室溫，反應(yīng)時(shí)間為4-24h。

14、其中，步驟（4）中，所述親核加成反應(yīng)，采用的溶劑為四氫呋喃、1，4-二氧六環(huán)或n,n-二甲基甲酰胺中的一種或幾種，堿為dipea或tea中的一種或兩種；所述反應(yīng)的溫度為室溫，反應(yīng)時(shí)間為12-24h。

15、其中，步驟（4）中，所述化合物t4和異硫氰酸熒光素的摩爾比為1:1～1:2。

16、上述的化合物作為熒光偏振探針在p2y14r配體篩選中的應(yīng)用。

17、其中，所述應(yīng)用，具體為：將本發(fā)明的化合物、p2y14r蛋白和待測(cè)化合物混合得到混合物；利用熒光偏振技術(shù)測(cè)定混合物的偏振值，根據(jù)偏振值確認(rèn)待測(cè)化合物為p2y14r的配體；一般情況下，偏振值降低大于檢測(cè)窗的25％即可判定其為p2y14r的配體。

18、發(fā)明原理：本發(fā)明的p2y14r小分子熒光探針化合物，是基于已報(bào)道的高活性和高選擇性的p2y14r受體拮抗劑pptn。通過對(duì)pptn進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)其主要由四個(gè)部分組成，分別是與氫鍵網(wǎng)絡(luò)結(jié)合的羧基，與疏水口袋結(jié)合的4-三氟甲基苯基，指向胞外溶劑化區(qū)的苯連哌啶基團(tuán)以及保持以上三者合適空間取向的萘環(huán)連接環(huán)。因此，指向胞外的苯連哌啶是一個(gè)非常合適連接位點(diǎn)，用于連接熒光素，而不影響其整體與p2y14r蛋白的結(jié)合。

19、有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下顯著優(yōu)點(diǎn)：（1）本發(fā)明的p2y14r小分子熒光探針化合物具有熒光特性，對(duì)p2y14r蛋白有較好的特異性結(jié)合；（2）將該化合物作為熒光偏振探針，采用熒光偏振技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)p2y14r配體的篩選及配體親和力水平的評(píng)價(jià)；通過熒光偏振建立的一種p2y14r配體高通量篩選方案可以用于藥物的高通量篩選，具有廉價(jià)，穩(wěn)定，快速，高效等特點(diǎn)。

技術(shù)特征：

1.一種小分子熒光探針化合物，其特征在于，所述化合物為p2y14r小分子熒光探針，結(jié)構(gòu)如式i所示：

2.一種權(quán)利要求1所述化合物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟（1）中，所述化合物t1和n-boc-γ-氨基丁酸的摩爾比為1:1～1:2。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟（1）和（2）中，所述酰胺縮合反應(yīng)，采用的縮合劑為edci、hoat、hatu或bop中的一種或幾種，堿為dipea或tea中的一種或兩種，有機(jī)溶劑為四氫呋喃、乙腈、n，n-二甲基甲酰胺或二甲亞砜中的一種或幾種。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟（2）中，所述化合物t2和n-(叔丁氧羰基)-5-氨基戊酸的摩爾比為1:1～1:2。

6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟（3）中，所述脫保護(hù)反應(yīng)，采用的堿為氫氧化鈉、氫氧化鉀或氫氧化鋰中的一種或幾種，溶劑為水、四氫呋喃、甲醇或乙醇中的兩種或幾種。

7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟（4）中，所述親核加成反應(yīng)，采用的溶劑為四氫呋喃、1，4-二氧六環(huán)或n,n-二甲基甲酰胺中的一種或幾種，堿為dipea或tea中的一種或兩種。

8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟（4）中，所述化合物t4和異硫氰酸熒光素的摩爾比為1:1～1:2。

9.一種權(quán)利要求1所述的小分子熒光探針化合物作為熒光偏振探針在p2y14r配體篩選中的應(yīng)用。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用，具體為：將權(quán)利要求1所述的化合物、p2y14r蛋白和待測(cè)化合物混合得到混合物；利用熒光偏振技術(shù)測(cè)定混合物的偏振值，根據(jù)偏振值確認(rèn)待測(cè)化合物為p2y14r的配體。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種小分子熒光探針化合物及其制備方法與應(yīng)用，所述化合物為P2Y<subgt;14</subgt;R小分子熒光探針，具有熒光特性，對(duì)P2Y<subgt;14</subgt;R有較好的特異性結(jié)合，將該化合物作為熒光偏振探針，通過競(jìng)爭(zhēng)的方法，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)P2Y<subgt;14</subgt;R配體的篩選及配體親和力水平的評(píng)價(jià)，應(yīng)用于篩選方法中為后續(xù)靶向P2Y<subgt;14</subgt;R藥物的高通量篩選提供了基礎(chǔ)。

技術(shù)研發(fā)人員：王雨杭,江程,張汶杰,曾春燕,王子涵,張依涵,王平平,陸冉
受保護(hù)的技術(shù)使用者：中國藥科大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/19