本發(fā)明屬于生物，具體涉及一種過表達(dá) irf5的質(zhì)粒及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、干擾素調(diào)節(jié)因子irf是一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，能與 ifns基因啟動子及干擾素刺激基因中特異的dna片段相結(jié)合，調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。 irf在先天性免疫和適應(yīng)性免疫調(diào)控、抗病毒感染、細(xì)胞增殖、凋亡等方面發(fā)揮重要的生物學(xué)效應(yīng)。干擾素調(diào)節(jié)因子5， irf5基因在多種自身免疫性疾病例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎性腸病、紅斑狼瘡以及多發(fā)性硬化癥等疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。

2、 irf5的主要功能包括：1.參與抗病毒免疫反應(yīng)， irf5在抗病毒免疫中發(fā)揮核心作用，特別是在通過i型干擾素的產(chǎn)生來啟動先天免疫反應(yīng)。2.炎癥反應(yīng)調(diào)控， irf5促進腫瘤壞死因子α、白介素6和白介素12等促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，其中，腫瘤壞死因子α對應(yīng)英文tnf-α，白介素6對應(yīng)英文il-6，白介素12對應(yīng)英文il-12；這些細(xì)胞因子對于啟動和維持炎癥反應(yīng)、吸引和激活免疫細(xì)胞至感染部位至關(guān)重要；同時 irf5對于巨噬細(xì)胞向促炎癥方向極化具有重要調(diào)節(jié)作用， irf5可以在巨噬細(xì)胞中調(diào)控其極化為促炎的m1型巨噬細(xì)胞。這種類型的巨噬細(xì)胞能夠殺滅病原體并釋放大量的促炎因子，是抗感染免疫的重要組成部分。 irf5還與多種自身免疫性疾病的發(fā)生有關(guān)，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，其中，系統(tǒng)性紅斑狼瘡對應(yīng)英文systemic?lupus?erythematosus，sle、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎對應(yīng)英文rheumatic?arthritis，ra。3.? irf5也參與了腫瘤免疫監(jiān)視，能夠調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)對腫瘤細(xì)胞的識別和清除。鑒于 irf5在多種免疫和炎癥相關(guān)疾病中的關(guān)鍵作用，它被認(rèn)為是治療這些疾病的潛在靶點。

3、為了研究 irf5在免疫系統(tǒng)中的功能，科學(xué)家們開發(fā)了各種 irf5的轉(zhuǎn)基因動物模型，尤其是常用的小鼠模型。 irf5轉(zhuǎn)基因小鼠和基因敲除小鼠均已出現(xiàn)，用于研究病毒感染、自身免疫病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腫瘤免疫等。盡管小鼠的免疫系統(tǒng)與人類相似，但在一些細(xì)胞因子、受體和免疫信號傳導(dǎo)通路上存在種屬差異。因此，在小鼠中獲得的結(jié)果并不總是能直接推廣到人類。有時 irf5過度表達(dá)的轉(zhuǎn)基因模型可能導(dǎo)致不自然的免疫反應(yīng)過度活躍，從而產(chǎn)生與自然條件下不一致的病理現(xiàn)象，限制其生理相關(guān)性。大鼠相比小鼠在某些生理功能、藥物代謝、免疫反應(yīng)等方面更接近人類，適合作為某些疾病的模型。但與小鼠相比，大鼠的基因操作相對困難，且成本更高。因此， irf5轉(zhuǎn)基因大鼠模型較少且難以開發(fā)。同時大鼠的轉(zhuǎn)基因資源不如小鼠豐富，很多分子工具和方法也不如小鼠模型成熟，制約了 irf5相關(guān)領(lǐng)域的研究。

4、目前最常用的模式動物有大鼠、小鼠和斑馬魚，現(xiàn)有方法制備的過表達(dá) irf5體系多適用于小鼠，但小鼠不能很好地模擬人類炎癥疾??；而與人類免疫系統(tǒng)更相似的大鼠，其過表達(dá) irf5體系尚不成熟。因此，急需提供一種用于在斑馬魚中過表達(dá) irf5體系的新方法。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種過表達(dá) irf5的質(zhì)粒及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，提出了一種可用于在斑馬魚中過表達(dá) irf5的新方法。

2、本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是，本發(fā)明提供了一種用于在斑馬魚中過表達(dá) irf5的質(zhì)粒的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

3、合成核苷酸序列如seq?id?no.1和seq?id?no.2所示的引物，以空載體為模板，反向pcr制備第一線性化空載體，所述空載體為tol2-ef1α-egfp-pa。合成核苷酸序列如seqid?no.3和seq?id?no.4所示的引物，以野生型斑馬魚cdna為模板，擴增 irf5基因，獲得第一目的基因產(chǎn)物。合成核苷酸序列如seq?id?no.5和seq?id?no.6所示的引物，以第一目的基因產(chǎn)物為模板，通過pcr在第一目的基因產(chǎn)物兩端添加同源臂，得到同源臂產(chǎn)物。將同源臂產(chǎn)物與第一線性化空載體進行同源重組，獲得第一同源重組產(chǎn)物，同源臂產(chǎn)物與第一線性化空載體的摩爾比為3：1。合成核苷酸序列如seq?id?no.7和seq?id?no.8所示的引物，以第一同源重組產(chǎn)物為模板，pcr擴增獲得帶啟動子的 irf5基因產(chǎn)物，制備第二目的基因產(chǎn)物。合成核苷酸序列如seq?id?no.9和seq?id?no.10所示的引物，以空載體為模板，反向pcr制備第二線性化空載體，所述空載體為tol2-ef1α-egfp-pa。將第二目的基因產(chǎn)物與第二線性化空載體進行同源重組，獲得用于在斑馬魚中過表達(dá) irf5的質(zhì)粒，第二目的基因產(chǎn)物與第二線性化空載體的摩爾比為3：1。

4、本發(fā)明提供了一種利用上述的構(gòu)建方法制備的用于在斑馬魚中過表達(dá) irf5的質(zhì)粒。

5、本發(fā)明還提供了一種所述用于在斑馬魚中過表達(dá) irf5的質(zhì)粒在培育過表達(dá) irf5的轉(zhuǎn)基因斑馬魚中的應(yīng)用。

6、所述用于在斑馬魚中過表達(dá) irf5的質(zhì)粒用于培育過表達(dá) irf5的轉(zhuǎn)基因斑馬魚，步驟如下：

7、將所述過表達(dá) irf5質(zhì)粒與tol2轉(zhuǎn)座酶mrna按質(zhì)量比1：1混合后導(dǎo)入斑馬魚的受精卵中，篩選鑒定受精卵，雜交純化，所得斑馬魚為過表達(dá) irf5的斑馬魚。

8、優(yōu)選地，所述受精卵的細(xì)胞期為1細(xì)胞期~4細(xì)胞期。

9、優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)基因斑馬魚用于篩選預(yù)防或治療病毒感染的藥物。

10、優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)基因斑馬魚用于篩選預(yù)防或治療免疫系統(tǒng)疾病的藥物。

11、優(yōu)選地，所述免疫系統(tǒng)疾病為系統(tǒng)性紅斑狼瘡或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。

12、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提供了一種用于在斑馬魚中過表達(dá) irf5的質(zhì)粒的構(gòu)建方法，包括以下步驟：合成核苷酸序列如seq?id?no.1和seq?id?no.2所示的引物，以空載體為模板，反向pcr制備第一線性化空載體，所述空載體為tol2-ef1α-egfp-pa；合成核苷酸序列如seq?id?no.3和seq?id?no.4所示的引物，以野生型斑馬魚cdna為模板，擴增 irf5基因，獲得第一目的基因產(chǎn)物；合成核苷酸序列如seq?id?no.5和seq?idno.6所示的引物，以第一目的基因產(chǎn)物為模板，通過pcr在第一目的基因產(chǎn)物兩端添加同源臂，得到同源臂產(chǎn)物；將同源臂產(chǎn)物與第一線性化空載體進行同源重組，獲得第一同源重組產(chǎn)物，同源臂產(chǎn)物與第一線性化空載體的摩爾比為3：1；合成核苷酸序列如seq?id?no.7和seq?id?no.8所示的引物，以第一同源重組產(chǎn)物為模板，pcr擴增獲得帶啟動子的 irf5基因產(chǎn)物，制備第二目的基因產(chǎn)物；合成核苷酸序列如seq?id?no.9和seq?id?no.10所示的引物，以空載體為模板，反向pcr制備第二線性化空載體，所述空載體為tol2-ef1α-egfp-pa；將第二目的基因產(chǎn)物與第二線性化空載體進行同源重組，獲得用于在斑馬魚中過表達(dá) irf5的質(zhì)粒，第二目的基因產(chǎn)物與第二線性化空載體的摩爾比為3：1。本發(fā)明通過同源重組的方法將 irf5克隆進載體，通過本發(fā)明所述方法構(gòu)建的重組載體可用于培育過表達(dá) irf5的斑馬魚。

13、現(xiàn)有技術(shù)中用于培育過表達(dá) irf5的動物模型，往往耗時長、操作難、成本高且成功率低。通過本發(fā)明所述方法制備的過表達(dá) irf5動物模型具有構(gòu)建時間短，構(gòu)建成本低，成功率比大小鼠更大的優(yōu)勢。