本發(fā)明涉及基因檢測，更具體地說，它涉及一種檢測mthfr基因多態(tài)性的試劑盒及檢測方法。

背景技術：

1、mthfr（5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶）基因是人體內的一個重要基因，位于1號染色體1p36.3位置，其編碼的酶在葉酸代謝和dna甲基化過程中起著關鍵作用；c677t（rs1801133）位點是臨床上研究最多的mthfr單核苷酸多態(tài)性位點，其多態(tài)性會影響mthfr酶的活性，進而影響葉酸代謝和同型半胱氨酸水平。

2、既往研究表明mthfr-c677t突變在全球范圍內廣泛存在，不同人種和地區(qū)的攜帶率有所不同，歐洲和亞洲人群中c677t突變較為常見；中國漢族人群中，mthfr-c677t位點的基因型分布為：正常型（cc）占多數，雜合突變型（ct）次之，純合突變型（tt）相對較少，但具體比例可能因研究樣本和地區(qū)差異而有所不同。

3、近年來分子生物學技術發(fā)展迅速，pcr擴增技術應用廣泛，該技術靈敏度高，特異性好，具有良好的臨床應用前景，尤其在基因多態(tài)性檢測方面具有優(yōu)勢；mthfr基因多態(tài)性常用的檢測方法有：pcr-基因芯片法、pcr-熒光探針法、pcr-熔解曲線法和pcr-電泳分析法；我國已有多個mthfr基因多態(tài)性檢測試劑獲得批準上市，部分產品還處于在審狀態(tài)；目前已批準產品的方法學以pcr-熒光探針法為主。

4、隨著分子生物學技術得快速發(fā)展，目前已有多種方法用于snp檢測；比如pcr-基因芯片法、pcr-熒光探針法、pcr-熔解曲線法和pcr-電泳分析法，這些方法中其中pcr-熒光探針法是目前市面上最常用的檢測方法，但是大多需要提取dna，然后通過pcr擴增后進行基因分型，導致檢測時間延長，檢測時效性和成本相應提高；目前暫無針對snp分型檢測的快速、便捷、經濟的全分型基因檢測試劑盒；而且大部分試劑盒樣本類型是人類外周血dna，導致樣本存在一定的采集難度；鑒于以上所述現有技術的缺點，針對現有檢測方法或缺乏便捷性、時效性、經濟性或無法滿足snp基因分型檢測要求的現狀，亟需一款能運用于基層檢測甚至居家檢測，快速、準確、便捷、經濟且覆蓋全面的檢測方法。

技術實現思路

1、針對現有技術存在的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種檢測mthfr基因多態(tài)性的試劑盒，不僅具有快速便捷的技術效果，且檢測結果準確可靠。

2、本發(fā)明的上述技術目的是通過以下技術方案得以實現的：一種檢測mthfr基因多態(tài)性的試劑盒，包括：

3、組分1：用于檢測mthfr基因c677t位點基因多態(tài)性的引物和探針；

4、組分2：用于檢測內參β-globin的引物和探針；

5、其特征在于：所述組分1包括核苷酸序列如seq?id?no.1所示的c677t上游引物，以及核苷酸序列如seq?id?no.2所示的c677t下游引物；

6、c677t探針1序列5'端標記有fam熒光基團，3'端標記有mgb淬滅熒光基團，c677t探針1的核苷酸序列如seq?id?no.3所示；

7、c677t探針2序列5'端標記有vic熒光基團，3'端標記有mgb淬滅熒光基團，c677t探針2的核苷酸序列如seq?id?no.4所示；

8、組分2包括核苷酸序列如seq?id?no.5所示的β-globin上游引物，以及核苷酸序列如seq?id?no.6所示的β-globin下游引物；

9、β-globin探針序列5'端標記有rox熒光基團，3'端標記有mgb淬滅熒光基團，β-globin探針的核苷酸序列如seq?id?no.7所示。

10、通過采用上述技術方案，試劑盒所運用的引物和探針組合，能夠采用的拭子直擴結合熒光pcr法，完成mthfr-c677t位點的cc基因型、ct基因型以及tt基因型的三種基因分型的檢測，不僅具有快速便捷的技術效果，且檢測結果準確；同時該試劑盒設計了引物與雙探針組合的檢測方法，其中含有內參β-globin的檢測引物和探針，以此對樣本采集、樣本的處理和pcr檢測進行有效質控，進一步提高了檢測結果的可靠性。

11、本發(fā)明進一步設置為：還包括擴增酶，所述擴增酶用于擴增口腔拭子內核酸，并參與熒光pcr反應程序。

12、本發(fā)明進一步設置為：擴增所述c677t上游引物和c677t下游引物的終濃度為0.4μmol/l；檢測所述c677t探針1和c677t探針2的終濃度為0.1μmol/l。

13、本發(fā)明進一步設置為：擴增所述β-globin上游引物和β-globin下游引物的終濃度為0.2μmol/l，檢測所述β-globin探針的終濃度為0.05μmol/l。

14、本發(fā)明進一步設置為：試劑盒內液體試劑通過凍干程序經原位凍干制成試劑凍干粉末。

15、本發(fā)明進一步設置為：還包括陽性對照品a1管以及空白對照品b1管；

16、所述陽性對照品是mthfr基因c677t位點雜合天然細胞系；空白對照品為無酶水；

17、所述陽性對照品a1管內液體試劑通過凍干程序經原位凍干制成相應的質控品陽性對照粉末；

18、所述空白對照品b1管內液體通過凍干程序經原位凍干制成相應的質控品空白對照粉末。

19、針對現有技術存在的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種檢測mthfr基因多態(tài)性的試劑盒的使用方法，切實滿足了基層檢測的運用需求。

20、本發(fā)明的上述技術目的是通過以下技術方案得以實現的：一種檢測mthfr基因多態(tài)性的試劑盒的使用方法，其特征在于：包括如下步驟：

21、s1.獲取待測口腔拭子樣本，置于樣本處理液內，使得口腔粘膜細胞釋放核酸，制成拭子液作為擴增模板；

22、s2.將配置好的組分1、組分2以及dna聚合酶mix充分混勻，將液體試劑通過凍干程序經原位凍干制成多份試劑凍干粉末；

23、s4.將s1制得的擴增模板，取25μl直接投入到s2所配置的一份試劑凍干粉末中進行溶解，并將溶液轉移到反應管中進行擴增，通過ct值進行結果判斷。

24、通過采用上述技術方案，在具備快速、便捷、準確、可靠的前提下，通過對試劑進行凍干處理，有效降低了試劑的倉儲運輸難度，切實滿足了基層檢測的運用需求。

25、本發(fā)明進一步設置為：所述擴增程序為95℃預變性2分鐘，1次循環(huán)；95℃變性10秒，60℃退火20秒，交替40次循環(huán)。

26、針對現有技術存在的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種檢測mthfr基因多態(tài)性的試劑盒的使用方法，實現了對試劑自身質量的檢測，以及對試劑是否遭受污染進行了檢測，從而確保試劑的實際檢測效力。

27、本發(fā)明的上述技術目的是通過以下技術方案得以實現的：一種檢測mthfr基因多態(tài)性的試劑盒的質控方法，其特征在于：包括以下步驟：

28、s2.將配置好的組分1、組分2以及dna聚合酶mix充分混勻，將液體試劑通過凍干程序經原位凍干制成多份試劑凍干粉末；

29、s3.用25μl無酶水對質控品陽性對照粉末進行溶解，再取用一份s2中所配置的試劑凍干粉末進行溶解，轉移到對應的反應管，標記為b1管，并進行擴增；用25μl無酶水對質控品空白對照粉末進行溶解，再取用一份s2中所配置的試劑凍干粉末進行溶解，轉移到對應的反應管，標記為b2管，并進行擴增；通過ct值判斷質控結果。

30、通過采用上述技術方案，實現了對試劑自身質量的檢測，以及對試劑是否遭受污染進行了檢測，從而確保試劑的實際檢測效力。

31、本發(fā)明進一步設置為：所述質控結果判斷：s3中配置的b1管標記為陽性對照管，于fam、vic和rox三個通道呈典型的s型曲線且ct（fam）≤37、ct（vic）≤37、ct（rox）≤37則認為試劑合格；b2管標記為空白對照管，四個通道均無ct值則認為試劑無污染，試劑結果可信。

32、綜上所述，本發(fā)明具有以下有益效果：1、準確：本發(fā)明采用的拭子直擴結合熒光pcr法完成的60例樣本與sanger測序完成的60例樣本經過比對，結果完全一致；

33、2、省時：本發(fā)明從樣本采集到出具結果最短僅需40min，熒光pcr法約3h，sanger測序約9h，相比之下，本發(fā)明可節(jié)省大量時間；

34、3、降低成本：本發(fā)明省略了dna提取的步驟，在節(jié)省時間的同時也降低了相應的成本。同時本發(fā)明操作簡單，結果快速準確，節(jié)省大量人力成本。