本發(fā)明屬于現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)，具體涉及一種一種檢測榴蓮根腐病棕櫚疫霉菌的試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、由棕櫚疫霉菌（ phytophthora?palmivora）侵染引起的榴蓮根腐病是我國及泰國、緬甸、越南和馬來西亞等榴蓮產(chǎn)地發(fā)生最嚴(yán)重的病害，制約榴蓮產(chǎn)業(yè)的蓬勃發(fā)展。該病原菌寄主范圍廣泛，并能在榴蓮植物的不同部位引起疾病。病原菌的田間快速檢測是有效預(yù)防病害發(fā)生的關(guān)鍵手段，當(dāng)前對于引起榴蓮根腐病的棕櫚疫霉菌的診斷主要通過癥狀觀察、病原菌分離鑒定和基于pcr的常規(guī)方法。這些方法耗時(shí)長且容易導(dǎo)致延遲診斷；對于緩慢生長的病原菌可能漏檢；存在交叉反應(yīng)和假陽性問題。此外，傳統(tǒng)技術(shù)通常需要專業(yè)人員操作，且對設(shè)備設(shè)施要求較高，增加了成本和復(fù)雜性。因此，亟需探索和發(fā)展更快速、準(zhǔn)確、簡便的棕櫚疫霉菌檢測方法。

2、目前，傳統(tǒng)的植物病害鑒定方法包括病原菌的分離、培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)鑒定，同時(shí)進(jìn)行病原菌的致病性驗(yàn)證，最終結(jié)合分類資料確定病原菌的分類和地位。這種方法雖然是病原菌鑒定的基礎(chǔ)，但易受操作者技能和經(jīng)驗(yàn)、人為因素以及環(huán)境影響，耗時(shí)且無法滿足快速檢測的需求。

3、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase?chain?reaction，pcr）于1983年由mullis提出，這種方法迅速促進(jìn)了許多科學(xué)領(lǐng)域和診斷學(xué)領(lǐng)域的重大進(jìn)展。該方法是在受控條件下反復(fù)加熱和冷卻樣品，通過耐熱性dna聚合酶擴(kuò)增dna。在此基礎(chǔ)上形成了實(shí)時(shí)熒光定量pcr等一些列新方法，由于其良好的特異性和可操作性而在病原菌的鑒定及檢測中發(fā)揮重要作用。但基于pcr的技術(shù)對高精度熱循環(huán)器的要求使得這種強(qiáng)大的方法無法被廣泛應(yīng)用于田間現(xiàn)場檢測。

4、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated?isthermal?amplification，lamp）由notomi及其同事于2000年開發(fā)，該方法依賴于具有高鏈置換活性的dna聚合酶和一套特殊設(shè)計(jì)的兩個(gè)內(nèi)部和兩個(gè)外引物進(jìn)行的自動(dòng)循環(huán)鏈置換dna合成，允許在1小時(shí)內(nèi)快速準(zhǔn)確地對病原物進(jìn)行診斷。由于其只需常規(guī)的水浴鍋等設(shè)備，且操作簡單、快速、靈敏而在細(xì)菌、真菌、病毒等病原物的檢測中廣泛應(yīng)用。

5、綜上所述，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，越來越多分子檢測相關(guān)技術(shù)被挖掘、優(yōu)化并應(yīng)用到病原物的檢測當(dāng)中，但他們也同樣存在著自身的局限性。病原菌分離鑒定的傳統(tǒng)方法通常耗時(shí)且繁瑣，需要復(fù)雜的培養(yǎng)條件和設(shè)備。此外，傳統(tǒng)方法在某些情況下可能出現(xiàn)誤判，導(dǎo)致結(jié)果不夠準(zhǔn)確和可靠。pcr技術(shù)雖然應(yīng)用范圍較廣，但其對溫控設(shè)備的依賴程度高，操作耗時(shí)長，專業(yè)性強(qiáng)，難以應(yīng)用于現(xiàn)場檢測。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（lamp）靈敏度高、特異性強(qiáng)，但其引物設(shè)計(jì)及試劑添加繁瑣、操作復(fù)雜，所需溫度較高，易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增等特點(diǎn)而影響檢測結(jié)果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明第一方面的目的，在于提供一種檢測榴蓮根腐病棕櫚疫霉菌的試劑。

2、本發(fā)明第二方面的目的，在于提供一種檢測榴蓮根腐病棕櫚疫霉菌的試劑盒。

3、本發(fā)明第三方面的目的，在于提供一種應(yīng)用。

4、本發(fā)明第四方面的目的，在于提供一種基于rpa結(jié)合crispr/cas12a的榴蓮根腐病棕櫚疫霉菌的檢測方法。

5、為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明上述的目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：

6、本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供一種檢測榴蓮根腐病棕櫚疫霉菌的試劑，所述試劑包括檢測榴蓮根腐病棕櫚疫霉菌基因組的引物對和/或檢測榴蓮根腐病棕櫚疫霉菌的crrna；

7、所述引物對為rpa-f/rpa-r，核苷酸序列如下：

8、rpa-f：5’-ccagagggtacaaacgaaatcggcgctacg-3’；

9、rpa-r：5’-cctaccggtatgcctcgtgatcattgg-3’；

10、所述crrna包括crrna1和crrna2，核苷酸序列分別如seq?id?no:4和seq?id?no:5所示。

11、在本發(fā)明的第一個(gè)方面中，所述引物對基于棕櫚疫霉菌特異序列>nckw01006925進(jìn)行設(shè)計(jì)。

12、本發(fā)明的第二個(gè)方面，提供一種檢測榴蓮根腐病棕櫚疫霉菌的試劑盒，包含本發(fā)明第一個(gè)方面所述的試劑。

13、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述試劑盒還包括ssdna熒光探針和cas蛋白。

14、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述cas蛋白選自mb4cas12a、fncas12a、lbcas12a或dlbcas12a中的至少一種。

15、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述ssdna熒光探針的兩端分別修飾熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)。

16、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述熒光基團(tuán)選自fam、cy5、htx、rox、vic、tamra和hex中的任一種。

17、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述淬滅基團(tuán)選自bhq1、bhq2和bhq3中的任一種。

18、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述試劑盒中還包括rpa反應(yīng)液和crispr/cas12a緩沖液。

19、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述crispr/cas12a緩沖液為10?×nebuffertmr2.1。

20、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述試劑盒還包括陽性對照和陰性對照。

21、本發(fā)明的第三個(gè)方面，提供本發(fā)明第一個(gè)方面所述試劑、和/或本發(fā)明第二個(gè)方面所述試劑盒在1）~2）中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用：

22、1）榴蓮根腐病棕櫚疫霉菌的檢測；

23、2）制備檢測榴蓮根腐病棕櫚疫霉菌的產(chǎn)品。

24、本發(fā)明的第四個(gè)方面，提供一種基于rpa結(jié)合crispr/cas12a的榴蓮根腐病棕櫚疫霉菌的檢測方法，包括采用本發(fā)明第一方面的試劑和/或本發(fā)明第二方面的試劑盒的步驟。

25、在本發(fā)明一些實(shí)施方式中，所述檢測方法具體包括以下步驟：

26、（1）提取待測樣本的核酸；

27、（2）將引物對與步驟（1）中的核酸混合，進(jìn)行rpa擴(kuò)增，得到rpa擴(kuò)增產(chǎn)物；

28、（3）將步驟（2）所述的rpa擴(kuò)增產(chǎn)物與crrna、cas蛋白、ssdna熒光探針混合，進(jìn)行crispr反應(yīng)，讀取檢測信號；

29、（4）根據(jù)檢測信號判定待測樣本是否含有榴蓮根腐病棕櫚疫霉菌。

30、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述rpa擴(kuò)增條件為37～42℃，反應(yīng)5～30分鐘。

31、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述crrna和cas12a的濃度均為200～1000?nm。

32、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述ssdna熒光探針的濃度為1～100?μm。

33、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述crrna1和crrna2的摩爾比例為（1~3）：（1~3）。

34、在本項(xiàng)發(fā)明實(shí)施過程中，所述檢測方法步驟如下：

35、（1）將rpa反應(yīng)體系和待檢樣本基因組dna混勻后放入反應(yīng)管底部，crispr/cas12a反應(yīng)體系混勻后放入所述反應(yīng)管蓋中，然后將所述管底置于恒溫?cái)U(kuò)增裝置中進(jìn)行目的片段的rpa擴(kuò)增；所述目的片段包括如seq?id?no:1所示的核苷酸序列。

36、（2）所述rpa擴(kuò)增結(jié)束后，將所述反應(yīng)管蓋中的crispr/cas12a體系加入反應(yīng)管中，混勻。

37、（3）可視化檢測步驟（2）中反應(yīng)液的熒光強(qiáng)度。

38、若所述反應(yīng)管發(fā)出熒光，表明所述待檢樣本中存在榴蓮根腐病棕櫚疫霉菌；若所述反應(yīng)管中未發(fā)出熒光，表明所述待檢樣本中不存在榴蓮根腐病棕櫚疫霉菌。

39、在本項(xiàng)發(fā)明實(shí)施過程中，可視化檢測（2）中反應(yīng)管熒光強(qiáng)度包括：

40、將反應(yīng)管置于38℃恒溫裝置中進(jìn)行rpa反應(yīng)15分鐘，然后將管蓋上的crispr/cas12a反應(yīng)液離心至管底繼續(xù)反應(yīng)20分鐘，期間每間隔30秒采集一次fam熒光；或者在38℃恒溫裝置中反應(yīng)20分鐘后，肉眼觀察反應(yīng)管在藍(lán)光照射下是否出現(xiàn)熒光。

41、本發(fā)明開發(fā)了一種榴蓮根腐病棕櫚疫霉菌的快速可視化檢測試劑和試劑盒，具有如下有益效果：

42、（1）本項(xiàng)發(fā)明是通過對榴蓮根腐病棕櫚疫霉菌、大豆疫霉菌、致病疫霉菌等病原卵菌和稻瘟病菌、禾谷鐮刀菌等病原真菌的全基因組序列進(jìn)行系統(tǒng)比對和篩選獲得榴蓮根腐病棕櫚疫霉菌特異序列>nckw01006925，且該序列尚屬于未知功能的區(qū)域，迄今為止未在檢測技術(shù)及相關(guān)文獻(xiàn)中得到應(yīng)用。該序列的發(fā)現(xiàn)實(shí)現(xiàn)了對于榴蓮根腐病棕櫚疫霉菌的特異性檢測。

43、（2）本項(xiàng)發(fā)明利用棕櫚疫霉菌特異序列>nckw01006925設(shè)計(jì)并篩選crispr/cas12a系統(tǒng)的crrna，并根據(jù)該crrna的結(jié)合位點(diǎn)設(shè)計(jì)并篩選特異性rpa引物，以實(shí)現(xiàn)rpa特異性靶基因擴(kuò)增及棕櫚疫霉菌的特異性檢測。

44、（3）本項(xiàng)發(fā)明創(chuàng)新性利用兩條crrna序列進(jìn)行檢測，其檢測靈敏度比一條crrna高一個(gè)數(shù)量級，大大提高檢測的靈敏性及準(zhǔn)確率。

45、（4）本項(xiàng)發(fā)明的試劑用于檢測榴蓮根腐病棕櫚疫霉菌，其中包含引物對和crrna。該引物對可用于rpa等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，以便準(zhǔn)確、快速且特異地對榴蓮根腐病棕櫚疫霉菌進(jìn)行檢測；crrna可與榴蓮根腐病棕櫚疫霉菌特異片段形成互補(bǔ)雙鏈而不會(huì)與其他卵菌、疫霉菌及真菌序列發(fā)生交叉反應(yīng)，從而提高了對榴蓮根腐病棕櫚疫霉菌的檢測特異性。

46、本項(xiàng)發(fā)明將rpa系統(tǒng)與crispr/cas12a系統(tǒng)相結(jié)合，創(chuàng)立了一種能快速且可視化檢測棕櫚疫霉菌的方法。具體來說，該方法通過基因組序列比對獲得了榴蓮根腐病棕櫚疫霉菌特異片段，以此片段設(shè)計(jì)并篩選了crispr/cas12a系統(tǒng)的crrna探針及rpa引物，從而實(shí)現(xiàn)rpa對靶基因的特異性擴(kuò)增。此外，本發(fā)明利用crispr/cas12a系統(tǒng)對報(bào)告基因進(jìn)行切割，以此建立適用于榴蓮根腐病棕櫚疫霉菌的快速檢測方法。該方法經(jīng)過rpa和crispr/cas12a體系的優(yōu)化，對檢測方法的靈敏性和特異性均進(jìn)行了評估。結(jié)果顯示：該方法對榴蓮根腐病棕櫚疫霉菌的檢測可在30分鐘內(nèi)完成，具有良好特異性且無交叉反應(yīng)，靈敏度達(dá)到10?fg/μl。該方法基于crispr/cas12a所具有的反式切割活性，針對榴蓮根腐病棕櫚疫霉菌的特異片段進(jìn)行快速、靈敏且特異的檢測，無需昂貴或大型儀器設(shè)備，采用簡單、便攜的可視化閉管檢測方法，適用于現(xiàn)場和田間樣本的快速檢測。

47、（5）該方法將crrna與目的序列的特異識別和rpa的特異性擴(kuò)增相結(jié)合，增強(qiáng)了crispr/cas12a技術(shù)檢測的靈敏性和特異性。在38℃條件下進(jìn)行檢測，適用于實(shí)驗(yàn)室或現(xiàn)場沒有pcr儀器設(shè)備的情況，同時(shí)可以利用藍(lán)光照射并肉眼觀察檢測結(jié)果。

48、綜合而言，基于rpa-crispr/cas12a熒光檢測榴蓮根腐病棕櫚疫霉菌的方法比傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法具有更高的靈敏度，并且檢測時(shí)間大大縮短，30分鐘內(nèi)即可完成檢測。這種方法操作簡便、快捷、靈敏且具有很強(qiáng)的特異性，全程在38℃環(huán)境下進(jìn)行，對儀器設(shè)備要求不高，適合廣泛在海關(guān)口岸現(xiàn)場檢測中應(yīng)用，具有良好的前景。