本發(fā)明涉及微生物基因工程，具體涉及apbc基因敲除的創(chuàng)傷弧菌菌株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、創(chuàng)傷弧菌是一種革蘭氏陰性細(xì)菌，是最具侵襲性的弧菌屬物種之一。這類機(jī)會(huì)性致病菌在溫暖的月份快速增殖，并在軟體貝類中大量積累，能夠引起人類快速的致命性感染。感染途徑包括食用受污染的海鮮引起的胃腸道癥狀、嚴(yán)重原發(fā)性敗血癥，開(kāi)放性傷口暴露于受污染的水體導(dǎo)致的傷口感染等。原發(fā)性敗血癥的病死率高于50%，死亡通常發(fā)生在住院72小時(shí)內(nèi)。因此，探究創(chuàng)傷弧菌的致病機(jī)制對(duì)于降低創(chuàng)傷弧菌病死率至關(guān)重要。

2、大多數(shù)由創(chuàng)傷弧菌引起的敗血癥病例與基礎(chǔ)疾病有關(guān)，特別是肝硬化、慢性腎衰竭和血色病，這些疾病通常都會(huì)導(dǎo)致血清鐵水平升高。因此，鐵過(guò)載被認(rèn)為是病情進(jìn)展的主要因素之一。宿主的免疫系統(tǒng)在增強(qiáng)對(duì)創(chuàng)傷弧菌的易感性中起重要作用，動(dòng)物體內(nèi)的鐵促進(jìn)了創(chuàng)傷弧菌的生長(zhǎng)，內(nèi)毒素增加，誘導(dǎo)分泌腫瘤壞死因子α（tnf-α）；同時(shí)，過(guò)量的鐵降低了中性粒細(xì)胞的活性。除了這些毒力因子之外，由于創(chuàng)傷弧菌生長(zhǎng)速率增加，其也表現(xiàn)出殺死宿主細(xì)胞的細(xì)胞毒性，而且鐵過(guò)載也可影響先天性和獲得性免疫應(yīng)答。

3、鐵和硫?qū)缀跛屑?xì)菌都是必需的，以fe-s簇作為輔因子的鐵-硫蛋白質(zhì)執(zhí)行多種重要的細(xì)胞過(guò)程，例如電子傳遞、代謝反應(yīng)和基因調(diào)節(jié)等，并且分布廣泛。apbc是一類獨(dú)特的進(jìn)化上保守蛋白質(zhì)的代表性成員，其可以結(jié)合瞬時(shí)fe-s簇并激活脫輔基蛋白，促進(jìn)fe-s簇轉(zhuǎn)移。

4、因此，可以推測(cè)apbc基因在創(chuàng)傷弧菌鐵-硫蛋白生物合成中發(fā)揮重要作用。構(gòu)建apbc基因敲除的創(chuàng)傷弧菌有利于研究apbc基因?qū)τ趧?chuàng)傷弧菌生長(zhǎng)和毒力的影響，進(jìn)一步探究鐵硫簇系統(tǒng)與創(chuàng)傷弧菌致病機(jī)制的聯(lián)系。但是，目前并未有記載構(gòu)建出apbc基因敲除的創(chuàng)傷弧菌以及相應(yīng)的構(gòu)建方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種apbc基因敲除的創(chuàng)傷弧菌菌株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，該菌株是通過(guò)同源重組方法將apbc基因敲除并利用細(xì)菌間的接合轉(zhuǎn)移構(gòu)建而得，構(gòu)建方法簡(jiǎn)單，易操作，菌落篩選效率高，合成效率高，構(gòu)建出的apbc基因敲除的創(chuàng)傷弧菌菌株中缺失apbc基因片段，apbc基因片段的缺失可影響創(chuàng)傷弧菌鐵-硫蛋白（fe-s蛋白）合成且不致死，通過(guò)將該apbc基因敲除的創(chuàng)傷弧菌菌株與創(chuàng)傷弧菌野生株的比較可更為準(zhǔn)確研究apbc基因?qū)?chuàng)傷弧菌生物學(xué)特性的影響以及鐵硫簇系統(tǒng)重要的生物學(xué)功能，用于揭示apbc基因?qū)?chuàng)傷弧菌鐵硫利用的影響，進(jìn)一步研究細(xì)菌的毒力和生存能力。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明的第一方面，提供一種apbc基因敲除的創(chuàng)傷弧菌菌株，所述apbc基因敲除的創(chuàng)傷弧菌菌株中缺失apbc基因片段；

4、所述apbc基因敲除的創(chuàng)傷弧菌菌株的分類命名為vibrio?vulnificus?△apbc（v.v-△apbc），保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國(guó)武漢武漢大學(xué)，保藏編號(hào)為cctcc?no：m20232565，保藏日期為2023年12月15日。

5、進(jìn)一步地，所述菌株fe-s蛋白合成缺陷。

6、本發(fā)明的第二方面，提供一種apbc基因敲除的創(chuàng)傷弧菌菌株的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

7、（1）構(gòu)建apbc基因缺失的重疊片段

8、該步驟采用重疊延伸pcr方法擴(kuò)增獲得apbc基因敲除的重疊片段，具體步驟如下：

9、1.1根據(jù)目的基因序列，分別設(shè)計(jì)apbc?f1/r1、apbc?f2/r2兩對(duì)引物，從創(chuàng)傷弧菌基因組中分別擴(kuò)增出apbc基因的上游、下游片段。其中，引物apbc?f1、r2在設(shè)計(jì)時(shí)于5’端分別加入酶切位點(diǎn)，引物apbc?f2、r1在設(shè)計(jì)時(shí)于5’端分別加入15-20bp重疊序列；

10、1.2以步驟1.1產(chǎn)物的上游、下游序列為模板，加入引物apbc?f1、apbc?r2進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到apbc基因缺失的重疊片段。

11、（2）構(gòu)建重組自殺質(zhì)粒pdm4-△apbc

12、2.1將獲得的apbc基因缺失的重疊片段根據(jù)引物設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)進(jìn)行雙酶切，自殺質(zhì)粒pdm4也用同種限制性內(nèi)切酶酶切；

13、2.2將酶切后的apbc基因缺失的重疊片段與自殺質(zhì)粒pdm4連接，構(gòu)建重組自殺質(zhì)粒pdm4-△apbc；

14、2.3將連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌dh5α?λpir內(nèi)，涂布在含10μg/ml氯霉素的lb平板上進(jìn)行篩選，利用引物cat-f、cat-r對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行pcr擴(kuò)增鑒定并進(jìn)行測(cè)序；將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒命名為pdm4-△apbc并保存菌株；利用質(zhì)粒提取試劑盒提取自殺質(zhì)粒pdm4-△apbc；

15、2.4將步驟2.3提取的自殺質(zhì)粒pdm4-△apbc以相同的熱激轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入接合作用供體菌e.coli?s17-1?λpir內(nèi)。

16、（3）細(xì)菌的接合轉(zhuǎn)移

17、該步驟通過(guò)供體菌和受體菌直接接觸，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入受體菌內(nèi)而發(fā)生同源重組，具體步驟如下：

18、3.1取野生型創(chuàng)傷弧菌與e.coli?s17-1?λpir菌液混合離心，重懸后接種于bhi厚血平板，30℃條件下培養(yǎng)24h；

19、3.2再使用bhi培養(yǎng)基充分吹懸菌斑，將懸液離心后再重懸；

20、3.3將此菌液倍比稀釋，涂布于含10μg/ml氯霉素和12.5μg/ml多粘菌素e的bhi血平板上，37℃條件下培養(yǎng)至出現(xiàn)菌落；

21、3.4挑取單菌落至含有12.5μg/ml多粘菌素e的bhi液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)至肉眼可見(jiàn)，利用引物apbc?f1、apbc?r2進(jìn)行菌液pcr鑒定，獲得第一重組菌落。

22、（4）基因缺失突變株的篩選

23、該步驟通過(guò)利用質(zhì)粒的蔗糖抗性基因進(jìn)一步篩選陽(yáng)性克隆，具體步驟如下：

24、4.1挑取陽(yáng)性克隆至bhi液體培養(yǎng)基中靜置過(guò)夜，離心后使用bhi培養(yǎng)基重懸；用pbs將菌液倍比稀釋10、100、1000、10000倍，涂布于含10wt%蔗糖的bh固體平板上，37℃條件下在培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)；

25、4.2挑取在含10wt%蔗糖的bhi固體平板上的菌株，分別點(diǎn)在含10μg/ml氯霉素和不含氯霉素的bhi固體平板上，培養(yǎng)箱培養(yǎng)；在含10μg/ml氯霉素的bhi固體平板上不生長(zhǎng)、在不含氯霉素的bhi固體平板上生長(zhǎng)的為可疑基因缺失突變菌株；挑取無(wú)氯霉素抗性菌株，再進(jìn)行重復(fù)以上操作，防止假陽(yáng)性的出現(xiàn)；

26、4.3挑取無(wú)氯霉素抗性的目標(biāo)菌株，接種到bhi液體培養(yǎng)基中，利用引物mutapbc-f、mutapbc-r進(jìn)行pcr鑒定并提基因組進(jìn)行測(cè)序；保存測(cè)序正確的菌株，最終獲得創(chuàng)傷弧菌apbc基因敲除菌株v.v-△apbc。

27、本發(fā)明的第三方面，提供一種apbc基因敲除的創(chuàng)傷弧菌菌株的應(yīng)用，所述apbc基因敲除的創(chuàng)傷弧菌菌株用于研究創(chuàng)傷弧菌中apbc基因的功能。

28、具體地，所述apbc基因敲除的創(chuàng)傷弧菌菌株在研究創(chuàng)傷弧菌致病機(jī)理中的應(yīng)用。

29、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

30、（1）本發(fā)明首次將多粘菌素和氯霉素聯(lián)合使用作為篩選用抗生素，創(chuàng)傷弧菌自身具有多粘菌素抗性，第一輪篩選中通過(guò)多粘菌素與氯霉素的聯(lián)合使用，大大提高了第一重組菌落篩選的效率；

31、（2）利用重疊pcr技術(shù)獲得了上下游同源臂的融合片段，并連接于自殺質(zhì)粒pdm4，通過(guò)熱激導(dǎo)入感受態(tài)大腸桿菌dh5α?λpir中復(fù)制，獲得大量重組質(zhì)粒，提高了后續(xù)接合轉(zhuǎn)移的效率；

32、（3）本發(fā)明通過(guò)同源重組方法將apbc基因敲除并利用細(xì)菌間的接合轉(zhuǎn)移構(gòu)建出apbc基因敲除的創(chuàng)傷弧菌菌株，構(gòu)建方法簡(jiǎn)單，易操作，菌落篩選效率高，合成效率高，構(gòu)建出的apbc基因敲除的創(chuàng)傷弧菌菌株中缺失apbc基因片段，因鐵-硫蛋白多參與細(xì)菌重要生命過(guò)程，在進(jìn)化上高度保守，敲除多會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌死亡，導(dǎo)致研究困難，apbc基因片段的缺失可影響創(chuàng)傷弧菌鐵-硫蛋白合成且不致死，通過(guò)將該apbc基因敲除的創(chuàng)傷弧菌菌株與創(chuàng)傷弧菌野生株的比較可更為準(zhǔn)確研究apbc基因?qū)?chuàng)傷弧菌生物學(xué)特性的影響以及鐵硫簇系統(tǒng)重要的生物學(xué)功能，用于揭示apbc基因?qū)?chuàng)傷弧菌鐵硫利用的影響，進(jìn)一步研究細(xì)菌的毒力和生存能力。