本發(fā)明涉及分子生物學(xué)檢測，具體涉及一種檢測人源細(xì)胞端粒酶活性的引物組合物及試劑盒。

背景技術(shù)：

1、21世紀(jì)以來，細(xì)胞藥物的研發(fā)和臨床應(yīng)用受到了國內(nèi)外的高度重視。人源干細(xì)胞、體細(xì)胞以及免疫細(xì)胞具有較強(qiáng)的生物學(xué)及臨床醫(yī)學(xué)作用。人源細(xì)胞藥物在治療癌癥、器官損傷以及免疫系統(tǒng)疾病方面皆具有很好的療效。因細(xì)胞藥物具有生物學(xué)活性，故其安全性也引起人們的高度重視。細(xì)胞致瘤性是評價(jià)其安全性的重要指標(biāo)之一。

2、端粒是真核細(xì)胞染色體末端特殊的蛋白質(zhì)-dna復(fù)合結(jié)構(gòu)，人源細(xì)胞端粒序列由多組相同序列“5’-ttaggg-3’”組成。端粒在正常細(xì)胞分裂過程中逐漸縮短，達(dá)到臨界長度時(shí)細(xì)胞便會(huì)停止分裂并觸發(fā)凋亡。

3、端粒酶是由rna和蛋白質(zhì)組成的一種核糖核蛋白酶。端粒酶能以自身rna為模板復(fù)制合成端粒序列。在增殖活躍的細(xì)胞中具有端粒酶活性，而在正常成熟體細(xì)胞中無端粒酶活性，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)腫瘤細(xì)胞都呈端粒酶陽性，而在正常組織陽性率很低，因此端粒酶可作為一個(gè)廣泛的腫瘤標(biāo)志物，端粒酶活性也成為細(xì)胞致瘤性的一個(gè)重要指標(biāo)。

4、近幾年隨著大量人源細(xì)胞產(chǎn)品上市，產(chǎn)品的致瘤性也成為重要的品質(zhì)控制項(xiàng)目。

5、目前，尚無檢測人源細(xì)胞端粒酶活性的標(biāo)準(zhǔn)試劑盒。常用的檢測試劑盒有直接檢測法試劑盒和間接檢測法試劑盒。直接檢測法試劑盒原理為擴(kuò)增端粒重復(fù)dna序列并檢測。主要以trap法(telomeric?repeat?amplification?protocol,trap)為基礎(chǔ)的改良方法，其試劑盒在pcr操作之后還需進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)，檢測時(shí)間長，操作復(fù)雜。間接檢測法試劑盒原理為端粒酶催化亞基tert的表達(dá)與端粒酶活性水平成正相關(guān)，可通過檢測tert的mrna表達(dá)來間接檢測端粒酶活性，其方法缺陷為需提取mrna并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄再進(jìn)行擴(kuò)增檢測，最后需對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測并對結(jié)果進(jìn)行凝膠圖像分析，檢測時(shí)間較長，操作不簡便，不適用于細(xì)胞藥物的生產(chǎn)、質(zhì)檢。

6、以上檢測試劑盒存在各種缺陷，亟需一種準(zhǔn)確、快速、特異性強(qiáng)、便捷的檢測試劑盒來解決細(xì)胞藥物生產(chǎn)、質(zhì)檢過程中人源細(xì)胞端粒酶活性檢測的難題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于找到一種檢測人源細(xì)胞端粒酶活性的引物組合物及試劑盒，基于直接檢測法而無需進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)，使用rt-pcr快速檢測人源細(xì)胞端粒酶活性的試劑盒。

2、本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，使用端粒酶細(xì)胞裂解液將細(xì)胞裂解獲得高濃度端粒酶，使用端粒酶反應(yīng)液和端粒酶反應(yīng)啟動(dòng)引物tele-ts?seq?id?no.3進(jìn)行端粒延伸反應(yīng)，將端粒酶反應(yīng)產(chǎn)物與端粒酶活性檢測pcr反應(yīng)液、pcr反應(yīng)引物組合tele-f?seq?id?no.1和pcr反應(yīng)引物組合tele-r?seq?id?no.2進(jìn)行rt-pcr，檢測細(xì)胞端粒表達(dá)量，并根據(jù)rt-pcr的ct值判定端粒酶活性。

3、一種檢測人源細(xì)胞端粒酶活性的引物組合物，檢測pcr反應(yīng)引物組合包括以下堿基序列：

4、tele-f：5’-ggcaatccgtacgagcagagttaag-3’seq?id?no.1

5、tele-r：5’-ttaagcgcggcttacccttacccttaccctaaccggcc-3’seq?id?no.2。

6、端粒酶反應(yīng)的啟動(dòng)引物的堿基序列：

7、tele-ts：5’-ggcaatccgtacgagcagagttaag-3’seq?id?no.3。

8、一種檢測人源細(xì)胞端粒酶活性的試劑盒，包括以下組分：

9、1)端粒酶細(xì)胞裂解液；

10、2)端粒酶反應(yīng)液；

11、3)端粒酶活性檢測rt-pcr反應(yīng)液；

12、4)上述的rt-pcr反應(yīng)引物tele-f、tele-r和上述的端粒酶反應(yīng)啟動(dòng)引物tele-ts。

13、進(jìn)一步，所述檢測人源細(xì)胞端粒酶活性的試劑盒，包括以下單獨(dú)包裝的組件：

14、組件甲，用于進(jìn)行細(xì)胞裂解，包括端粒酶細(xì)胞裂解液；

15、組件乙，用于進(jìn)行端粒酶反應(yīng)，包括端粒酶反應(yīng)液、100mm?dntp、0.01mm端粒酶反應(yīng)啟動(dòng)引物tele-ts堿基序列seq?id?no.3；

16、組件丙，用于進(jìn)行端粒酶催化的延伸反應(yīng)，包括端粒酶活性檢測pcr反應(yīng)液、pcr反應(yīng)引物組合0.01mm?tele-f堿基序列seq?id?no.1、0.01mm?tele-r堿基序列seq?id?no.2。

17、所述端粒酶細(xì)胞裂解液：含0.2％的ph?8.8濃度為1.5m的tris-hcl、1.6mmmgcl2·6h2o、1.1mm?edta、1％np-40、0.8mm脫氧膽酸鈉、10％甘油、43mm?nacl、5mmβ-巰基乙醇、65mm?chaps，余量為depc水，百分比為體積百分比。

18、所述端粒酶反應(yīng)液：含體積百分比12％的ph?8.8濃度為1.5m的tris-hcl、67mmkcl、14mm?mgcl2·6h2o、10mm?egta，余量為depc水。

19、所述端粒酶活性檢測pcr反應(yīng)液：含0.01％pcr級的sybr?green?i?10000×、1.3％的ph?8.8濃度為1.5m的tris-hcl、1.3mm?edta、0.14m?kcl、9％甘油、26mm?mgcl2·6h2o、1m甜菜堿、2％甲酰胺、129mm?dtt、5％dmso、39mm硫酸銨、0.1％的濃度為2.5mm的dntp、5u/μl熱啟動(dòng)酶，余量為無菌水，百分比為體積百分比。

20、本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和技術(shù)效果：不同于傳統(tǒng)的端粒酶活性檢測，本發(fā)明試劑盒通過使用pcr檢測多代次、多批次hela細(xì)胞和mrc-5細(xì)胞的端粒酶活性，得到大量樣本的ct值。經(jīng)多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)后，根據(jù)hela細(xì)胞和mrc-5細(xì)胞的端粒酶活性的特性及實(shí)驗(yàn)結(jié)果決定將hela細(xì)胞為陽性對照，mrc-5細(xì)胞為陰性對照，基于統(tǒng)計(jì)軟件得出本發(fā)明中人源細(xì)胞端粒酶活性其端粒酶活性的判定標(biāo)準(zhǔn)。舊的trap方法，最后需對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測并對結(jié)果進(jìn)行凝膠圖像分析，檢測時(shí)間較長，操作不簡便，不適用于細(xì)胞藥物的生產(chǎn)、質(zhì)檢。本發(fā)明試劑盒僅需通過對ct值就能夠直觀的判斷端粒酶活性的強(qiáng)弱，與市場中相同種類的試劑盒(telomerase?activity?quantification?qpcr?assay?kit廠家：sciencell貨號：8928)相比，本發(fā)明試劑盒端粒酶反應(yīng)時(shí)間為1小時(shí)，telomerase?activityquantification?qpcr?assay?kit為3小時(shí)，且pcr檢測出端粒酶的表達(dá)靈敏度高于市場中同種產(chǎn)品。本發(fā)明試劑盒具有準(zhǔn)確、快速、靈敏度高、重復(fù)性好、操作簡便、檢測結(jié)果判定方法簡易。為細(xì)胞藥物產(chǎn)品大批量生產(chǎn)及后期質(zhì)量控制提供了新的檢測技術(shù)?？捎糜诩?xì)胞藥物生產(chǎn)、質(zhì)檢中人源細(xì)胞端粒酶活性的檢測。

技術(shù)特征：

1.一種檢測人源細(xì)胞端粒酶活性的引物組合物，其特征在于，檢測pcr反應(yīng)引物組合包括以下堿基序列：

2.根據(jù)權(quán)利要求所述檢測人源細(xì)胞端粒酶活性的引物組合物，其特征在于，端粒酶反應(yīng)的啟動(dòng)引物的堿基序列：

3.一種檢測人源細(xì)胞端粒酶活性的試劑盒，其特征在于，包括以下組分：

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述檢測人源細(xì)胞端粒酶活性的試劑盒，其特征在于，包括以下單獨(dú)包裝的組件：

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述檢測人源細(xì)胞端粒酶活性的試劑盒，其特征在于，所述端粒酶細(xì)胞裂解液：含0.2％的ph?8.8濃度為1.5m的tris-hcl、1.6mm?mgcl2·6h2o、1.1mm?edta、1％np-40、0.8mm脫氧膽酸鈉、10％甘油、43mm?nacl、5mmβ-巰基乙醇、65mm?chaps，余量為depc水，百分比為體積百分比。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述檢測人源細(xì)胞端粒酶活性的試劑盒，其特征在于，所述端粒酶反應(yīng)液：含體積百分比12％的ph?8.8濃度為1.5m的tris-hcl、67mm?kcl、14mm?mgcl2·6h2o、10mm?egta，余量為depc水。

7.根據(jù)權(quán)利要求4所述檢測人源細(xì)胞端粒酶活性的試劑盒，其特征在于，所述端粒酶活性檢測pcr反應(yīng)液：含0.01％pcr級的sybr?green?i?10000×、1.3％的ph?8.8濃度為1.5m的tris-hcl、1.3mm?edta、0.14m?kcl、9％甘油、26mm?mgcl2·6h2o、1m甜菜堿、2％甲酰胺、129mm?dtt、5％dmso、39mm硫酸銨、0.1％的濃度為2.5mm的dntp、5u/μl熱啟動(dòng)酶，余量為無菌水，百分比為體積百分比。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種檢測人源細(xì)胞端粒酶活性的引物組合物及試劑盒，檢測PCR反應(yīng)引物組合包括以下堿基序列：tele?F(SEQ?ID?NO.1)、tele?R(SEQ?ID?NO.2)，端粒酶反應(yīng)的啟動(dòng)引物的堿基序列：tele?TS(SEQ?ID?NO.3)。試劑盒包括(1)端粒酶細(xì)胞裂解液；(2)端粒酶反應(yīng)液；(3)端粒酶活性檢測RT?PCR反應(yīng)液；(4)RT?PCR反應(yīng)引物tele?F、tele?R、端粒酶反應(yīng)啟動(dòng)引物tele?TS。本發(fā)明的檢測試劑盒靈敏度高、重復(fù)性好、操作簡便；檢測結(jié)果判定方法簡易。為快速檢測人源細(xì)胞端粒酶活性提供有力的技術(shù)支撐。

技術(shù)研發(fā)人員：魏喆,劉欣欣,韓之波
受保護(hù)的技術(shù)使用者：天津昂賽細(xì)胞基因工程有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/19