本發(fā)明涉及真菌菌絲分離，具體地，涉及一種獲得叢枝菌根真菌根外菌絲的方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、叢枝菌根(arbuscular?mycorrhiza，am)真菌可與陸地上72％以上的植物進(jìn)行共生互作。am真菌不僅能夠在植物根系皮層形成叢枝結(jié)構(gòu)以及存在根內(nèi)菌絲，也會(huì)在根外分布大量的根外菌絲。根外菌絲吸收土壤中的養(yǎng)分運(yùn)輸?shù)礁祪?nèi)，從而增加植物的營養(yǎng)吸收。此外，大部分am真菌的根外菌絲生長迅速，能存活5個(gè)月之久(“l(fā)ifespan?andfunctionality?of?mycorrhizal?fungal?mycelium?are?uncoupled?from?host?plantlifespan”)，可以作為am真菌的繁殖體(“colonization?of?roots?by?arbuscularmycorrhizal?fungi?using?different?sources?of?inoculum”)，從而使am真菌在新的宿主植物根系上定殖，形成新的叢枝菌根共生體。從土壤中分離收集am真菌的根外活體菌絲有利于叢枝菌根真菌繁殖體的多樣化擴(kuò)充。

2、菌根學(xué)研究中，本領(lǐng)域技術(shù)人員在探究叢枝菌根共生的內(nèi)在機(jī)制以及進(jìn)行叢枝菌根真菌的田間應(yīng)用試驗(yàn)時(shí)，均需要使用大量的am真菌繁殖體?，F(xiàn)有技術(shù)中通常采用直接對(duì)植物進(jìn)行接種am真菌孢子進(jìn)行擴(kuò)繁，從而獲得大量am真菌的孢子作為am真菌繁殖體，例如盆栽培養(yǎng)法、玻璃珠分室培養(yǎng)法、霧化培養(yǎng)法、無菌雙重培養(yǎng)法等。這些方法都需要通過打碎植物根系或根際土壤，先用濕篩傾析來篩出孢子，然后用蔗糖溶液進(jìn)行梯度離心分離出飽滿的孢子，以獲取植物根系和土壤中的孢子。其過程耗時(shí)長，且孢子在蔗糖中容易失活。與此同時(shí)，在分離孢子的過程中，容易損失土壤中的大量活體菌絲，從而造成am真菌繁殖體資源的浪費(fèi)。此外，由于am真菌孢子的產(chǎn)出速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于活體菌絲產(chǎn)出速率，直接分離am真菌活體菌絲更有助于am真菌的快速擴(kuò)繁。然而分離am真菌活體菌絲的傳統(tǒng)方法都比較粗放，需要反復(fù)的攪拌、離心以及抽濾過程(“external?hyphal?production?of?vesicular-arbuscular?mycorrhizal?fungiin?pasture?and?tallgrass?prairie?communities”)，而且為了獲得完整的活體菌絲，需要在體式顯微鏡下冰水浴中挑取菌絲，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決現(xiàn)有技術(shù)中缺少簡易、高效且可視化分離收集土壤中am真菌根外活體菌絲的方法的問題，本發(fā)明提供了一種獲得叢枝菌根真菌根外菌絲的方法及其應(yīng)用。

2、本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種獲得叢枝菌根真菌根外菌絲的方法。

3、本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供所述方法在叢枝菌根真菌繁殖中的應(yīng)用。

4、本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供所述方法在制備叢枝菌根真菌共生體中的應(yīng)用。

5、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過以下方案予以實(shí)現(xiàn)的：

6、本發(fā)明發(fā)現(xiàn)活體根外菌絲在宿主植物的根外可形成較大的連續(xù)菌絲體，在水中攪拌的過程中相互纏繞，并纏繞到添加的細(xì)小不規(guī)則形狀的固體顆粒上，然后運(yùn)用篩子的網(wǎng)格阻隔作用，將纏繞了菌絲體的固體顆粒截留在篩網(wǎng)上。將篩子上的截留物倒在培養(yǎng)皿上，加冰水浸泡。由于水的浮力作用，菌絲體與其纏繞的載體即可在冰水中呈現(xiàn)出肉眼可見的棉絮狀菌絲團(tuán)，水輕微的波動(dòng)即可帶動(dòng)該團(tuán)狀體，在不借用顯微鏡進(jìn)行放大操作條件下，即可直接用鑷子或吸管收集得到am真菌的根外菌絲。

7、一種獲得叢枝菌根真菌根外菌絲的方法，包括以下步驟：

8、s1.用浸泡液充分浸泡植物的根系及根系生長范圍內(nèi)的土壤，收集浸泡物，之后將浸泡物、固體顆粒和浸泡液混合均勻，得到混合物；

9、所述植物與叢枝菌根真菌存在叢枝菌根共生；所述浸泡液為含吐溫20的冰水混合物；所述固體顆粒的表面粗糙，且密度小于水；

10、s2.對(duì)步驟s1所得混合物進(jìn)行固液分離，得到泥漿和沉淀物；用篩網(wǎng)過濾所得泥漿，收集未過網(wǎng)的分離物；所述篩網(wǎng)的孔徑等于所述固體顆粒的最大直徑；

11、s3.用冰水充分浸泡步驟s2所得分離物，收集菌絲，即得到所述叢枝菌根真菌根外菌絲。

12、優(yōu)選地，步驟s2包括以下步驟：

13、s21.對(duì)步驟s1所得混合物進(jìn)行固液分離，得到泥漿1和沉淀物1，用所述篩網(wǎng)過濾所得泥漿1，收集未過網(wǎng)的分離物1；

14、s22.將所述浸泡液和步驟s21所得沉淀物1混合均勻，固液分離，得到泥漿2和沉淀物2，用所述篩網(wǎng)過濾所得泥漿2，收集未過網(wǎng)的分離物2。

15、更優(yōu)選地，步驟s2還包括以下步驟：s23.將步驟s22重復(fù)3～4次。

16、進(jìn)一步優(yōu)選地，步驟s2還包括以下步驟：s23.將步驟s22重復(fù)3次。

17、優(yōu)選地，所述固體顆粒為膨脹蛭石。

18、優(yōu)選地，所述固體顆粒物的最大直徑為0.4～0.5mm。

19、更優(yōu)選地，所述固體顆粒物的最大直徑為0.5mm。

20、優(yōu)選地，所述冰水混合物由質(zhì)量比為(1～2)：(2～6)的冰和水組成。

21、更優(yōu)選地，所述冰水混合物由質(zhì)量比為1：1的冰和水組成。

22、優(yōu)選地，所述浸泡液中吐溫20的濃度為0.05μl/ml～0.1μl/ml。

23、更優(yōu)選地，所述浸泡液中吐溫20的濃度為0.1μl/ml。

24、優(yōu)選地，所述叢枝菌根真菌為異形根孢囊霉(rhizophagus?irregularis)。

25、優(yōu)選地，所述植物種植于培養(yǎng)盆，則步驟s1中，將所述培養(yǎng)盆置于所述浸泡液中浸泡，水面低于所述培養(yǎng)盆的盆口，泥土表面不被浸沒。

26、任一所述方法在叢枝菌根真菌繁殖中的應(yīng)用也應(yīng)在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

27、任一所述方法在制備叢枝菌根真菌共生體中的應(yīng)用也應(yīng)在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

28、優(yōu)選地，所述任一方法獲得的所述叢枝菌根真菌根外菌絲作為繁殖體。

29、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

30、本發(fā)明提供的方法，首先設(shè)計(jì)了冰水創(chuàng)造的低溫條件，不易讓叢枝菌根真菌根外菌絲失活；其次，本發(fā)明在設(shè)計(jì)了低溫條件的同時(shí)，采用土溫20作為去污劑，既不影響活體菌絲的蛋白活性，又能洗滌掉粘在菌絲表面的土壤顆粒，從而最大程度的使菌絲懸浮在冰水中，進(jìn)而有利于菌絲體與添加的膨脹蛭石顆粒纏繞。最后，采用纏繞蛭石顆粒的菌絲體在水中波動(dòng)條件下容易被識(shí)別的特性，可以不借助顯微放大設(shè)備直接裸眼收集，從而做到在普通實(shí)驗(yàn)室條件下即可實(shí)現(xiàn)叢枝菌根真菌根外菌絲的快速分離和收集。

31、本發(fā)明各種操作簡易，效率高，獲得的根外菌絲保持了更強(qiáng)的活性，對(duì)宿主植物的侵染效果更好，提高根外菌絲在分離過程中的完整性，為后續(xù)的叢枝菌根真菌根外活體菌絲的生理或分子檢測(cè)研究提供更加真實(shí)可靠的樣本來源，且避免傳統(tǒng)方法中為收集叢枝菌根真菌孢子而浪費(fèi)活體菌絲的情況，節(jié)約資源，降低成本，可行性高。