本發(fā)明屬于生物，具體涉及一種冠狀病毒蛋白的表達(dá)和純化方法。

背景技術(shù)：

1、在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其是疫苗開(kāi)發(fā)和疾病研究中，高質(zhì)量的冠狀病毒蛋白是至關(guān)重要的資源。然而，冠狀病毒蛋白往往難以在常規(guī)的表達(dá)系統(tǒng)中達(dá)到高產(chǎn)率且保持良好的可溶性。大腸桿菌作為常用的蛋白表達(dá)宿主，雖然具有成本低、生長(zhǎng)快的優(yōu)勢(shì)，但冠狀病毒蛋白在其體內(nèi)表達(dá)時(shí)經(jīng)常形成包涵體，導(dǎo)致蛋白回收復(fù)雜且活性受損。

2、傳統(tǒng)的表達(dá)方法在大腸桿菌中生產(chǎn)冠狀病毒蛋白時(shí)，遇到的主要問(wèn)題是蛋白表達(dá)量低，尤其是在可溶性形式下，這限制了其在后續(xù)應(yīng)用中的效能和實(shí)用性。此外，包涵體的形成增加了下游純化和復(fù)性的難度，耗費(fèi)時(shí)間和資源。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種冠狀病毒蛋白的表達(dá)和純化方法，提升蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)水平，同時(shí)簡(jiǎn)化純化流程，以獲得高純度、高活性的冠狀病毒蛋白，以解決上述背景技術(shù)中提出的問(wèn)題。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：一種冠狀病毒蛋白的表達(dá)和純化方法，包括以下步驟：

3、構(gòu)建重組質(zhì)粒，所述重組質(zhì)粒包含冠狀病毒蛋白基因和啟動(dòng)子序列，其中所述啟動(dòng)子序列能夠被大腸桿菌識(shí)別以促進(jìn)目標(biāo)蛋白的轉(zhuǎn)錄；

4、將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主大腸桿菌細(xì)胞中，所述宿主大腸桿菌具有與所述啟動(dòng)子相匹配的調(diào)控系統(tǒng)；

5、培養(yǎng)大腸桿菌菌株，以啟動(dòng)冠狀病毒蛋白的表達(dá)，當(dāng)細(xì)菌生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，添加誘導(dǎo)劑以增強(qiáng)冠狀病毒蛋白的表達(dá)水平；

6、通過(guò)超聲破碎或滲透壓沖擊處理，裂解所述大腸桿菌，釋放出胞內(nèi)表達(dá)的冠狀病毒蛋白；

7、利用親和層析法，依據(jù)冠狀病毒蛋白上的標(biāo)簽，進(jìn)行初步純化，經(jīng)初步純化的冠狀病毒蛋白，再通過(guò)尺寸排阻色譜或離子交換色譜進(jìn)一步純化，對(duì)純化冠狀病毒蛋白進(jìn)行緩沖液置換和濃縮；

8、檢測(cè)并評(píng)估冠狀病毒蛋白的純度和活性，確保其符合生物醫(yī)學(xué)研究或疫苗制備的標(biāo)準(zhǔn)。

9、優(yōu)選的，所述構(gòu)建重組質(zhì)粒，包括：

10、選擇并合成冠狀病毒蛋白編碼序列，確保其與大腸桿菌密碼子偏好兼容，設(shè)計(jì)并克隆啟動(dòng)子序列，所述啟動(dòng)子對(duì)溫度敏感，允許在特定溫度下增強(qiáng)冠狀病毒蛋白基因的轉(zhuǎn)錄；

11、連接冠狀病毒蛋白編碼序列和溫度敏感啟動(dòng)子，形成融合基因，隨后將其插入載體骨架中；

12、驗(yàn)證構(gòu)建的重組質(zhì)粒通過(guò)測(cè)序，確認(rèn)冠狀病毒蛋白編碼序列和啟動(dòng)子序列正確無(wú)誤地整合進(jìn)載體。

13、優(yōu)選的，所述將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主大腸桿菌細(xì)胞中，包括：

14、準(zhǔn)備感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞，所述細(xì)胞已通過(guò)預(yù)冷處理增加其膜通透性，使其吸收外源dna；

15、將準(zhǔn)備的感受態(tài)細(xì)胞與重組質(zhì)?；旌希诒隙虝悍跤?，使質(zhì)粒dna與細(xì)胞充分接觸；

16、通過(guò)熱激處理，促使混合物內(nèi)的大腸桿菌細(xì)胞吸收重組質(zhì)粒，完成轉(zhuǎn)化過(guò)程；

17、在復(fù)蘇培養(yǎng)基中培養(yǎng)處理后的細(xì)胞，以恢復(fù)細(xì)胞活力并篩選出成功攜帶重組質(zhì)粒的大腸桿菌克隆。

18、優(yōu)選的，所述培養(yǎng)大腸桿菌菌株，包括：

19、將篩選出的成功攜帶重組質(zhì)粒的大腸桿菌單克隆接種至含有抗生素的選擇性培養(yǎng)基中，以抑制未轉(zhuǎn)化菌株的生長(zhǎng)；

20、使用補(bǔ)料分批培養(yǎng)策略培養(yǎng)菌液，監(jiān)控培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)，當(dāng)od600值達(dá)到預(yù)定范圍時(shí)，即細(xì)菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，準(zhǔn)備誘導(dǎo)冠狀病毒蛋白的表達(dá)；

21、添加誘導(dǎo)劑至培養(yǎng)基中，以激活與冠狀病毒蛋白基因相連的啟動(dòng)子，從而啟動(dòng)冠狀病毒蛋白的高效表達(dá)。

22、優(yōu)選的，所述添加誘導(dǎo)劑以增強(qiáng)冠狀病毒蛋白的表達(dá)水平，包括：

23、測(cè)定細(xì)菌密度，根據(jù)測(cè)定結(jié)果，計(jì)算所需誘導(dǎo)劑的量；

24、將計(jì)算的誘導(dǎo)劑量加入到細(xì)菌培養(yǎng)物中，同時(shí)調(diào)整培養(yǎng)條件；

25、定期抽樣并分析細(xì)菌培養(yǎng)物，監(jiān)測(cè)冠狀病毒蛋白的表達(dá)量，直至達(dá)到預(yù)期水平。

26、優(yōu)選的，所述釋放出胞內(nèi)表達(dá)的冠狀病毒蛋白，包括：

27、收集已完成蛋白表達(dá)的大腸桿菌菌體，通過(guò)離心分離，去除培養(yǎng)基殘留，保留菌體沉淀；

28、采用溫和的緩沖液重懸菌體沉淀，準(zhǔn)備進(jìn)行裂解前的預(yù)處理，以保護(hù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)；

29、應(yīng)用超聲破碎處理菌體懸浮液，選擇性地破壞細(xì)胞壁和膜結(jié)構(gòu)，釋放胞內(nèi)蛋白；

30、分離裂解反應(yīng)后產(chǎn)生的細(xì)胞碎片和蛋白混合液，通過(guò)離心或過(guò)濾，獲取上清液，其中含有目標(biāo)冠狀病毒蛋白。

31、優(yōu)選的，所述初步純化，包括：

32、準(zhǔn)備裝有特定配體的親和層析柱，配體能特異性結(jié)合裂解產(chǎn)物中冠狀病毒蛋白上的標(biāo)簽；

33、將含有冠狀病毒蛋白的上清液緩慢流經(jīng)親和層析柱，使蛋白標(biāo)簽與配體發(fā)生高親和力結(jié)合；

34、使用緩沖溶液清洗層析柱，去除非特異性吸附的雜蛋白，通過(guò)改變流動(dòng)相的組成，逐步洗脫層析柱上結(jié)合的目標(biāo)冠狀病毒蛋白，收集洗脫液進(jìn)行下一步純化。

35、優(yōu)選的，所述過(guò)尺寸排阻色譜或離子交換色譜進(jìn)一步純化，包括：

36、選擇適用于目標(biāo)冠狀病毒蛋白的尺寸排阻色譜或離子交換色譜柱，根據(jù)其分子大小或電荷特性進(jìn)行優(yōu)化；

37、將初步純化的冠狀病毒蛋白樣品加載至選定的色譜柱上，開(kāi)始純化過(guò)程；

38、控制流速和洗脫條件，使加載的蛋白樣品在色譜柱中經(jīng)歷分離，不同組分按分子大小或電荷分布順序洗脫；

39、收集洗脫的各個(gè)組分，通過(guò)分析檢測(cè)冠狀病毒蛋白的純度和同質(zhì)性，選取純度較高的峰段合并。

40、優(yōu)選的，所述對(duì)純化冠狀病毒蛋白進(jìn)行緩沖液置換和濃縮，包括：

41、準(zhǔn)備緩沖體系用于替換純化過(guò)程中殘余的鹽類或其他溶劑成分；

42、采用透析技術(shù)將純化的冠狀病毒蛋白溶液與緩沖體系進(jìn)行充分交換；

43、在緩沖液置換后，評(píng)估蛋白濃度，并通過(guò)超濾濃縮蛋白溶液。

44、優(yōu)選的，所述檢測(cè)并評(píng)估冠狀病毒蛋白的純度和活性，包括：

45、采用sds-page分析濃縮后的冠狀病毒蛋白，評(píng)估其純度；

46、利用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定，定量檢測(cè)分析的冠狀病毒蛋白的抗原性，確認(rèn)其生物學(xué)活性；

47、進(jìn)行穩(wěn)定性測(cè)試，監(jiān)控檢測(cè)過(guò)的冠狀病毒蛋白在不同儲(chǔ)存條件下的活性變化，確保其在指定時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定；

48、根據(jù)測(cè)試的結(jié)果，綜合評(píng)估冠狀病毒蛋白是否滿足生物醫(yī)學(xué)研究或疫苗制備所需的純度和活性標(biāo)準(zhǔn)。

49、本發(fā)明的技術(shù)效果和優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明提出的一種冠狀病毒蛋白的表達(dá)和純化方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)：

50、本發(fā)明通過(guò)設(shè)計(jì)的重組質(zhì)粒、優(yōu)化的宿主菌株選擇、精準(zhǔn)的誘導(dǎo)表達(dá)策略以及高效的多級(jí)純化技術(shù)，本方法不僅提高了蛋白的總體產(chǎn)量，而且確保了蛋白的生物活性，使其更適合作為疫苗候選成分或研究工具，從而在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域展現(xiàn)出廣泛的應(yīng)用潛力，這一方法克服了傳統(tǒng)表達(dá)系統(tǒng)中冠狀病毒蛋白可溶性差、純化困難的問(wèn)題，為冠狀病毒相關(guān)研究提供了有力的支持，旨在顯著提升蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)水平，同時(shí)簡(jiǎn)化純化流程，以獲得高純度、高活性的冠狀病毒蛋白。