本發(fā)明屬于基因工程，具體涉及一種分離自粘紅酵母（ rhodotorula? glutinis）ym25079的甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因（gpd）的啟動(dòng)子及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、紅酵母作為一種具有獨(dú)特生理特性和廣泛工業(yè)應(yīng)用潛力的微生物，近年來在科學(xué)研究和工業(yè)生產(chǎn)中逐漸嶄露頭角。其高細(xì)胞密度和高效代謝多種碳源、氮源的能力，使得紅酵母在生物轉(zhuǎn)化、油脂生產(chǎn)、類胡蘿卜素合成等領(lǐng)域表現(xiàn)出色。在紅酵母中，不論是研究代謝調(diào)控路徑還是提高代謝產(chǎn)物的含量，通常都需要過量表達(dá)相關(guān)基因。

2、真菌gpd啟動(dòng)子，即甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動(dòng)子，是一種常見的組成型啟動(dòng)子，能夠在不同條件下調(diào)控基因的表達(dá)。不同真菌gpd啟動(dòng)子的活性差異主要體現(xiàn)在啟動(dòng)子的強(qiáng)度和調(diào)控特性上。不同真菌的gpd啟動(dòng)子在驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)的能力上存在差異。一些啟動(dòng)子可能具有更強(qiáng)的驅(qū)動(dòng)能力，使得基因表達(dá)水平更高，而另一些則可能相對較弱。此外，除了強(qiáng)度上的差異，真菌gpd啟動(dòng)子的調(diào)控特性也不同。例如，有些gpd啟動(dòng)子可能受到特定環(huán)境條件的影響，如溫度、營養(yǎng)狀況等，從而表現(xiàn)出不同的活性。?

3、目前，不同種屬之間的gpd基因啟動(dòng)子在使用中存在一定的障礙，主要包括啟動(dòng)子特異性、轉(zhuǎn)錄因子差異以及調(diào)控機(jī)制的不同。?首先，啟動(dòng)子特異性是一個(gè)主要障礙。啟動(dòng)子是rna聚合酶結(jié)合位點(diǎn)，決定了基因在何時(shí)何處開始表達(dá)。不同種屬的細(xì)胞中，啟動(dòng)子的序列和結(jié)構(gòu)可能存在顯著差異，導(dǎo)致某些啟動(dòng)子在一種生物體內(nèi)有效，而在另一種生物體內(nèi)則無效或效率低下?。其次，轉(zhuǎn)錄因子差異也是一個(gè)重要因素。轉(zhuǎn)錄因子是調(diào)控基因表達(dá)的蛋白質(zhì)，不同種屬的細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子的種類和親和力可能不同，這可能導(dǎo)致外源基因在新的種屬中無法正確表達(dá)或表達(dá)水平低下?。最后，調(diào)控機(jī)制的不同也是一個(gè)關(guān)鍵障礙。不同種屬的細(xì)胞中，基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制可能存在顯著差異，包括表觀遺傳修飾、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)等方面的不同，這些都可能影響外源基因的表達(dá)效率和穩(wěn)定性?。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了一種從粘紅酵母（ rhodotorula?glutinis）ym25079中分離獲得甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因（gpd）的啟動(dòng)子（rgpgpd）及其應(yīng)用，啟動(dòng)子的核苷酸序列如seq?idno:1所示，該基因序列長為3078bp，將該啟動(dòng)子與載體連接，轉(zhuǎn)入紅冬孢酵母細(xì)胞( rhodosporidium?kratochvilovae)中，用于調(diào)控外源目的基因在紅冬孢酵母中轉(zhuǎn)錄、表達(dá)。

2、本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

3、（1）采用dna?提取試劑盒提取粘紅酵母的基因組?dna，以基因組dna為模版，采用特異性引物rgpgpd-f和rgpgpd-r擴(kuò)增獲得擴(kuò)增產(chǎn)物 rgpgpd，將雙酶切膠回收后的載體prh2034（含有 rtgfp基因）與 rgpgpd片段連接，獲得重組質(zhì)粒prgpd，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，通過pcr篩選出陽性單克隆，重組質(zhì)粒prgpd用gpd啟動(dòng)子的特異性引物進(jìn)行pcr驗(yàn)證，驗(yàn)證陽性的克隆子培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，測序，獲得含有甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒prgpd；

4、（2）利用peg介導(dǎo)的原生質(zhì)體法將重組載體prgpd轉(zhuǎn)化至紅冬孢酵母ym25235中，通過檢測熒光判斷? rtgfp?的表達(dá)情況，進(jìn)而確定該甘油醛?-3-?磷酸脫氫酶基因的?5’端核苷酸序列是否具有啟動(dòng)子活性；并通過western?blot實(shí)驗(yàn)檢測紅冬孢酵母ym25235中rtgfp熒光蛋白的表達(dá)量，判斷啟動(dòng)子的強(qiáng)度。

5、本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和技術(shù)效果：

6、本發(fā)明通過克隆粘紅酵母中甘油醛?-3-?磷酸脫氫酶基因的啟動(dòng)子5’端核苷酸序列，使其紅冬孢酵母ym25235中進(jìn)行表達(dá)，通過檢測? rtgfp?的表達(dá)情況，進(jìn)而確定該長度的甘油醛?-3-?磷酸脫氫酶基因的?5’端核苷酸序列是否具有啟動(dòng)子活性以及啟動(dòng)子的強(qiáng)度，本發(fā)明為異源表達(dá)提供了一種新的啟動(dòng)子序列，具有重要的研究意義與應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)特征：

1.一種啟動(dòng)子，來源于粘紅酵母（rhodotorula?glutinis），其核苷酸序列如?seq?idno:1?所示。

2.?權(quán)利要求?1?所述的啟動(dòng)子在紅冬孢酵母（rhodosporidium?kratochvilovae）表達(dá)系統(tǒng)中的應(yīng)用，其特征在于：調(diào)控外源目的基因在紅冬孢酵母中轉(zhuǎn)錄、表達(dá)。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種來源于粘紅酵母（Rhodotorula?glutinis）的啟動(dòng)子，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示，本發(fā)明通過克隆甘油醛?3?磷酸脫氫酶基因5’端核苷酸全長序列，使其驅(qū)動(dòng)綠色熒光蛋白R(shí)tGFP基因在紅冬孢酵母中進(jìn)行表達(dá)，通過檢測熒光判斷RtGFP的表達(dá)情況，進(jìn)而確定該長度的甘油醛?3?磷酸脫氫酶基因的5’端核苷酸序列是否具有啟動(dòng)子活性，本發(fā)明啟動(dòng)子能在紅冬孢酵母中有效驅(qū)動(dòng)外源基因的表達(dá)，為紅酵母的代謝工程改造提供了重要工具，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)研發(fā)人員：張琦,甘雨萱,和美霞,邱婧雯,陳媛
受保護(hù)的技術(shù)使用者：昆明理工大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/19