背景技術(shù)：

0、發(fā)明背景

1、某些癌癥的治療選擇可能非常有限，尤其是當(dāng)癌癥轉(zhuǎn)移且無法切除時(shí)。盡管例如手術(shù)、化療和放射治療等治療取得了進(jìn)展，但許多癌癥(例如胰腺、結(jié)直腸、肺、子宮內(nèi)膜、卵巢和前列腺癌)的預(yù)后可能較差。因此，對癌癥額外治療的需求尚未得到滿足。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

0、發(fā)明簡述

1、本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供對突變的人p53具有抗原特異性的分離或純化t細(xì)胞受體(tcr)。

2、本發(fā)明的其它實(shí)施方案提供涉及本發(fā)明tcr的相關(guān)多肽和蛋白質(zhì)以及相關(guān)核酸、重組表達(dá)載體、宿主細(xì)胞、細(xì)胞群以及藥物組合物。

3、本發(fā)明的另外實(shí)施方案提供了檢測哺乳動物中癌癥存在的方法以及治療或預(yù)防哺乳動物中癌癥的方法。

4、若干附圖視圖的簡述

5、圖1是顯示與用所指示的濃度(μg/ml)漸低的wtp53-g245肽(wt)(無陰影條)或突變型p53-g245s肽(mut)(陰影條)脈沖的自體樹突狀細(xì)胞(dc)共培養(yǎng)后，在與用來自患者4127的一個(gè)指定tcr轉(zhuǎn)導(dǎo)的自體pbl共培養(yǎng)后測量的ifn-γ(pg/ml)濃度的圖。

6、圖2是顯示在將用來自患者4127的一個(gè)所示tcr轉(zhuǎn)導(dǎo)的自體pbl與用所指示的濃度(μg/ml)漸低的wtp53-g245肽(wt)(無陰影條)或突變型p53-g245s肽(mut)(陰影條)脈沖的自體樹突狀細(xì)胞(dc)共培養(yǎng)后，檢測到的4-1bb陽性細(xì)胞的百分比(％cd4+mtcrβ+)的圖。

7、圖3是顯示在將用來自患者4127的一個(gè)所示tcr轉(zhuǎn)導(dǎo)的自體pbl與用表a所示的一種肽脈沖的自體dc共培養(yǎng)后，檢測到的4-1bb陽性細(xì)胞的百分比(％cd4+mtcrβ+)的圖。

8、圖4是顯示在將來自患者4127的til或用一個(gè)所示tcr轉(zhuǎn)導(dǎo)的t細(xì)胞與cos7細(xì)胞共培養(yǎng)后測量的ifn-γ(pg/ml)濃度的圖，所述cos7細(xì)胞用一種所示hla等位基因轉(zhuǎn)導(dǎo)并且用dmso或一種所示肽脈沖。

9、圖5是顯示在將來自患者4127的til或用一個(gè)所示tcr轉(zhuǎn)導(dǎo)的t細(xì)胞與cos7細(xì)胞共培養(yǎng)后檢測到的4-1bb陽性細(xì)胞(cd4+mtcrβ+的％)的百分比的圖，所述cos7細(xì)胞用一種所示hla等位基因轉(zhuǎn)導(dǎo)并且用dmso或一種所示肽脈沖。

10、圖6是顯示在共培養(yǎng)來自患者4127的til與同種異體的(drb3*01:01:01或drb3*02:02:01)apc之后測量的每2x104個(gè)效應(yīng)細(xì)胞的斑點(diǎn)的數(shù)量的圖，所述同種異體的(drb3*01:01:01或drb3*02:02:01)apc(1)用由無關(guān)(irr；左側(cè)斜線空條)、wt?p53(p53-wt；左側(cè)斜線灰條)或突變的p53(p53-mut；灰條)序列組成的tmg電穿孔或(2)用肽媒介物(dmso；右側(cè)斜線空條)或由wt?p53-g245序列(lp-p53-wt-g245；右側(cè)斜線灰條)或突變的p53-g245s(lp-p53-mut-g245s；黑條)序列組成的經(jīng)純化的(>95％，通過hplc)25個(gè)氨基酸的肽脈沖。

11、圖7是顯示在共培養(yǎng)表達(dá)4127-tcr1的細(xì)胞與同種異體的(drb3*01:01:01或drb3*02:02:01)apc之后測量的每2x104個(gè)效應(yīng)細(xì)胞的斑點(diǎn)的數(shù)量的圖，所述同種異體的(drb3*01:01:01或drb3*02:02:01)apc(1)用由無關(guān)(irr；左側(cè)斜線空條)、wt?p53(p53-wt；左側(cè)斜線灰條)或經(jīng)突變的p53(p53-mut；灰條)序列組成的tmg電穿孔或(2)用肽媒介物(dmso；右側(cè)斜線空條)或由wt?p53-g245序列(lp-p53-wt-g245；右側(cè)斜線灰條)或經(jīng)突變的p53-g245s(lp-p53-mut-g245s；黑條)序列組成的經(jīng)純化的(>95％，通過hplc)25個(gè)氨基酸的肽脈沖。

12、圖8a是顯示將來自用于治療患者4196的輸注袋的til與轉(zhuǎn)染了tmg1的質(zhì)粒和指定hla等位基因的cos7細(xì)胞共培養(yǎng)后測量的ifn-γ分泌(斑點(diǎn)/2×104個(gè)細(xì)胞)的圖。

13、圖8b是顯示將來自用于治療患者4196的輸注袋的til與用候選最小表位(hmtevvrhc(seq?id?no:530)或(sqhmtevrh(seq?id?no:531))脈沖的自體dc共培養(yǎng)后測量的ifn-γ分泌(斑點(diǎn)/2×104個(gè)細(xì)胞)的圖。單獨(dú)培養(yǎng)的t細(xì)胞作為對照。

14、圖9a-9d是顯示用指示濃度(μg/ml)的最小wt(圓圈)或突變的(mut)(方塊)表位脈沖的dc與使用以下tcr之一轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞共同培養(yǎng)后檢測到的mtcrβ+cd8+41bb+細(xì)胞的百分比的圖:av12/bv6-1(a)，av2/bv6-1(b)、av6/bv11(c)或av38/bv10-3(d)。將脈沖dcs與未轉(zhuǎn)導(dǎo)(ut)細(xì)胞(三角形)共培養(yǎng)作為對照。顯示的結(jié)果代表了兩次實(shí)驗(yàn)。

15、圖10a-10b是顯示用指示濃度(μg/ml)的最小突變的表位脈沖的t2細(xì)胞與使用以下tcr之一轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞共同培養(yǎng)后測得的ifn-γ分泌(pg/ml)(a)和4-1bb陽性細(xì)胞百分比(％，mtcrβ+)(b)的圖:av12/bv6-1(實(shí)心三角形)，av6/bv11(圓形)或av38/bv10-3(方形)。將脈沖的t2細(xì)胞與未轉(zhuǎn)導(dǎo)(ut)細(xì)胞(空心三角形)共培養(yǎng)作為對照。

16、圖11是顯示將tcr轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞與指定靶細(xì)胞系共培養(yǎng)后，檢測到的每2x104個(gè)效應(yīng)細(xì)胞的ifn-γ陽性斑點(diǎn)數(shù)的圖。用av12/bv6-1(黑色條)、av6/bv11(條紋條)或av38/bv10-3(灰色條)轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)細(xì)胞。hla-a*02:01轉(zhuǎn)導(dǎo)的靶細(xì)胞由ls123-a2、ccrf-cem-a2和au-565-a2指示。肽脈沖的靶細(xì)胞表示為(+)。未用肽脈沖的靶細(xì)胞用(-)表示。使用與靶細(xì)胞系共培養(yǎng)的未轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)細(xì)胞(無陰影條)作為對照。

17、圖12是顯示在患者4238til片段f1-f24(n＝24)與用由不相關(guān)的(irr；空心條)或突變型p53(p53-mut；黑條)序列組成的tmg電穿孔的自體apc共培養(yǎng)后，檢測到的每2x104個(gè)效應(yīng)細(xì)胞的ifn-γ陽性斑點(diǎn)數(shù)的圖。

18、圖13是顯示在患者4238til片段f1-f24(n＝24)與用肽媒介物(dmso；空心條)或突變p53-r248q(lp-p53-r248q-mut；黑條)序列組成的純化(hplc法>95％)的25個(gè)氨基酸的肽脈沖的自體apc共培養(yǎng)后，檢測到的每2x104個(gè)效應(yīng)細(xì)胞的ifn-γ陽性斑點(diǎn)數(shù)的圖。

19、圖14是顯示患者4238til片段f1-f24(n＝24)與用不相關(guān)的(irr；空心條)或突變型p53(p53-mut；黑條)序列組成的tmg電穿孔的自體apc共培養(yǎng)后，檢測到的cd8+4-1bb+細(xì)胞的百分比的圖。

20、圖15是顯示4238til片段f1-f24(n＝24)與用肽媒介物(dmso；空心條)或突變p53-r248q(lp-p53-r248q-mut；黑條)序列組成的純化(hplc法>95％)的25個(gè)氨基酸的肽脈沖的自體apc共培養(yǎng)后，檢測到的cd8+4-1bb+細(xì)胞的百分比的圖。

21、圖16是顯示在共培養(yǎng)來自患者4253的til片段(f1-f24，n＝24)與自體apc之后測量的每2x104個(gè)效應(yīng)細(xì)胞的ifn-γ-陽性點(diǎn)的數(shù)量的圖，所述自體apc(1)用肽媒介物(dmso；空條)脈沖，(2)用由突變的p53r248w(lp-p53r248w-mut；黑條)序列組成的經(jīng)純化的(>95％，通過hplc)25-個(gè)氨基酸的肽脈沖，(3)用無關(guān)tmg電穿孔(tmg-irr；灰斜線條)、或(4)含突變p53-r248w序列的p53-mut-tmg電穿孔。

22、圖17是顯示在共培養(yǎng)來自患者4273的til片段(f1-f24，n＝24)與自體apc之后測量的每2x104個(gè)效應(yīng)細(xì)胞的ifn-γ-陽性點(diǎn)的數(shù)量的圖，所述自體apc用由無關(guān)(irr；空條)、wt?p53(p53-wt；灰條)或經(jīng)突變的p53(p53-mut；黑條)序列組成的tmg電穿孔。

23、圖18是顯示在共培養(yǎng)來自患者4273的til片段(f1-f24，n＝24)與自體apc之后檢測的cd4+4-1bb+細(xì)胞的百分比的圖，所述自體apc用由無關(guān)(irr；空條)、wt?p53(p53-wt；灰條)或經(jīng)突變的p53(p53-mut；黑條)序列組成的tmg電穿孔。

24、圖19是顯示在共培養(yǎng)來自患者4273的til片段(f1-f24，n＝24)與自體apc之后測量的每2x104個(gè)效應(yīng)細(xì)胞的ifn-γ-陽性斑點(diǎn)的數(shù)量的圖，所述自體apc用肽媒介物(dmso；空條)或由wt?p53-r248序列(lp-p53-r248-wt；灰條)或經(jīng)突變的p53-r248w(lp-p53-r248w-mut；黑條)序列組成的經(jīng)純化的(>95％，通過hplc)25-個(gè)氨基酸的肽脈沖。

25、圖20顯示在共培養(yǎng)來自患者4273的til片段(f1-f24，n＝24)與自體apc之后檢測的cd4+4-1bb+細(xì)胞的百分比的圖，所述自體apc用肽媒介物(dmso；空條)或由wt?p53-r248序列(lp-p53-r248-wt；灰條)或經(jīng)突變的p53-r248w(lp-p53-r248w-mut；黑條)序列組成的經(jīng)純化的(>95％，通過hplc)25-個(gè)氨基酸的肽脈沖。

26、圖21是顯示在共培養(yǎng)來自患者4149的自體pbl(經(jīng)4149-tcra2b1或4149-tcra2b2轉(zhuǎn)座)與自體apc之后測量的每2x104個(gè)效應(yīng)細(xì)胞的ifn-γ-陽性斑點(diǎn)的數(shù)量的圖，所述自體apc(1)用由無關(guān)的(irr，右側(cè)斜線黑條)、wt?p53(p53-wt-tmg,左側(cè)斜線黑條)或經(jīng)突變的p53(p53-mut-tmg，灰條)序列組成的tmg電穿孔，或(2)用肽媒介物(dmso，空心條)或由wtp53-y220序列(lp-p53-y220-wt，水平陰影黑條)或經(jīng)突變的p53-y220c(lp-p53-y220c-mut，黑條)序列組成的經(jīng)純化的(>95％，通過hplc)25-個(gè)氨基酸的肽脈沖。佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯(pma)和離子霉素(iono)為陽性對照(灰色條)。

27、圖22是顯示在共培養(yǎng)來自患者4149的自體pbl(其用tcr(4149-tcra2b1或4149-tcra2b2)轉(zhuǎn)座)與自體apc共培養(yǎng)之后檢測的cd4+4-1bb+細(xì)胞的百分比的圖，所述自體apc(1)用由無關(guān)的(irr，右側(cè)斜線黑條)、wt?p53(p53-wt-tmg,左側(cè)斜線黑條)或經(jīng)突變的p53(p53-mut-tmg，灰條)序列組成的tmg電穿孔，或(2)用肽媒介物(dmso，空心條)或由wt?p53-y220序列(lp-p53-y220-wt，水平陰影黑條)或經(jīng)突變的p53-y220c(lp-p53-y220c-mut，黑條)序列組成的經(jīng)純化的(>95％，通過hplc)25-個(gè)氨基酸的肽脈沖。pma和iono為陽性對照(灰色條)。

28、圖23是顯示來自患者4149的til與用表f的其中一個(gè)肽脈沖的自體dc共同培養(yǎng)后檢測到的4-1bb+細(xì)胞的百分比(cd4+t細(xì)胞百分比)的圖。

29、圖24是顯示4149-tcra2b2轉(zhuǎn)座的t細(xì)胞與用單個(gè)hla等位基因+/-tmg共轉(zhuǎn)染的cos7細(xì)胞共培養(yǎng)后的ifn-γ分泌(pg/ml)的圖。未轉(zhuǎn)染tmg的細(xì)胞用p53y220c?15-mer肽脈沖。脈沖的靶細(xì)胞用陰影條表示。用無陰影條指示tmg轉(zhuǎn)染的靶細(xì)胞。

30、圖25是顯示患者4213的til片段(f2和f24)與自體apc共培養(yǎng)之后檢測的cd8+4-1bb+細(xì)胞的百分比的圖，所述自體apc用肽媒介物(dmso，空心條)或由突變的p53-r248q(lp-p53-r248q-mut；黑條)序列組成的經(jīng)純化的(>95％，通過hplc)25-個(gè)氨基酸的肽脈沖。

31、圖26是患者4213的til片段(f2和f24)與自體apc共培養(yǎng)之后測量的每2x104個(gè)效應(yīng)細(xì)胞的ifn-γ-陽性斑點(diǎn)的數(shù)量的圖，所述自體apc用肽媒介物(dmso，空心條)或由突變的p53-r248q(lp-p53-r248q-mut；黑條)序列組成的經(jīng)純化的(>95％，通過hplc)25-個(gè)氨基酸的肽脈沖。ifn-γ的分泌由空心條表示。4-1bb的表達(dá)由實(shí)心條顯示。

32、圖27是患者4268的til片段(f1-f24，n＝24)與自體apc共培養(yǎng)之后測量的每2x104個(gè)效應(yīng)細(xì)胞的ifn-γ-陽性斑點(diǎn)的數(shù)量的圖，所述自體apc用由無關(guān)的(irr，空心條)、wtp53(p53-wt,灰條)或經(jīng)突變的p53(p53-mut，黑條)序列組成的tmg電穿孔。

33、圖28是顯示患者4268的til片段(f1-f24，n＝24)與自體apc共培養(yǎng)之后測量的每2x104個(gè)效應(yīng)細(xì)胞的ifn-γ-陽性斑點(diǎn)的數(shù)量的圖，所述自體apc用肽媒介物(dmso，空心條)或由wtp53-r248序列(lp-p53-r248-wt；灰色條)或突變的p53-r248q(lp-p53-r248q-mut；黑條)序列組成的經(jīng)純化的(>95％，通過hplc)25-個(gè)氨基酸的肽脈沖。

34、圖29是顯示患者4268的til片段(f1-f24，n＝24)與自體apc共培養(yǎng)之后檢測的cd4+4-1bb+細(xì)胞的百分比的圖，所述自體apc用肽媒介物(dmso，空心條)或由wtp53-r248序列(lp-p53-r248-wt；灰色條)或突變的p53-r248q(lp-p53-r248q-mut；黑條)序列組成的經(jīng)純化的(>95％，通過hplc)25-個(gè)氨基酸的肽脈沖。

35、圖30是顯示患者4268的til片段(f1-f24，n＝24)與自體apc共培養(yǎng)之后檢測的cd8+4-1bb+細(xì)胞的百分比的圖，所述自體apc用肽媒介物(dmso，空心條)或由wtp53-r248序列(lp-p53-r248-wt；灰色條)或突變的p53-r248q(lp-p53-r248q-mut；黑條)序列組成的經(jīng)純化的(>95％，通過hplc)25-個(gè)氨基酸的肽脈沖。

36、圖31是顯示在來自患者4266的til片段(f1-f24，n＝24)與自體apc共培養(yǎng)之后測量的每2x104個(gè)效應(yīng)細(xì)胞的ifn-γ-陽性斑點(diǎn)的數(shù)量的圖，所述自體apc用由無關(guān)的(irr，空心條)、wt?p53(p53-wt，灰條)或經(jīng)突變的p53(p53-mut，黑條)序列組成的tmg電穿孔。

37、圖32是顯示在來自患者4266的til片段(f1-f24，n＝24)與自體apc共培養(yǎng)之后檢測的cd8+4-1bb+細(xì)胞的百分比的圖，所述自體apc用由無關(guān)的(irr，空心條)、wt?p53(p53-wt，灰條)或經(jīng)突變的p53(p53-mut，黑條)序列組成的tmg電穿孔。

38、圖33是顯示在來自患者4266的til片段(f1-f24，n＝24)與自體apc共培養(yǎng)之后測量的每2x104個(gè)效應(yīng)細(xì)胞的ifn-γ-陽性斑點(diǎn)的數(shù)量的圖，所述自體apc用肽媒介物(dmso，空心條)或由wtp53-r248序列(lp-p53-r248-wt；灰色條)或突變的p53-r248w(lp-p53-r248w-mut；黑條)序列組成的經(jīng)純化的(>95％，通過hplc)25-個(gè)氨基酸的肽脈沖。

39、圖34是顯示在來自患者4266的til片段(f1-f24，n＝24)與自體apc共培養(yǎng)之后檢測的cd8+4-1bb+細(xì)胞的百分比的圖，所述自體apc用肽媒介物(dmso，空心條)或由wtp53-r248序列(lp-p53-r248-wt；灰色條)或突變的p53-r248w(lp-p53-r248w-mut；黑條)序列組成的經(jīng)純化的(>95％，通過hplc)25-個(gè)氨基酸的肽脈沖。

40、圖35顯示了九種p53剪接變體的氨基酸序列的比對。sp|p04637|p53_human(seqid?no:1)；sp|p04637-2|p53_human(seq?id?no:535)；sp|p04637-3|p53_human(seq?idno:536)；sp|p04637-4|p53_human(seq?id?no:537)；sp|p04637-5|p53_human(seq?id?no:538)；sp|p04637-6|p53_human(seq?id?no:539)；sp|p04637-7|p53_human(seq?id?no:540)；sp|p04637-8|p53_human(seq?id?no:541)；和sp|p04637-9|p53_human(seq?id?no:542)。

41、圖36是顯示在與4127-o37-tcr轉(zhuǎn)導(dǎo)的t細(xì)胞與自體apc共培養(yǎng)后檢測到的4-1bb陽性細(xì)胞百分比(mtcrβ+的％)的圖，所述apc用對應(yīng)于wt(空心圓)或突變(實(shí)心方形)p53-g245s序列的濃度漸低的25個(gè)氨基酸的肽脈沖。

42、圖37a-37c是顯示在將4127-o37-tcr(a)、4127-tp31-g245s-tcr1(b)或4127-o102-tcr(c)轉(zhuǎn)導(dǎo)的t細(xì)胞與cos7細(xì)胞共同培養(yǎng)后測量的4-1bb陽性細(xì)胞百分比(mtcrβ+的％)(左y軸；斜線條)和ifn-γ(pg/ml)(右y軸；黑條)的圖，所述cos7細(xì)胞用一種所示的hla等位基因進(jìn)行共轉(zhuǎn)染并用25-氨基酸的p53-g245s肽脈沖。

43、圖38是顯示在將患者4141的til(片段培養(yǎng)物12)與自體apc共培養(yǎng)后測量的4-1bb陽性細(xì)胞百分比(％cd8+)的圖形(右y軸；黑條)和ifn-γ(斑點(diǎn)數(shù)/2x104個(gè)細(xì)胞)(左y軸；斜線條)的圖，所述apc用編碼無關(guān)突變(tmg-irr)、wtp53序列(tp53-wt-tmg)或突變p53序列(包括r175h)(tp53-mut-tmg)的tmg轉(zhuǎn)染。單獨(dú)的培養(yǎng)基以及pma和離子霉素分別為陰性和陽性對照。

44、圖39為顯示將患者4141的til(片段培養(yǎng)物12)與cos7細(xì)胞共培養(yǎng)之后測量的每2x104個(gè)效應(yīng)細(xì)胞的ifn-γ-陽性斑點(diǎn)的數(shù)量的圖，所述cos7細(xì)胞用所示的hla等位基因并無額外基因(僅hla；空心條)共轉(zhuǎn)染、或者用wt?tp53tmg(灰色陰影條)或含有p53-r175h序列的突變(黑色條)tp53?tmg共轉(zhuǎn)染。

45、圖40為顯示將表達(dá)模擬物(無tcr)或4141-tcr1a2的t細(xì)胞與t2腫瘤細(xì)胞(表達(dá)hla-a*02:01)共培養(yǎng)后測定的ifn-γ濃度(pg/ml)的圖。t2細(xì)胞用肽媒介物(dmso；灰色條)或純化(hplc法>95％)的由wt?p53-r175肽(陰影灰色條)或突變p53-r175h肽(黑色條)組成的肽脈沖。僅培養(yǎng)基(空心條)以及pma和離子霉素(格狀條)分別為陰性和陽性對照。數(shù)據(jù)為平均值±sem(n＝3)。

46、圖41是顯示將表達(dá)4141-tcr1a2的t細(xì)胞與saos2細(xì)胞(p53-null和hla-a*02:01+)共培養(yǎng)后陽性表達(dá)一種所示標(biāo)記物的細(xì)胞百分比的圖，這些細(xì)胞要么未經(jīng)處理(無陰影條)，要么被使得過度表達(dá)全長p53r-175h蛋白(陰影條)。數(shù)據(jù)為平均值±sem(n＝3)。對兩種細(xì)胞系之間的每種細(xì)胞因子進(jìn)行student雙尾t檢驗(yàn)，以進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(***p<0.001)。

47、圖42是顯示在將til(來自患者4259的片段培養(yǎng)物6)與自體apc共培養(yǎng)后檢測到的cd4+4-1bb陽性細(xì)胞的百分比的圖，所述apc或者(1)用由無關(guān)的(tmg-irr)、wt?p53(tmg-p53-wt)或經(jīng)突變的p53(tmg-p53-mut)序列組成的tmg電穿孔，或者(2)用肽媒介物(dmso)或由wtp53-y220序列(lp-p53-y220-wt)或突變的p53-y220c(lp-p53-y220c-mut)序列組成的純化的(hplc法>95％)25-氨基酸肽脈沖。

48、圖43是顯示將來自患者4259的til片段培養(yǎng)物(no.6)與自體apc共培養(yǎng)后檢測到的cd4+4-1bb陽性細(xì)胞的百分比的圖，所述apc用對應(yīng)于wt?p53序列(空心圓)或突變的p53-y220c(實(shí)心方形)的濃度逐漸降低的25-氨基酸肽在37℃下脈沖2小時(shí)。

49、圖44是顯示患者4259的til與用dmso、wtp53-y220肽或突變p53-y220c肽脈沖的自體apc共培養(yǎng)后檢測到的cd4+4-1bb陽性細(xì)胞的百分比的圖。

50、圖45是顯示將來自患者4259的til片段培養(yǎng)物(no.6)與cos7細(xì)胞共培養(yǎng)后檢測到的4-1bb陽性細(xì)胞百分比(cd4+％)的圖，所述cos7細(xì)胞用來自患者4259的所示hla等位基因共轉(zhuǎn)染，并用dmso(空心條)或p53-y220c肽(實(shí)心條)脈沖。

51、圖46是tc#4259靶細(xì)胞(內(nèi)源性表達(dá)p53y220c和hla-drb1*04:01:01)與表達(dá)模擬物(無tcr，空心條)或p53-y220c特異性tcr(4259-f6-tcr；黑條)的效應(yīng)t細(xì)胞(105)共培養(yǎng)后檢測到的4-1bb+細(xì)胞百分比的圖。將tc#4259細(xì)胞不與任何物質(zhì)孵育、或?qū)c#4259細(xì)胞與w6/32泛-hla?i類特異性阻斷抗體、iva12泛-hla?ii類特異性阻斷抗體或經(jīng)突變的p53-y220c肽孵育。單獨(dú)的培養(yǎng)基(無tc)及pma和離子霉素分別是陰性對照和陽性對照。數(shù)據(jù)是平均值±sem(n＝3)。在指定的組之間進(jìn)行學(xué)生雙尾t檢驗(yàn)用于統(tǒng)計(jì)分析(**p<0.01和***p<0.001)。

52、圖47是顯示將來自患者4285的til片段(f1-f22和f24，n＝23)與自體apc共培養(yǎng)之后檢測的每2x104個(gè)效應(yīng)細(xì)胞的ifn-γ-陽性斑點(diǎn)的數(shù)量的圖，所述自體apc用由無關(guān)的(irr，空心條)、wt?p53(p53-wt，灰條)或經(jīng)突變的p53(p53-mut，黑條)序列組成的tmg電穿孔。

53、圖48是顯示將來自患者4285的til片段(f1-f22和f24，n＝23)與自體apc共培養(yǎng)之后檢測的每2x104個(gè)效應(yīng)細(xì)胞的ifn-γ-陽性斑點(diǎn)的數(shù)量的圖，所述apc用肽媒介物(dmso；空心條)或由wtp53-r175序列(lp-p53-r175-wt；灰色條)或突變型p53-r175h(lp-p53-r175h-mut；黑條)組成的經(jīng)純化(hplc法>95％)的25個(gè)氨基酸的肽脈沖。

54、圖49是顯示將來自患者4285的til片段(f1-f22和f24，n＝23)與自體apc共培養(yǎng)之后檢測的cd4+4-1bb陽性細(xì)胞的百分比的圖，所述自體apc用由無關(guān)的(irr，空心條)、wtp53(p53-wt，灰條)或經(jīng)突變的p53(p53-mut，黑條)序列組成的tmg電穿孔。。

55、圖50是顯示將來自患者4285的til片段(f1-f22和f24，n＝23)與自體apc共培養(yǎng)之后檢測的cd4+4-1bb陽性細(xì)胞的百分比的圖，所述apc用肽媒介物(dmso；空心條)或由wtp53-r175序列(lp-p53-r175-wt；灰色條)或突變型p53-r175h(lp-p53-r175h-mut；黑條)組成的經(jīng)純化(hplc法>95％)的25個(gè)氨基酸的肽脈沖。

56、圖51是顯示在共培養(yǎng)til片段培養(yǎng)物4285-f6、4285-f9和4285-f10與cos7細(xì)胞之后檢測的4-1bb+細(xì)胞的百分比(cd4+百分比)的圖，所述cos7細(xì)胞用指定hla等位基因轉(zhuǎn)染并用dmso(肽媒介物；灰和黑斜線條)或突變的p53-r175h肽(灰、格子和黑條)脈沖。

57、圖52是顯示在共培養(yǎng)用4285-tcr1轉(zhuǎn)座的t細(xì)胞與自體apc之后檢測的4-1bb+細(xì)胞的百分比(cd4+百分比)的圖，所述自體apc用降低濃度的25-個(gè)或15-個(gè)氨基酸的肽(對應(yīng)于wt(空心環(huán)和方塊)或經(jīng)突變的(實(shí)心環(huán)和方塊)p53-r175h序列)脈沖。

58、圖53是顯示在共培養(yǎng)來自患者4266的til與cos7細(xì)胞之后檢測的4-1bb+細(xì)胞的百分比(cd8+百分比)的圖，所述cos7細(xì)胞用來自患者4266的單獨(dú)hla等位基因共轉(zhuǎn)染以及用無肽(空條)、dmso(肽媒介物；灰條)、wt?p53-r248肽(灰斜線條)或經(jīng)突變的p53-r248w肽(黑條)脈沖。數(shù)據(jù)是平均值±sem(n＝3)。

59、圖54是顯示在共培養(yǎng)表達(dá)模擬物(無tcr)、4266-tcr1、4266-tcr2、4266-tcr3或4266-tcr4的t細(xì)胞與自體apc之后檢測的4-1bb+細(xì)胞的百分比(cd8+百分比)的圖，所述自體apc用肽媒介物(dmso；灰條)或由wt?p53-r248序列(斜線灰條)或經(jīng)突變的p53-r248w(黑條)序列組成的經(jīng)純化的(>95％，通過hplc)25個(gè)氨基酸的肽脈沖。單獨(dú)的培養(yǎng)基(空條)及pma和離子霉素(格條)分別是陰性對照和陽性對照。

60、圖55是顯示在共培養(yǎng)表達(dá)模擬物(無tcr)或p53-r248w-特異性tcr(4266-tcr2、4266-tcr3或4266-tcr4)的t細(xì)胞與從由患者4266切除的異種移植的腫瘤碎片建立然后通過免疫受損小鼠(tc#4266)連續(xù)傳代的腫瘤細(xì)胞(tc)系之后檢測的4-1bb+細(xì)胞的百分比(cd8+百分比)的圖。將tc#4266細(xì)胞不與任何物質(zhì)孵育(黑條)、或?qū)c#4266細(xì)胞與w6/32泛-hla?i類特異性阻斷抗體(右側(cè)灰斜線條)、iva12泛-hla?ii類特異性阻斷抗體(灰條)或突變的p53-r248w肽(左側(cè)灰斜線條)孵育。單獨(dú)的培養(yǎng)基(無tc；空條)及pma和離子霉素(灰格條)分別是陰性對照和陽性對照。

61、圖56是顯示在來自患者4273的til與自體apc共培養(yǎng)后檢測到的cd4+4-1bb+細(xì)胞的百分比的圖，所述apc用編碼不相關(guān)突變(灰色條)、野生型p53序列(灰色斜線條)或包括p53-r248w的突變p53序列(黑色條)的tmg轉(zhuǎn)染。單獨(dú)的培養(yǎng)基(空心條)以及pma和離子霉素(格狀條)分別為陰性和陽性對照。

62、圖57是顯示患者4273的til與自體apc共培養(yǎng)后檢測到的cd4+4-1bb+細(xì)胞百分比的圖，所述apc用對應(yīng)于野生型(空心環(huán))的25個(gè)氨基酸的肽或來自p53-r248w新表位的突變(實(shí)心方形)的25個(gè)氨基酸的肽脈沖。dmso為肽媒介物。

63、圖58是顯示患者4273的til與自體apc共培養(yǎng)后檢測到的cd4+4-1bb+細(xì)胞的百分比的圖，所述apc用重疊14個(gè)氨基酸的來自p53-r248w新表位的15個(gè)氨基酸肽脈沖(以粗體表示氨基酸取代)。dmso為肽媒介物，單獨(dú)的培養(yǎng)基(僅t細(xì)胞)，以及pma和離子霉素為對照。25個(gè)氨基酸肽(wtp53-r248和突變的p53-r248w)是15個(gè)氨基酸肽的額外對照。肽為:和mnwrpiltiitleds(seq?id?no:602)。

64、圖59是顯示來自患者4273的til與cos7細(xì)胞共培養(yǎng)之后分泌的ifn-γ(pg/ml)的濃度的圖，所述cos7細(xì)胞用來自患者4273的單獨(dú)hla等位基因以及分別在有或無p53-r248w新抗原的情況下的wt(空條)或突變的(黑條)tp53?tmg共轉(zhuǎn)染。

65、圖60是顯示在表達(dá)模擬物(無tcr)或4273-tcr1a2的t細(xì)胞與自體apc的共培養(yǎng)之后測量的每2x104個(gè)細(xì)胞的ifn-γ-點(diǎn)的數(shù)量的圖，所述自體apc用肽媒介物(dmso；灰條)或由wt?p53-r248序列(斜線灰條)或經(jīng)突變的p53-r248w(黑條)序列組成的經(jīng)純化的(>95％，通過hplc)25個(gè)氨基酸的肽脈沖。單獨(dú)的培養(yǎng)基(空條)及pma和離子霉素(格條)分別是陰性對照和陽性對照。